Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose

Nhằm mục đích tăng năng suất quá trình thủy phân lignocellulose thành cácđường đơn, đường đôi từ các phế phụ phẩm nông – lâm nghiệp, để từ đó đưa vàoứng dụng rộng rãi trong sản xuất các

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Phạm Thị Huyền Nhung

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MỐC SINH ENZYME HỌ GH61

HỖ TRỢ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VŨ NGUYÊN THÀNH

Hà Nội - 2012

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Bộ môn Vi sinh, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn chỉ bảo, tạo điều kiện giúp em hoàn thành tốt công việc

Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình dạy dỗ chúng em trong suốt 2 năm học qua

Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn

bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập.

Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012

Học viên

Phạm Thị Huyền Nhung

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Thành phần lignocellulose 2

Hình 1.2: Cấu trúc cellulose: kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) và kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain) 5

Hình 1.3: O – acetyl4 – O – methyl – D – glucuronoxylan từ Hạt kín 8

Hình 1.4: Arabino – 4 – O – methylglucuronoxylan từ Hạt trần 8

Hình 1.5: Glucomannan từ Hạt kín (theo Dekker 1985) 9

Hình 1.6: O – acetylgalactoglucomannan từ Hạt trần 9

Hinh 1.7: 3 loại tiền chất để tổng hợp lignin 11

Hình 1.8: Cấu trúc hóa học của lignin 12

Hình 1.9: Phân loại enzyme glycosyl hydrolase 14

Hình 1.10 Hoạt động của enzyme GH61 15

Hình 1.11 Sản phẩm oxy hóa C1 từ glucose 16

Hình 1.12: sợi nấm và cấu trúc vách tế bào sợi nấm (Samson et al, 1995) 18

Hình 1.13: Bào tử động (theo Samson và et al, 1995) 19

Hình 1.14: Bào tử túi (b) ở Mucor circinelloides, (a) Cuống bào tử túi 19

Hình 1.15: Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus 20

Hình 1.16: Bào tử đính và cuống bào tử đính ở Penicillium chrysogenum 21

Hình 1.17 Cuống bào tử phân nhánh ở Trichoderma a T viride, b T koningii, c T polysporum, d T citrinoviride 21

Hình 1.18: bào tử đính của Fusarium eumartii 22

Hình 1.19 Bào tử đốt 23

Hình 3.1 Phổ điện di SDS – PAGE và Zymogram của các chủng FEC 514, FEC 515, FEC 516 48

Hình 3.2 Phổ điện di SDS – PAGE và Zymogram của các chủng FEC 519, FEC 523, FEC 534 49

Hình 3.3 Phổ điện di SDS – PAGE và Zymogram của các chủng FEC 544, FEC 550 50

Hình 3.4 Phổ điện di SDS – PAGE và Zymogram của các chủng FEC 551, FEC

552 51

Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 514 54

Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 519 54

Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 523 54

Hình 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 534 55

Hình 3.9 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 550 55

Hình 3.10 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của chủng FEC 551 55

Hình 3.11 Phổ fingerprinting của 19 chủng nấm mốc phân lập được 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp phổ

biến 3

Bảng 3.1 Các chủng nấm mốc phân lập được 40

Bảng 3.2 Hoạt tính xylanse của 40 chủng phân nấm mốc phân lập được 41

Bảng 3.3 Hoạt tính cellulase của 40 chủng nấm mốc phân lập được 43

Bảng 3.4 Hoạt tính enzyme xylanase và cellulase của 10 chủng nấm mốc trên 3 loại cơ chất carbon khác nhau 45

Bảng 3.5 Hàm lượng protein (µg/ml) của 10 chủng nấm mốc nuôi trên 3 môi trường carbon khác nhau 46

Bảng 3.6 Hàm lượng D – gluconic acid trong 7 chủng nấm mốc phân lập được 52

Bảng 3.7 Phân loại các chủng nấm mốc dựa vào hình thái khuẩn lạc và tế bào 56

Bảng 3.8: Kí hiệu của các chủng khi finger printing 57

Bảng 3.9 Kết quả phân nhóm 19 chủng nấm mốc bằng kĩ thuật finger printing 58

PDA: Potato Dextro Agar

PCR: Polymerase Chain Reaction

SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Lignocellulose 2

1.1.1 Cellulose 4

1.1.2 Hemicellulose 7

1.1.3 Lignin 9

1.2 Họ GH 61 (Glycoside Hydrolase 61) 12

1.2.1 Glycoside hydrolase 12

1.2.2 Họ GH 61 15

1.3 Giới thiệu chung về nấm mốc 16

1.3.1 Định nghĩa 16

1.3.2 Hình thái cấu trúc 17

1.3.3 Sinh sản của nấm mốc 18

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng 24

2.2 Hóa chất, trang thiết bị máy móc 24

2.2.1 Hóa chất 24

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị máy móc: 25

2.3 Thành phần môi trường dùng trong nghiên cứu 25

2.3.1 Môi trường Czapeck bột giấy 25

2.3.2 Môi trường PDA 26

2.3.3 Môi trường nuôi cấy tách chiết enzyme 26

2.3.4 Môi trường YM 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Phương pháp phân lập 27

2.4.2 Làm sạch giống 28

2.4.3 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào: 28

2.4.4 Tách chiết enzyme 28

2.4.5 Xác định hoạt tính cellulase (IU) bằng DNS 29

2.4.6 Xác định hoạt tính Xylanase theo phương pháp DNS 30

2.4.7 Định lượng protein theo phương pháp Lowry 32

2.4.8 Điện di protein 33

2.4.9 Phương pháp finger printing 35

2.4.10 Phương pháp phân tích D – gluconic acid 37

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả phân lập 40

3.2 Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase, xylanase bằng phương pháp DNS 41

3.3 Phân tích hoạt tính enzyme cellulase và xylanase trên 3 loại cơ chất carbon khác nhau 44

3.4 Định lượng protein bằng phương pháp Lowry 46

3.5 Phân tích thành phần protein của hệ enzyme 47

3.6 Xác định sự có mặt của enzyme GH61 bằng phân tích D – gluconic acid 52

3.7 Phân nhóm dựa vào hình thái khuẩn lạc, tế bào và kỹ thuật fingerprinting 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

MỞ ĐẦU

Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, các ngành công – nông – lâmnghiệp … cũng phát triển một cách mạnh mẽ Bên cạnh sự phát triển đó thì lượngchất thải từ các ngành này thải ra môi trường cũng ngày một nhiều, làm ô nhiễmmôi trường sống không chỉ của các sinh vật mà còn gây ảnh hưởng nghiêm trọng tớicon người Ngoài những chất thải nhân tạo khó bị phân hủy thì cũng có một số chấtthải có nguồn gốc từ sinh vật cũng rất khó bị phân hủy trong điều kiện thường haybởi các sinh vật thông thường như chintin, lignocellulose, pectin… Trong đólingocellulose là chủ yếu Sự tồn đọng của lignocellulose trong môi trường khôngnhững gây ô nhiễm môi trường mà còn làm đứt quãng chu trình tuần hoàn vật chấttrong tự nhiên Do đó việc phân giải lignocellulose có vai trò rất quan trọng khôngchỉ đối với môi trường mà còn đối với các sinh vật

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng và triển vọng sử dụng enzyme vàoviệc biến đổi sinh học các chất thải lignocellulose để tạo ra các đường đơn hữu ích

từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3] Tuy nhiên, do lignocellulose là một chất rấtkhó bị phân giải trong điều kiện thường, và chỉ có một số ít sinh vật có khả năngphân hủy chúng Bên cạnh đó, quá trình này đòi hỏi sự tham gia của rất nhiềuenzyme khác nhau đặc biệt là các enzyme trong họ Glycoside Hydrolase

Nhằm mục đích tăng năng suất quá trình thủy phân lignocellulose thành cácđường đơn, đường đôi từ các phế phụ phẩm nông – lâm nghiệp, để từ đó đưa vàoứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm có giá trị trong đời sống con người

và vật nuôi (nhiên liệu sinh học, thức ăn chăn nuôi…), chúng tôi đã thực hiện đề tài:

Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose.

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lignocellulose

Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật Thànhphần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin (Hình 1.1).Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khácnhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiềnphenylpropanoid Thành phần cấu tạo và hàm lượng của các polymer này trong thựcvật là khác nhau giữa các loài Ngoài ra, nó còn tùy thuộc vào độ tuổi, giai đoạnsinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện môi trường Thành phần củalignocellulose được trình bày ở bảng 1.1 [10]

Hình 1.1: Thành phần lignocellulose

2

Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%)

Lượng lớn lignocellulose được thải ra từ các ngành lâm nghiệp, nông nghiệp,công nghiệp giấy và gây ra ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, lượng lớn các sinh khốithực vật dư thừa được coi là rác thải có thể được biến đổi thành nhiều sản phẩm có giátrị khác nhau như nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lượng rẻ cho quá trìnhlên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho con người và thức ăn cho động vật [10]

1.1.1 Cellulose

Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức (C6H10O5)n, là một polysaccharidegồm một chuỗi tuyến tính gồm từ vài trăm đến hơn 10.000 đơn phân D – glucose nốivới nhau bởi liên kết 1,4 β - glucoside [6] [8]

Cellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào ở thực vật, nhiều loại tảo

và lớp nấm trứng (Oomycetes) Một số loài vi khuẩn chế tiết cellulose để tạo thànhmàng sinh học Cellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trên trái đất Khoảng33% khối lượng khô của thực vật là cellulose (sợi bông là 90%, gỗ là 40 -50% và câygai dầu khô là khoảng 75%) [9] [23] [24]

Khác với các carbohydrate phức tạp khác như tinh bột, glycogel có cấu trúccuộn lại hoặc phân nhánh, phân tử chính mở rộng và một cấu tạo giống hình que khácứng, cellulose có cấu trúc mạch thẳng Sự khác biệt này là do các đơn phân trongcellulose nối với nhau bằng cầu nối 1,4 β – glycoside; trong khi các carbohydrate kháclại là liên kết 1,4 α – glycoside Nhờ đặc tính này mà các phân tử cellulose dai hơn, bềnhơn, rất khó phân hủy ở điều kiện thường [2] [14]

Cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose Cácchuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kínhkhoảng 3,5 nm Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy các sợi ở cạnh nhau liênkết với nhau bằng liên kết hydro Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớnhay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có nhữngkhoảng trống lớn Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào giàthì chứa đầy lignin và hemicellulose Cellulose có nguồn gốc từ thực vật thường đượctìm thấy trong hỗn hợp với hemicellulose, lignin, pectin và các chất khác, trong khicellulose vi khuẩn là khá tinh khiết, có hàm lượng nước cao hơn nhiều [23].

Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và lực Van derWaals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình Trong vùng kếtkinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởienzyme cũng như hóa chất Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết lỏnglẻo nên dễ bị tấn công Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tảvùng kết tinh và vô định hình [4]

Hình 1.2: Cấu trúc cellulose: kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) và kiểu

chuỗi gấp khúc (Folding chain) [4]

- Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar): phân tử cellulose kéo thẳng vàđịnh hướng theo chiều dài sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 A, xếp xen kẽ vớivùng vô định hình

- Kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo chiều dàisợi Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và

b như hình vẽ Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạchglucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân Đối với các đơn vị lặp lại, haiđầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao Trong vùng

vô định hình, các liên kết β – glucoside giữa các monomer bị thay đổi góc liênkết, ngay tại cuối các đoạn gấp, ba phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi

hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β –glucoside) sẽ làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí nàykhông tạo được liên kết hydro

Nhiều tính chất của cellulose phụ thuộc vào độ dài chuỗi hoặc mức độ trùnghợp, số lượng các đơn phân glucose tạo nên phân tử polymer Cellulose từ bột gỗ có độdài chuỗi điển hình giữa 300 và 1700 đơn phân, bông và sợi thực vật khác cũng nhưcellulose vi khuẩn có độ dài chuỗi khác nhau, từ 800 đến 10.000 đơn phân [5] Cácphân tử với chiều dài chuỗi rất nhỏ là kết quả từ sự phân hủy cellulose, được gọi làcellodextrin, trái ngược với chuỗi cellulose dài, cellodextrin thường hòa tan trong nước

và dung môi hữu cơ

Một số động vật, đặc biệt là động vật nhai lại và mối, có thể tiêu hóa cellulosevới sự giúp đỡ của vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột Con người có thể tiêu hóacellulose trong chừng mực nào đó [13], tuy nhiên nó chủ yếu là hoạt động như mộtchất hỗ trợ tiêu hóa và thường được gọi là "chất xơ"

Cellulose dùng trong công nghiệp ngày nay chủ yếu được lấy từ bột giấy và bông.Chúng chủ yếu được sử dụng để sản xuất bìa và giấy, trong một phạm vi nhỏ hơn nóđược chuyển thành sản phẩm dẫn xuất như giấy bóng kính và tơ nhân tạo Chuyển đổicellulose từ cây trồng nhiên liệu vào nhiên liệu sinh học như ethanol cellulosic đangđược nghiên cứu như là một nguồn nhiên liệu thay thế.

1.1.2 Hemicellulose

Hemicellulose là một polymer carbohydrate phức tạp và chiếm 25-30% tổng trọnglượng khô gỗ Nó là một polysaccharide với trọng lượng phân tử thấp hơn cellulose[12] Nó thường được tìm thấy trong liên kết với cellulose trong thành tế bào thứ cấpcủa thực vật, nhưng chúng cũng có mặt trong thành tế bào sơ cấp [19]

Hemicellulose là thuật ngữ chỉ một nhóm các homo - và heteropolymer bao gồmcác đơn phân chính: D – xylose, D – mannose, D – galactose, D – glucose, và cácnhóm thế: L – arabinose, acid 4 – O – methyl – glucuronic, D – galacturonic và D –glucuronic Các phân tử đường liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 β và đôi khi là 1,3 β– glycoside Sự khác biệt chính với cellulose là hemicellulose có phân nhánh với chuỗibên ngắn gồm các loại đường khác nhau; do đó, chúng dễ bị thủy phân hơn so vớicellulose [12]

Thành phần chính của hemicellulose trong gỗ cứng là glucuronoxylan và trong gỗmềm là Glucomannan Glucuronoxylan trong gỗ cứng và thực vật thân thảo gồm mạchchính là 1,4 β – D – xylan với nhóm thế 1,2 α – 4 – O – methyl – D – giucuronic acid(hoặc 1,2 α – D – glucuronic acid), chiếm khoảng 10% dư lượng xylose (Hình 1.3).Xylan trong trong gỗ mềm và thực vật thân thảo khác với xylan trong gỗ cứng ở chỗchúng có arabinofuranose liên kết với mạch chính xylan bằng liên kết 1,3 α (Hình 1.4)[20]

Hình 1.3: O – acetyl4 – O – methyl – D – glucuronoxylan từ Hạt kín

(theo Dekker 1985)

Hình 1.4: Arabino – 4 – O – methylglucuronoxylan từ Hạt trần

(theo Dekker 1985)Các glucomannoxylan (thường được gọi là glucomannan và galactomannan)được cấu thành từ 1,4 β – D – glucose và β – D – mannose dư lượng trong mạch thẳng(Hình 1.5) Glucomannan trong gỗ cứng chứa liên kết 1,4 β giữa glucose và mannosehình thành chuỗi nhánh nhỏ Tỷ lệ mannose: glucose là khoảng 1.5 : 1 hoặc 2 : 1 tronghầu hết các cây gỗ cứng Glucomannan trong gỗ mềm đôi khi có các nhánh phụgalactose liên kết với mannose mạch chính bằng 1,6 α (Hình 1.6) Các liên kết 1,6 αcủa galactose là rất nhạy cảm với acid và kiềm và có thể phân cắt trong môi trườngkiềm (Timell 1965) Các xylan trong gỗ mềm và hầu hết thực vật thân thảo đều có mộtphân tử L – arabinofuranosyl gắn vào thông qua liên kết với một số vị trí O – 3 củamạch chính (Wilkie 1979) Khoảng 60% đến 70% xylose của xylan trong gỗ cứng

được acetyl hóa bằng liên kết ester ở vị trí 2 hoặc 3 Xylan trong thực vật thân cỏ vàgalactomannan trong gỗ mềm cũng được acetyl hóa, mặc dù mức độ thấp hơn(Lindberg et al, 1973 a, b) [20]

Hình 1.5: Glucomannan từ Hạt kín (theo Dekker 1985)

Hình 1.6: O – acetylgalactoglucomannan từ Hạt trần (theo Dekker 1985)

1.1.3 Lignin

Lignin hoặc lignen là một hợp chất hóa học phức tạp phổ biến nhất trong gỗ, và

là một phần không tách rời của thành tế bào thứ cấp ở thực vật [15] và một số loài tảo[16] Thuật ngữ này được giới thiệu vào năm 1819 bởi de Candolle và có nguồn gốc từtiếng Latin: lignum, [8] có nghĩa là gỗ Đây là một trong những polymer hữu cơ phongphú nhất trên trái đất, chỉ sau cellulose, nó chiếm 30% carbon hữu cơ phi hóa thạch,

[22] và từ 1/4 tới 1/3 khối lượng khô của gỗ [25] Hàm lượng lignin trong gỗ thay đổi

không những phụ thuộc vào loài cây mà còn phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện địa lý.

Ví dụ, trong cây lá kim chứa khoảng 20 – 30%, cây lá rộng 20 – 25%, trong khi cỏ là 5– 9% [20]

Lignin được tìm thấy ở tế bào thực vật bậc cao (hạt kín và hạt trần), Dương xỉ

và cây Thạch tùng Đặc biệt lignin chiếm tỷ lệ cao ở những mô mạch được chuyên hóa

để vận chuyển chất lỏng Lignin không được tìm thấy ở rêu, địa y và tảo – là các loạithực vật không có quản bào [25]

Lignin là hợp chất raxemic với khối lượng phân tử lớn, có đặc tính thơm và kịnước Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và tan trong acid vô cơ[16] Nghiên cứu xác định độ trùng hợp của lignin, người ta thấy có sự phân đoạn trongquá trình tách chiết và phân tử có chứa nhiều loại tiền chất xuất hiện lặp đi lặp lại mộtcách ngẫu nhiên trong đó chủ yếu là tại các mắt xích và nhiều nhất là dẫn xuất củaphenylpropan [15]

Thành phần của lignin gồm 62 – 65 % carbon, 5 – 6% hydro, nhiều nhóm

các tiền chất phenylpropanoid Có 3 loại tiền chất được phân loại tùy theo số lượngnhóm methoxyl trên vòng thơm; gồm: coniferyl alcohol (guaiacyl propanol), coumarylalcohol (p-hydroxyphenyl propanol), và sinapyl alcohol (syringyl propanol) được miêu

tả bằng công thức hóa học sau [16]

Hinh 1.7: 3 loại tiền chất để tổng hợp lignin

Coniferyl alcohol là thành phần chính của lignin gỗ mềm, trong khi đó guaiacyl

và syringyl alcohol là thành phần chính của lignin gỗ cứng [22]

Lignin gỗ mềm (hạt trần) bao gồm cấu trúc chủ yếu bắt nguồn từ rượu coniferyl,một ít từ β – coumaryl, không có sinapyl Lignin gỗ cứng (hạt kín) chứa số lượng cânbằng coniferyl và sinapyl (46%) và một lượng nhỏ (8%) coniferyl β –hydroxylferylpropan (có nguồn gốc từ rượu coumaryl) Lignin cỏ là hợp chất củaconiferyl, sinapyl và β – hydroxyphenylpropan với coumaric acid (5 – 10%), chủ yếu làester và nhóm hydroxyl tận cùng của rượu β – coumaryl [22]

Hình 1.8: Cấu trúc hóa học của lignin

1.2 Họ GH 61 ( Glycoside Hydrolase 61)

1.2.1 Glycoside hydrolase

Glycoside hydrolase (còn gọi là glycosidase hoặc glycosyl hydrolase) xúc táccho phản ứng thủy phân các liên kết glycoside để tạo thành các phân tử đường nhỏhơn Chúng là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, có vai trò như phân giải sinh khốisinh vật (cellulose và hemicellulose), phòng chống vi khuẩn (ví dụ, lysozyme), trong

cơ chế sinh bệnh (ví dụ, neuraminidase trong virus) và chức năng khác trong tế bào (ví

dụ, mannosidase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp liên kết N- glycoprotein) Cùngvới glycosyltransferase, glycosidase tạo thành bộ đôi xúc tác cho sự tổng hợp và phá

vỡ liên kết glycoside [24]

Glycoside hydrolase được tìm thấy trong tất cả các sinh vật sống Ở sinh vậtnhân sơ, chúng được tìm thấy ở cả enzym nội bào lẫn enzyme ngoại bào, chúng chủyếu tham gia vào việc hấp thu dinh dưỡng Một trong những enzyme quan trọng củaglycoside hydrolase ở vi khuẩn là enzyme β – galactosidase (lacZ), tham gia vào quá

trình điều hòa biểu hiện gen của operon lac ở E coli Sinh vật bậc cao, glycoside

hydrolase được tìm thấy trong lưới nội chất và bộ máy Golgi nơi chúng được gắn thêmliên kết N-glycoprotein, và trong lysosome Sự thiếu hụt glycoside hydrolase tronglysosome có thể dẫn đến một loạt các rối loạn dự trữ từ đó có thể ảnh hưởng đến sựphát triển hoặc gây tử vong cho sinh vật Các glycoside hydrolase được tìm thấy trongđường ruột và trong nước bọt có thể phân giải các carbohydrate phức tạp như lactose,tinh bột, sucrose và trehalose Trong ruột, chúng được tìm thấy như enzyme bámglycosylphosphatidyl trên tế bào nội mô Enzyme lactase cần thiết cho sự phân giảilactose sữa Enzyme O – GlcNAcase liên quan đến việc loại bỏ các nhóm N-acetylglucoamine từ serine và threonine thừa trong tế bào chất và nhân tế bào.Glycoside hydrolase còn tham gia vào quá trình sinh tổng hợp và phân giải glycogentrong cơ thể [18]

Glycoside hydrolase được phân thành nhóm EC 3.2.1 là enzyme xúc tác thủyphân của O- hoặc S-glycoside Glycoside hydrolase cũng có thể được phân loại, theo

cấu trúc hóa học lập thể của phản ứng thủy phân, do đó chúng có thể được phân loạithành enzym giữ nguyên hoặc đảo nghịch (hình 1.9 a) Chúng cũng có thể được phânloại như exo hoặc endo, phụ thuộc vào hoạt động của chúng tại vị trí đầu hoặc giữa củachuỗi oligo / polysaccharide Hoặc chúng cũng có thể được phân loại dựa trên cácphương pháp phân tích trình tự hoặc cấu trúc [23].

a.

b.

Hình 1.9: Phân loại enzyme glycosyl hydrolase

a)Theo cấu trúc hóa học lập thể của phản ứngb)Theo exo/endo

1.2.2 Họ GH 61

Trong số các họ glycoside hydrolase xúc tác thủy phân cellulose và

hemicellulose, thì vai trò chức năng của họ 61 (GH61) vẫn còn nhiều điều chưa được

làm sáng tỏ cho đến gần đây Đặc tính của GH61 protein được mô tả đầu tiên vào năm

1992 Ban đầu họ glycoside hydrolase 61 được phân loại dựa vào việc đo lường hoạtđộng của endo-1,4-β-D-glucanase của một số thành viên trong họ mặc dù hoạt độngcủa enzyme này là rất yếu

Khác với các enzyme GH khác, enzyme họ GH61 không có khả năng thủyphân liên kết glycoside hoặc rất yếu [17], vai trò chính của nó là oxy hóa cellulose tạo

ra các đầu hở, tạo điều kiện cho các enzyme cellulase bám vào hoạt động [7]

Hình 1.10 Hoạt động của enzyme GH61

Mặc dù mô hình cơ chế hoạt động cuối cùng của các enzyme họ GH61 vẫn chưađược tìm thấy, song một số tính năng phổ biến của chúng có thể được tổng quát nhưsau [7]:

 GH61 là Metallo-enzyme tức là enzyme cần một ion kim loại hóa trị hai đểhoạt động, và đồng thời là ion kim loại điều phối hoạt động của trung tâmphản ứng.

GH61s đều cần một chất đồng yếu tố ở dạng khử, hoạt động như chất chođiện tử từ bên ngoài: gallate, ascorbate, và CDH enzyme (thường được kiểmsoát và biểu hiện cùng với GH61s) để tăng cường hoạt động của GH61s Mặc dù quá trình oxy hóa có thể diễn ra tại các vị trí carbon khác nhau trongcấu trúc vòng glucose (C1, C4 hoặc C6), tuy nhiên oxy hóa C1 (aldonic) cellodextrines

là phổ biến nhất

Hình 1.11 Sản phẩm oxy hóa C1 từ glucose

1.3 Giới thiệu chung về nấm mốc [1]

1.3.1 Định nghĩa

Nấm mốc là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản (thalophyte), tế bào không có diệplục, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào được cấu tạo chủ yếu làchitin, có hoặc không có cellulose Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi các bào tử

do nó sinh ra như màu xanh, vàng, trắng, đen, nâu…

Nhiều loài nấm mốc có khả năng ký sinh trên động vật, thực vật, và trên conngười Một số chúng là tác nhân gây bệnh, làm hư hại lương thực, thực phẩm và các đồdùng, thiết bị Tuy nhiên cũng có nhiều loài có lợi cho con người nhờ khả năng tổnghợp acid hữu cơ, chất kháng sinh, vitamin… hay kích thích tố giúp tăng trưởng ở thựcvật…

1.3.2 Hình thái cấu trúc

Nấm mốc có dạng sợi, phân nhánh hoặc không phân nhánh, cấu tạo đơn bào

hoặc đa bào Sợi nấm có vách ngăn (đa bào) như nấm bậc cao (Ascomycytes, Basicdiomycetes) hay không có vách ngăn (đơn bào) như nấm bậc thấp (Oomyctes, Zygomycetes) hoặc hình ống có nhiều nhân gọi là sợi cộng bào.

Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùyloài Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm.Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet Các sợi nấm phát triển chiều dàitheo kiểu tăng trưởng ở ngọn (Hình 1.12) Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh

có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì nhưbông Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bàonấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhấtđịnh gọi là khuẩn lạc nấm

Hình 1.12: sợi nấm và cấu trúc vách tế bào sợi nấm (Samson et al, 1995)

Một bào tử rơi xuống gặp môi trường thuận lợi sẽ nảy mầm tạo khuẩn lạc Sợinấm hút thức ăn làm nhiệm vụ nuôi dưỡng gọi là khuẩn ty cơ chất Sợi mang cuốngbào tử làm nhiệm vụ sinh sản gọi là khuẩn ty khí sinh

1.3.3 Sinh sản của nấm mốc

Nói chung, nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính Trong sinhsản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinhsản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái

a. Sinh sản vô tính

The Alexopoulos và Mims (1979), nấm mốc sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng:sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sảnbằng các loại bào tử Một số dạng bào tử của nấm mốc:

Bào tử túi (bào tử bọc) (sporangiospores): các bào tử động (zoospores) (Hình

1.13 a, b, c) có ở nấm Saprolegnia và bào tử túi (sporangiopores) ở nấm Mucor, Rhizopus (Hình 1.14) chứa trong túi bào tử động (zoosporangium) và túi bào tử

(sporangium) được mang bỡi cuống túi bào tử (sporangiophores)

Hình 1.13: Bào tử động (theo Samson và et al, 1995)

Hình 1.14: Bào tử túi (b) ở Mucor circinelloides, (a) Cuống bào tử túi

(theo Samson và et al, 1995)

Bào tử đính (conidium): các bào tử đính không có túi bao bọc ở giống nấm

Aspergillus, Penicillium Hình dạng, kích thước, màu sắc, cách trang trí và sắp xếp

của bào tử đính thay đổi từ giống này sang giống khác và được dùng làm tiêu chuẩn đểphân loại nấm

Cuống bào tử đính dạng bình có thể không phân nhánh như ở Aspergillus (Hình 1.15) hay dạng thẻ phân nhánh như ở Penicillium (Hình1.16) Bào tử đính hình thành

từ những cụm (cluster) trên những cuống bào tử đính ở Trichoderma (Hình 1.17).

Hình 1.15: Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus a 1 lớp, b 2 lớp, c phiến, d.

tia, e tể (theo Samson và et al, 1995)

Hình 1.16: Bào tử đính và cuống bào tử đính ở Penicillium chrysogenum (theo Samson

và et al, 1995)

Hình 1.17 Cuống bào tử phân nhánh ở Trichoderma a T viride, b T koningii, c T.

polysporum, d T citrinoviride (theo Samson và cs, 1995)

Ở Microsporum và Fusarium, có hai loại bào tử đính: loại nhỏ, đồng nhất gọi là

tiểu bào tử đính (microconidia) (Hình 1.18 a), loại lớn, đa dạng gọi là đại bào tử đính(macroconidia) (Hình 1.18 b)

Hình 1.18: bào tử đính của Fusarium eumartii (theo Von Arx, 1995)

Bào tử tản (Thallospores): trong nhiều loài nấm men và nấm mốc có hình

thức sinh sản đặc biệt gọi là bào tử tản Bào tử tản có thể có những loại sau:

tử tản đơn giản nhất, gọi là bào tử chồi (blastospores)

vách dầy còn gọi là bào tử áo (chlamydospores) (Hình 1 18 c) Vị trí của bào tửvách dầy ở sợi nấm có thể khác nhau tùy loài

bào vách dầy gọi là bào tử đốt (arthrospores) (Hình 1.19)

Hình 1.19 Bào tử đốt (theo Samson và cs 1995)

Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes)

có trải qua giai đoạn giảm phân Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn:

- Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội (haploid)qua sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội)

- Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hòa hợp 2 tế bào trần(protoplast) của 2 giao tử

- Tiếp hợp nhân (karyogamy) với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử đểtạo một nhân nhị bội (diploid)

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 40 chủng nấm mốc phân lập được từ các mẫu:cây mục, lá mục, gỗ mục và mẫu đất… từ các khu vực khác nhau như: Hà Nội, HưngYên và Tuy Hòa

2.2 Hóa chất, trang thiết bị máy móc

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là các hóa chất tinh khiết vàchuyên dụng Các hóa chất dùng cho sinh học phân tử phần lớn có nguồn gốc từ cáchãng: Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Difico (Mỹ), Invitrogen (Mỹ), Fermentas (Đức),Roth (Đức) Các hóa chất dùng cho nuôi cấy, phân tích có nguồn gốc từ Thụy Điển,Trung Quốc, Việt Nam

Hóa chất dùng cho nuôi cấy: Agar, Glucose, Yeast extract, Peptone, Malt, Malt

extraclt

Hóa chất dùng cho chiết enzyme và thử hoạt tính: Ammonium sulfate, Urea,

Potassium dihydrogen phosphate, Calcium chloride, Magnesium sulfate heptahydrate,Cobalt (II) chloride hexahydrate, Tween 80, Cacboxyl metyl cellulose, Congo red

Hóa chất dùng cho phân tích: 3,5 dinitrosalicylic acid, Sodium hydroxide,

Sodium potassium tartrate, Phenol tinh thể, Sodium metabisulfite, Citric acidmonohydrate, Glucose

Hóa chất dùng cho điện di protein: Acrylamide, Tris-base, Amonium persulfate,

Glycine, Methanol, N’N-bis-methylene-acrylamidde, Clohydric acid, Sodium dodecylsulfate, Acetic acid

Hóa chất dùng cho tách chiết và tinh chế DNA: dd SSC 2x, nước cất 2 lần thanh

trùng, dd phenol: chloroform (1:1), Kit Silica Bead DNA Gel Extraction (Silica powdersuspension, TBE conversion buffer, Concentrated Washing buffer, Binding buffer)

Hóa chất dùng cho PCR: Enzym Taq AND Polymease, dNTPs, thang AND

mẫu dùng trong điện di, Agarose dùng trong điện di, Ethidium Bromide để nhuộm gen

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị máy móc:

Máy móc, thiết bị: bộ điện din gang (Pharmcia Biotech, Gibico), box cấy(BioblockScientific-Pháp), cân điện tử (Precisa- Thụy Điển), kính hiển vi quang học(Eclipse E600- Nikon- Nhật), lò vi song (LG-Hàn Quốc), máy chụp ảnh gel(Olympus), máy đo pH (Toledo- Anh), máy lắc ồn nhiệt (Eppendorf- Đức), máy li tâmcao tốc (Heraeus- Sepatech), máy PCR (PE-GeneAmp PCR System 9700), máy soi gel(Benchtop UV-Transilluminator VWR), Nồi hấp thanh trùng (Himayatoko-Nhật), máyphá tế bào (Mini Beadbeater-Biospec Products), …

Dụng cụ: Đĩa petri, pipette tự động các loại, ống Falcon, ống nghiệm, ốngEppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20 – 1000), bình schott, que cấy,

…

2.3 Thành phần môi trường dùng trong nghiên cứu

2.3.1 Môi trường Czapeck bột giấy

Thành phần

Tác dụng: dùng làm môi trường phân lập chọn lọc nấm mốc

2.3.2 Môi trường PDA

Thành phần (1000 ml): Glucose (1%), agar (2%), dịch chiết khoai tây

Dịch chiết khoai tây: 300kg khoai tây đã gọt vỏ, rửa sạch, thái chỉ 50x50x5mmninh sôi với khoảng 1,5 lít nước máy trong 1 giờ, sau đó lọc bỏ bã lấy đúng 1 lít dịchchiết

Tác dụng: dùng làm môi trường sạch giống đã được phân lập được

2.3.3 Môi trường nuôi cấy tách chiết enzyme

 Bã mía : cám gạo : bã malt = 1 : 1 : 1

Tác dụng: làm môi trường nuôi giống trước khi PCR

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân lập

Các loại mẫu được lấy ở các địa điểm và thời gian khác nhau Các mẫu có chứanấm mốc được pha loãng trong dung dịch muối NaCl 0.9% Sau đó nấm mốc đượcphân lập trên môi trường Czapeck bột giấy

Quy trình tiến hành phân lập như sau:

- Mẫu lấy về cắt nhỏ ở điều kiện vô trùng rồi được pha loãng bằng dung dịchnước muối NaCl 0.9% có trong ống nghiệm, đậy nắp và vortex đều

- Dùng pipet hút 100 µl dịch mẫu vào đĩa petri sau đó đổ môi trường Czapeck bột

giấy lên trên Lắc đều cho hỗn hợp môi trường – mẫu đồng nhất

- Khi đĩa thạch chuyển sang thể rắn, đổ them một lớp mỏng agar lên trên bề mặtđĩa

- Nuôi cấy ở tủ nuôi cấy 30oC trong 7 ngày

- Sau khi nuôi 7 ngày mang các đĩa peptri ra quan sát Các khuẩn lạc mốc đượcnhặt ra, làm sạch và giữ giống

2.4.2 Làm sạch giống

Sau khi quan sát các khuẩn lạc trên đĩa thạch phân lập, mỗi đĩa thạch sẽ có mộthoặc nhiều khuẩn lạc mốc khác nhau về hình dạng, màu sắc và kích thước Lấy mỗiloại một vòng que cấy nấm mốc cần làm sạch và cấy ria lên một đĩa petri chứa môi

làm sạch 2-3 lần đến khi thu được chủng nấm mốc tinh sạch

2.4.3 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào:

- 5 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc Làm tiêu bản vàquan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 40x

2.4.4 Tách chiết enzyme

Các chủng nấm mốc phân lập được nuôi cấy trên ống thạch nghiêng PDA trongvòng 3 - 5 ngày cho bào tử mọc dầy Dùng pipet hút 3000µl Tween vào ống, vortexcho đều Hút một lượng dịch nhất định trên cho sang bình tam giác chứa môi trườngthử hoạt tính sao cho lượng bào tử trong mỗi bình đạt nồng độ 5 x 105 bào tử / ml môitrường Nuôi lắc ở 170 rpm, nhiệt độ 30oC trong vòng 7 ngày

Tùy vào thí nghiệm mà có thể chiết enzyme sau 4, 6, 7, 8, hay 10 ngày nuôi lắcbằng cách ly tâm lạnh ở 40C, 8000 rpm trong vòng 10 phút.

2.4.5 Xác định hoạt tính cellulase (IU) bằng DNS

Cơ chất: giấy lọc được cắt bằng thiết bị đục giấy, mỗi mảnh khoảng 2.22 mg.Enzyme được pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng đệm Na-citrate 0.05 M pH 4.8

Mẫu thí nghiệm :

Na-citrate 0.05 M pH 4.8 để dung dịch đệm thấm ướt hoàn toàn mảnh giấy, giữ

50oC trong 5 phút

Mẫu đối chứng thí nghiệm : Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm tuy nhiên

ở bước 2 dịch enzyme đã bất hoạt (đun sôi enzyme trong 5 – 10 phút)

Mẫu blank: Cho vào eppendof 0.3 ml đệm Na – citrate 0.05 M pH 4.8 Gia nhiệt

ở 50oC trong 60 phút Làm tiếp giống mẫu thí nghiệm từ bước 3- 5

Mẫu đối chứng dương: (dùng enzyme thương phẩm) phân tích 1 mẫu Novozym

50013 pha loãng tới 500 – 1000 lần

Hoạt tính cellulose (IU/ml) được tính bằng số µmol D – glucose tạo ra khi thủyphân giấy lọc trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 4.8, nhiệt độ 50oC.

IU = (y1 -y0)*D*0.3/0.18*60*0.1 = a*(x1 - x0)*D*0.278

y1: Nồng độ D -glucose của mẫu thí nghiệm (mg)y0: Nồng độ D -glucose của mẫu đối chứng (mg)x1: OD của mẫu thí nghiệm

x0: OD của mẫu đối chứngD: hệ số pha loãng

a: hệ số của đường chuẩn y = ax + b0.18: 180/1000 của đường D - glucose khan60: thời gian phản ứng (phút)

0.3: tổng thể tích enzyme + cơ chất (ml)0.1: thể tích enzyme tham gia phản ứng (ml)

2.4.6 Xác định hoạt tính Xylanase theo phương pháp DNS

citrate 0.05 M pH 4.8 thanh trùng 121oC trong 20 phút , bảo quản ở 4 oC Enzyme đượcpha loãng tới nồng độ thích hợp bằng đệm Natri – citrate 0.05 M pH 4.8

Mẫu thí nghiệm:

 Hút 0.2 ml cơ chất vào eppendorf, giữ ở 50 oC trong 5 phút

 Bổ sung 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỷ lệ thích hợp), choenzyme phản ứng với cơ chất ở 50 oC trong 20 phút

 Bổ sung 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng Phản ứng màu ở 100 oC trong 5 phút,làm lạnh nhanh bằng nước đá.

0.9 ml nước cất

Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm, tuy nhiên

ở bước 2 dịch enzyme bị bất hoạt (enzyme được gia nhiệt ở 100 oC trong 10 phút)

Mẫu blank: cho vào eppendorf 0.3 ml đệm Natri – citrate 0.05 M pH 4.8 Gia

nhiệtở 50 oC trong 60 phút Làm tiếp giống mẫu thí nghiệm từ bước 3 đến bước 5

Mẫu đối chứng dương: Phân tích 1 mẫu enzyme thương phẩm.

Hoạt tính xylanase (IU/ml) được tính bằng số µmol D – xylose tạo ra khi thuỷphân xylan trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 4.8, nhiệt độ 50 oC

IU = (y1 -y0)*D*0.3/0.15*20*0.1 = a*(x1 - x0)*D

y1: Nồng độ xylose của mẫu thí nghiệm (mg)y0: Nồng độ xylose của mẫu đối chứng (mg)x1: OD của mẫu thí nghiệm

x0: OD của mẫu đối chứngD: hệ số pha loãng

a: hệ số của đường chuẩn y = ax + b0.15: 150/1000 của đường D - xylose khan20: thời gian phản ứng (phút)

0.3: tổng thể tích enzyme + cơ chất (ml)0.1: thể tích enzyme tham gia phản ứng (ml)

2.4.7 Định lượng protein theo phương pháp Lowry

Nguyên tắc: Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan Hàm lượngcủa những acid amin này tùy thuộc vào loại protein Vì vậy, những protein cùng mộtloại với nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau

Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu.Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan (cũng là hàmlượng protein) Vì thế, có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein

Chuẩn bị:

- Dung dịch C: chuẩn bị trước khi làm thí nghiệm bằng cách pha dung dịch A vàdung dịch B với nhau theo tỷ lệ 50 : 1

- Thuốc thử Folin – ciocalteu : nước cất theo tỷ lệ 1 : 1

Tiến hành:

- Bước 1: Hút 0.2 ml dịch chiết enzyme (pha loãng vơi tỷ lệ thích hợp) và 1mldung dịch C vào eppendorf

- Bước 2: mix đều hỗn hợp và để 10 phút ở nhiệt độ phòng

- Bước 3: Bổ sung 0.1 ml folin – ciocalteu

- Bước 4: mix đều, để nhiệt độ phòng trong 30 phút

- Bước 5: Đo OD ở bước sóng 660 nm

Mẫu Blank: Cho vào eppendorf 0.2 ml nước cất và 1 ml dung dịch C, sau đótiến hành các bước tương tự như mẫu thí nghiệm