Phân lập và tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp chitinase để kiểm soát rệp muội hại cây trồng

Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *** VŨ THỊ THANH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM KÝ SINH CƠN TRÙNG CĨ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP MUỘI HẠI CÂY TRỒNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2013 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *** VŨ THỊ THANH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM KÝ SINH CƠN TRÙNG CĨ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP MUỘI HẠI CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Khoa học môi trường Mã số: 60440301 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội - 2013 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Luận văn phần nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm từ nấm Lecanicillium spp để diệt rệp muội (Aphididae) gây hại trồng” TS Vũ Văn Hạnh làm chủ nhiệm đề tài, hỗ trợ Chương trình trọng điểm phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực nông nghiệp phát triển nông thôn đến năm 2020, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, 2010-2013 Tác giả Vũ Thị Thanh Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh Lời cảm ơn! Trước hết xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu trình học tập thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới tồn thể cán nhân viên Phòng Cơng nghệ Sinh học Mơi trường Phòng Các chất chức Sinh học, đặc biệt TS Vũ Văn Hạnh – chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm từ nấm Lecanicillium spp để diệt rệp muội (Aphididae) gây hại trồng” định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, tạo điều kiện vật tư, hóa chất, thiết bị bảo tận tình q trình tơi thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm môn Công nghệ môi trường, thầy cô Khoa Môi trường, trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để tơi hồn thành luận văn Với lòng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu ! Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rệp muội hại trồng 1.1.1 Đặc điểm sinh học rệp muội hại trồng 1.1.2 Tình hình rệp muội hại trồng giới Việt Nam 1.2 Thuốc diệt trùng có nguồn gốc sinh học .8 1.2.1 Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng giới 1.2.2 Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng Việt Nam 11 1.3 Nấm ký sinh côn trùng .12 1.4 Hệ enzyme chitinase từ nấm sợi 14 1.4.1 Định nghĩa 14 1.4.2 Cấu trúc chitinase .14 1.4.3 Cơ chế hoạt động chitinase 16 1.4.4 Cơ chất cảm ứng chitinase 18 1.4.5 Các nguồn thu nhận chitinase 19 1.4.6 Ứng dụng chitinase .20 1.5 Công nghệ lên men lỏng lên men xốp 20 1.6 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả sinh tổng hợp chitinase 22 1.6.1 Nguồn carbon 22 1.6.2 Nguồn nitơ 22 1.6.3 Độ ẩm chất 23 1.6.4 Nhiệt độ nuôi cấy .23 1.6.5 pH môi trường 24 1.6.6 Cơ chất .24 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị sử dụng 26 2.1.1 Nguyên liệu 26 2.1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Phương pháp phân lập nấm 28 2.2.2.Sàng lọc chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp hại ngơ cao 29 2.2.3 Chọn lọc chủng nấm ký sinh trùng có hoạt tính chitinase cao 30 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh 2.2.4 Xác định hoạt tính chitinase chủng nấm ký sinh trùng 31 2.2.5 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng nấm có độc lực diệt rệp hại ngô cao 32 2.2.6 Phương pháp phân loại nấm sợi dựa vào xác định so sánh trình tự gen mã hóa 18S rRNA .33 2.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố môi trường lên khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm lựa chọn 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm ký sinh trùng có độc lực diệt rệp muội hại ngô cao .38 3.2 Tuyển chọn chủng nấm có khả sinh tổng hợp chitinase cao .41 3.3 Hình thái khuẩn lạc hình thái bào tử chủng nấm NM4 42 3.4 Xác định trình tự gene mã hóa 18S rRNA chủng NM4 43 3.4.1 Tách chiết DNA tổng số chủng nấm NM4 43 3.4.2 Nhân đoạn gene 18S rRNA chủng NM4 .44 3.5 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả sinh tổng hợp chitinase nấm Penicillium sp M4 46 3.5.1 Ảnh hưởng nguồn chất 46 3.5.2 Ảnh hưởng độ dày chất 48 3.5.3 Ảnh hưởng độ ẩm chất 48 3.5.4 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 49 3.5.5 Ảnh hưởng nhiệt độ .51 3.5.6 Ảnh hưởng pH môi trường lên men 51 3.5.7 Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô 52 3.5.8 Ảnh hưởng thời gian lên men 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC THÔNG TIN CỦA CHỦNG NẤM PENICILLIUM SP M4 TRÊN NGÂN HÀNG GEN NCBI 70 PHỤ LỤC 3: CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN TỚI 71 LUẬN VĂN 71 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng phòng thí nghiệm 38 Bảng 2.2 Các loại môi trường 38 Bảng 3.1 Các chủng nấm phân lập môi trường PDA 38 Bảng 3.2 Hoạt tính chitinase hai chủng nấm NM3 NM4 42 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ mơi trường Vũ Thị Thanh DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu tạo ngồi rệp Hình 1.2 Rệp ngô Aphis maydis Hình 1.3 Cấu trúc không gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 (A) Glycohydrolase 19 (B) 15 Hình 1.4 Cơ chế hoạt động enzyme chitinase 16 Hình 1.5 Cấu tạo hóa học chitin 18 Hình 2.1 Đường chuẩn N-acetyl-β-D-glucosamine 31 Hình 3.1 Kết phun bào tử nấm lên rệp ngơ .39 Hình 3.2 Độc lực diệt rệp chủng nấm .40 Hình 3.3 Hoạt tính chitinase hai chủng nấm NM3 NM4 41 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc (A, B), hình thái bào tử (C) chủng nấm NM4…42 Hình 3.5 DNA tổng số chủng nấm NM4 43 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm nhân đoạn gene mã hóa 18S rRNA chủng NM4 44 Hình 3.7 Trình tự đoạn gene 18S rRNA chủng nấm NM4 .45 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại chủng nấm NM4 45 Hình 3.9 Ảnh hưởng nguồn chất đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 47 Hình 3.10 Khả phát triển chủng nấm Penicillium sp M4 nguồn chất khác sau ngày lên men rắn 47 Hình 3.11 Ảnh hưởng độ dày chất (A), độ ẩm chất (B) đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 .49 Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng độ chất chitin đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 50 Hình 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ (A), pH (B) đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 .51 Hình 3.14 Ảnh hưởng nguồn nitơ vô (A), nồng độ urê (B) đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 53 Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 54 Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pair (cặp bazơ) cm, mm, nm : Centimeters, millimeters, nanometers DNA : Deoxyribonucleic acid dNTPs : Deoxyribonucleic triphotphate DNS : acid 3,5-dinitrosalicylic GlcNAc : N- acetylglucosamine : hecta LB : Luria-Bertani M, µmol : Mol, micromol mg, g : milligrams, grams NAG : N-acetyl-β-D-glucosamine OD : Optical Density (mật độ quang học) PDA : Potato dextrose agar PDB : Potato dextrose broth PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA : Ribonucleic acid rRNA : Ribosomal ribonucleic acid SDS : Sodium dodecyl sulfate Taq-DNA polymerase TE : Thermus aquaticus DNA polymerase : Đệm Tris – EDTA (Ethylennediaminetetraacetic) v/v : Volume/volume v/w : Volume/ weight w/v : Weight/volume µl, ml, l : Microliters, milliliters, liters Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh MỞ ĐẦU Rệp muội lồi trùng gây hại lớn trồng nói chung lương thực nói riêng Hàng năm, giới sản lượng nông nghiệp bị tổn thất nạn rệp gây lên tới hàng tỷ đô la Đặc biệt, giới năm nhiều tỷ đô la Mỹ để khống chế rệp muội phá hại trồng Trong số, loài rệp muội gây hại phải kể đến rệp ngô (Aphis maydis) loại sâu hại phổ biến toàn giới, chúng ký sinh nhiều loại trồng lúa miến (Sorghum), ngơ, mía lúa mì… với mật độ cao làm giảm sản lượng hạt lây truyền virus gây bệnh Rệp trích hút nhựa, làm tổn thương tất phận khác dẫn tới giảm suất, chất lượng hạt [29] Mặt khác chúng mơi giới truyền virus gây số bệnh cho bắp potyvirus, virus màu vàng, bệnh vàng lùn, bệnh khảm lá, bệnh đỏ Do tính chất gây hại rệp ngô, việc sử dụng biện pháp phòng trừ rệp ngơ cần thiết Một phương pháp mà nhân dân ta hay sử dụng dùng thuốc bảo vệ thực vật hóa học để khống chế nạn dịch bệnh sâu hại tỏ có hiệu Tuy nhiên, việc gia tăng thường xuyên sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học năm gần ảnh hưởng khơng nhỏ đến trùng có ích, động vật hoang dã, làm ô nhiễm môi trường ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Nông nghiệp nước ta hướng tới nông nghiệp sạch, nông nghiệp sinh thái, biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp nòng cốt Việc sử dụng biện pháp sinh học phòng chống sâu hại trồng nấm ký sinh côn trùng, thiên địch mở hướng sản xuất nông nghiệp ưu điểm vượt trội phát tán nhanh gây hại trùng có hại, khơng gây hại tới nguồn nước môi trường sinh thái sức khỏe người, vật nuôi Nấm ký sinh côn trùng gây bệnh theo đường bào tử nảy mầm phát triển thành hệ sợi ăn sâu vào khoang bụng, qua đường tiêu hóa, thơng qua khí quản sợi nấm phủ kín lỗ khí trùng làm chúng chết Nấm gây bệnh cho trùng cách tiết độc tố enzyme protease, lipase, Trường đại học khoa học tự nhiên Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Thuỳ Châu, Trương Thanh Bình, Bùi Thị Hương, Trần Văn Tuân, Lê Hữu Hiếu, Đỗ Ngọc Huyền, Nguyễn Ngọc Huyền, Nguyễn Thị Hồng Hà (2000), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh phòng trừ trùng từ chủng Bacillus thuringiensis”, Tạp chí Nơng nghiệp Công nghiệp Thực phẩm, (8/2000), tr 359-361 Tạ Kim Chỉnh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Hoa Thị Minh Tú (2004), Phân tích trình tự gen r28S chủng nấm Metarhizium Ma2RN phân lập Việt Nam Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Thu Cúc (2009), Côn trùng nông nghiệp, phần A: Côn trùng đại cương, NXB Đại học Cần Thơ Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1980), Vi sinh vật học tập 2, NXB Đại học trung học chuyên nghiệp Hà Nội, Hà Nội Đặng Tiến Đông (2010), Sản xuất chitin-chitosan từ vỏ tôm, Đại học kĩ thuật thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Hà (2012), “Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp enzym chitinase phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”, Tạp chí Khoa học- Đại học Cần Thơ, 22b, tr 26-35 Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase Trichoderma vai trò kiểm sốt sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Lê Thị Huệ (2010), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng, Luận văn Thạc sĩ, Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh 10 Phạm Văn Mạch (1998), “Kết thử nghiệm bước đầu thuốc trừ sâu sinh học 2B rầy nâu hại lúa”, Tạp chí Lâm nghiệp, (10), tr 29-30 Trường đại học khoa học tự nhiên 57 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh 11 Nguyễn Hồng Minh, Nguyễn Ngọc Mai, Vũ Văn Hạnh (2013), Tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase chủng nấm kí sinh trùng Lecanicillium đột biến, Báo cáo khoa học, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2013, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ, Hà Nội 12 Lê Minh Nguyệt, Phan Thị Phương Thảo, Xây dựng quy trình sản xuất giống khởi động cho sản xuất chao từ nấm mốc Mucor elegans (2012), Tạp chí Khoa học Phát triển, 10 (5), tr 771-778 13 Nguyễn Quang Nhân (2009), Nghiên cứu, thu nhận xác định tính chất chitinase từ mủ cao su Heveabrasiliensis, Luận văn thạc sỹ sinh học, trường đại học Khoa học tự nhiên 14 Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến (2007), “Đặc điểm sinh học khả gây bệnh nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin sâu khoang (Spodoptera litura F.) hại rau cải xanh (Brassica juncea L.”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nơng Lâm nghiệp- Đại học Nông Lâm Tp HCM, (1&2), tr 58-63 15 Lê Xuân Phương (2008), Vi sinh vật học môi trường, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng 16 Nguyễn Văn Sơn, Nguyễn Anh Diệp (2001), “Hiệu lực số loại thuốc trừ sâu sinh học sâu tơ sâu khoang hại rau họ hoa thập tự”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, (9/2001), tr 624-625 17 Quyền Đình Thi, Vũ Văn Hạnh, Lê Thị Thùy Dương (2012), “Độc tính nấm kí sinh trùng rệp hại ngô Aphis Maydis chế độ nhiệt độ độ ẩm”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ, Hội nghị nhà khoa học trẻ tồn quốc lĩnh vực khoa học tự nhiên công nghệ, 50 (3D), tr 999- 1005 18 Nguyễn Thị Hồng Thương, Đồng Thị Thanh Thu, Đinh Minh Hiệp (2003), Khảo sát số yếu tố tác động trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase chủng nấm mốc Trichoderma spp., Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ II Nghiên cứu sinh học, nông nghiệp y học Huế, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trường đại học khoa học tự nhiên 58 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh Tiếng anh 19 Abbott W S (1925), “A method for computing the effectiveness of an insecticide”, J Econ Entomol, 18, pp 256-267 20 Agheizadeh Fatemeh., Faezi Ghasemi M., Ghasemi M., Ghaemi N., Dastan K (2008), “Optimization of chitinase production by Penicillium aculeatum PTCC 5167 in submerged culture fermentation”, J Bio Sci, 2(2 (SERIES NO 5)), pp 13-24 21 Akhtar L H., Hussain M., Iqbal R M., Amer M (2010), “Losses in grain yield caused by russian wheat aphid Diuraphis noxia (Mordvilko)”, Sarhad J Agric, 26(4), pp 625-628 22 Alavo T B C., Sermann H., Bochow H (2002),”Virulence of strains of the entomopathogenic fungus Verticillium lecanii to aphids: strain improvement”, Arch Phytopath Pflanz, 34 (6), pp 379- 398 23 Arthur Felse P., Panda T (1999), “Self-directing optimization of parameters for extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in batch mode” Process Biochem, 6-7(34), pp 563-566 24 Baysal Z., Uyar F., Aytekin C (2003), “Solid state fermentation for production of α-amylase by a thermotolerant Bacillus subtilis from hot- spring water” Process Bichem, 38, pp 1665-1668 25 Behura B K., Bohidark (1983), “Effect of temperature on the fecundit of five species of aphids”, Pranikee, 4, pp 23-27 26 Blackman R L., Eastop V F (1984), Aphids on the world’s crops: An identification and information guide, Chichester West Sussex and New York, New York 27 Bodenheimer F S., and Swirski E (1957), The Aphidodea of the Middle Eas, The Weizmann Science Press of Israel, Jerusalem 28 Brar N S., Bakhetia D R C., Sekhon B S (1987), “Estimation of losses in yield of rapeseed and mustard due to mustard aphid”, Lipaphis erysimi (Kalt.), J Oilseeds Res, 4(2), pp 261-264 Trường đại học khoa học tự nhiên 59 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh 29 Carena M., Glogoza P (2004) “Resistance of maize to the corn leaf aphid: A review”, Maydica, 49, pp 241-254 30 Catangui M A., Beckendorf E A., Riedell W E (2009), “Soybean aphid population dynamics, soybean yield loss, and development of stage-specific economic injury levels”, Agron J, 101(5), pp 1080-1092 31 Carrasco- Tauber C (1989), Pesticide Productivity Revisitef, M S Thesis, Amherst, MA, University of Massachusetts 32 Charnley A K., St Leger R J (1991), The role of cuticle-degrading enzymes in fungal pathogenesis in insects, in Fungal spore disease initiation in plants and animals, Cole G T., and Hoch H C., Editors, New York Plenum Press, pp 267287 33 Damalas C A (2009), “Understanding benefits and risks of pesticide use”, Sci Res Essay, 4(10), pp 945- 949 34 De-hui D., Wei-lian H., Guang-rong H., Wei Li (2011), “Purification and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic Bacillus sp Hu1”, African Journal of Biotechnology, 10(13), pp 2476-2485 35 Dimbi S., Maniania N K., Lux A S., Ekesi S., Mueke K J (2003), “Pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin and Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin, to three adult fruit fly species: Ceratitis capitata (Wiedemann), C rosa var Fasciventris Karsch and C.cosyra (Walker) (Diptera: Tephritidae)”, Mycopathologia, 156(4), pp 375-382 36 George C M., Ken P M (1993), Bugs of the World, Of the World Series, Facts on File, New York 37 Goettel M S., Koike M., Kim J J., Aiuchi D., Shinya R., Brodeur J (2008), “Potential of Lecanicillium spp for management of insects, nematodes and plant diseases”, J Invertebr Pathol, 98(3), pp 256- 261 38 Guthrie J L., Khalif S., Castle A J (2005), “An improved method for detection and quantification of chitinase activities”, Canadian Journal of Microbiology, 51(6), pp 491-495 Trường đại học khoa học tự nhiên 60 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh 39 Hall R A., Burges H D (1979), “Control of aphids in glasshouses with the fungus, Verticillium lecanii”, Ann Appl Biol, 93(3), pp 235-236 40 Hajek R A., St Leger R J (1994), “Interactions between fungal pathogens and insect hosts”, Ann Rev Entomol, 39, pp 293-322 41 Hsiao W F., Bidochka M J., Khachatourians G G (1992), “Effects of diphenols on growth of three entopathogenic fungi”, Candian Journal of Microbiology, 38(9), pp 1000-1003 42 Huang C J., Wang T K., Chung S C., Chen C Y (2005), “Identification of an Antifungal Chitinase from a Potential Biocontrol Agent Bacillus cereus 28-9”, J Biochemistry Molecular Biology, 38(1), pp 82-88 43 Lee Y G., Chung K C., Wi S G., Lee J C., Bae H J (2009), “Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704”, Protein Expresion and Purification, 65(2), pp 244-250 44 Madelin M F (1963), “Diseases caused by Hyphomycetous fungi”, In E A Steinhaus [ed.] Insect Pathology: An Advanced Treatise, Academic Press, NY, 2, pp 233-271 45 Marianski S., Marianski A., (2009), The art of making fermentated sausages, Bookmagic LLC 46 Meyer S L E., Johnson G., Dimock M., Fahey J W., Huettel R N (1997), “Field efficacy of Verticillium lecanii, sex pheromone, and pheromone analogs as potentisal management agents for soybean cyst nematode”, J Nematol, 29(3), pp 282- 288 47 Millner T C., Gubler W D., Laemmlen F F., Geng S., Rizzo D M (2004), “Potential for using Lecanicillium lecanii for suppression of strawberry powdery mildew”, Biocontrol Sci Technol, 14(2), pp 215- 220 48 Miner R J., Pierrard G., Baw A., Myochit (1992), “The potential of Metarhium anisopliae for the control of Scarab pest Management”, pp 277-280 49 Moazami N (2002), “Biopesticides production”, Encyclopedia of Biological physiological and Heath Sciences, Encyclopedia of Life Support Systems, pp.152 Trường đại học khoa học tự nhiên 61 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh 50 Monreal J., Reese E T (1969), “The chitinase of Serratia marcescens”, Can J Microbiol, 15 (7), pp 689-690 51 Moore D., Bridge P D., Higggins P M., Bateman R P., Prior G (1993), “Ultraviolet radiation damage to Metarhizium flavoviridae conidia and the protection given by vegetable and mineral oils and chemical sunscreens”, Annals of Applied Biology, 122(3), pp 605- 616 52 Moorhouse E R., Gillespie A T (1992), “Influence of fungicides and insecticides on the entomogenuos fungus Metarhizium anisopliae a pathogen of the vine weevil Otiorhynchus sunlcatus”, Bioscience and Technology, 2(49), pp 49-59 53 Moo Y M., Moreira A R., Tengerdy R P (1983), “Principles of soild substrate fermentation”, Fungal Technology, Edward Arnold, London, 4, pp 117-144 54 Nene Y L., Reddy M V (1976), “Preliminary information on chickpea stunt”, Tropical Grain Legume Bulletin, 5, pp 31-32 55 Ouakfaoui S E., Asselin A (1992), “Multiple forms of chitinase activities”, Phytochemistry, 31, pp 1513- 1518 56 Parameswaran B., Tunde P., Viviana N., Chandran S., George S., Istvan P., Ashok P (2005), “Production and purification of extracellular chitinases from Penicilium aculeatum NRRL 21 under solid-state fermentation”, Enzyme Microbial Technol, 7(36), pp 880-887 57 Patel S R., Awasthi A K., Tomar R K S (2004), “Assessment of yield losses in mustard (Brassica juncea L.) due to mustard aphid (Lipaphis erysimi Kalt.) under differrent thermal environments in Eastern Central India”, Appl Eco Environ Res, 2(1), pp 1-15 58 Patidar P., Agrawal D., Banerjee T., Patil S (2005), “Optimisation of process parameters for chitinase production by soil isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation”, Process Biochem, 40(9), pp 2962-2967 59 Pimentel D., Acquay H., Biltonen M., Rice P., Silva M., Nelson J., Lipner V., Giordana S., Horowitz A., D’amore M (1993), “Assessment of environmental Trường đại học khoa học tự nhiên 62 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh and economic impacts of pesticide use”, The Pesticide Question: Environment, Economic and Ethics, Chapman & Hall, NewYork, pp 47-84 60 Pimentel D (1997), “Pest management in agriculture”, Techniques for Reducing Pesticide Use: Enviromental and Economic Benefits, John Wiley & Sons, Chichester, UK, pp 1-11 61 Raimbault M (1998), “General and microbiological aspects of soild substrate fermentation”, Electron J Biotechnol, 1(3), pp.1-15 62 Ramesh M.V., Lonsane B.K (1987), “Solid State fermentation for production of alpha amylase by Bacillus megaterium 16 M”, Biotechnol Lett, 5(9), pp 323328 63 Rath A (1995), “Termite meets fungus- fungus eats termite, bio- blast- a new biological tool for your termite control programs”, Pest Control, 63, pp 42-43 64 Razaq M., Mehmood A., Ismail M., Afzal M., Ali-Shad S (2011), “Losses in yield and yield components caused by aphids to late sown Brassica napus L., Brassica juncea L and Brassica carrinata A at Multan, Punjab (Pakistan)”, Pak J Bot, 43(1), pp 319-324 65 Riedell W E., Tinney J C., Macgregor J T., Starlert N J (1978), “Pesticide use in agriculture”, Environ Heath Perspect, 27, pp 103-112 66 Rifkind D., Freeman G (2005), The Nobel Prize Winning Discoveries in Infectious Diseases, Academic Press, Lon Don 67 Roberti R., Ghisellini L., Innocenti G (1993), “Biological control of blackeg of beetle (Phomabetae) by Metarhiziumanisopliae”, Zeitschriftfur Pflanzenkrrankheeitn und Pflanzenschutz, 100(2), pp 203-210 68 Sherief A A., El-Sawah M M A., Abd El-Naby M A (1991), “Some properties of chitinase produced by a potent Aspergillus carneus strain”, Appl Microbiol Biotechnol, 35, pp 228-230 69 Shuhui L., Mok Y K., Wong W S (1992), “Role of Mammalian Chitinases in Asthma”, Int Arch Allergy Immunol, 149 (4), pp 369–377 70 Synowiecki J., Al-Khateeb N A (2003), “Production, properties, and some new applications of chitin and its derivatives”, Crit Rev Food Sci, 43(2), pp 145-171 Trường đại học khoa học tự nhiên 63 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh 71 Thackray D J., Diggle A J., and Berlandier F A (2004), “Forecasting aphid outbreaks and epidemics of Cucumber mosaic virus in lupin crops in a Mediterranean-type environment”, Virus Res, 100(1), pp 67-82 72 Ubhayasekera W., Rawat R., Ho S W., Wiweger M., Von A S., Chye M L., Mowbray S L (2009), “The first crystal structures of a family 19 class IV chitinase: the enzyme from Norway spruce”, Plant Mol Biol., 71(3), pp 277289 73 Ulhoa C J., Peberdy J F (1991)., “Regulation of chitinase synthesis in Trichoderma harzianum”, Department of Botany, Microbial Biochemistry and Genetics Group, University of Nottingham, Nottingham NG7 2RD, UK, 137(9), pp 2163-2169 74 Vu V H., Kim K., Hong S I (2006), Production, formulation and application of aerial conidia of entomopathogenic fungus for aphid control (p.140), Annual Meeting and International Symposium: Systemetic Innovation for Microbial Biotechnology Trường đại học khoa học tự nhiên 64 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỬ ĐỘC LỰC DIỆT RỆP CỦA CÁC CHỦNG NẤM VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA PENICILLIUM SP M4 Bảng phụ lục 1: Độc lực diệt rệp ngô chủng chủng nấm NM1, NM2 NM3 NM4, NM5, NM6 Thời gian sau phun (ngày) Tỷ lệ rệp chết (%) Đối chứng 0 0 0 0 NM1 2,5 ± 2,2 5,1 ± 2,3 8,9 ± 2,3 13,2 ± 2,5 25,3 ± 1,5 27,9 ± 1,8 39,3 ± 3,5 NM2 3,9 ± 0,2 11,7 ± 3,9 14,8 ± 4,5 21,1 ± 1,0 22,4 ± 1,5 32,4 ± 5,0 45,5 ± 3,9 NM3 3,7 ± 0,1 23,4 ± 0,5 60,2 ± 1,8 70,7 ± 1,6 82,9 ± 0,9 87 ± 0,2 88,4 ± 2,6 NM4 11,3 ± 4,0 19,5 ± 4,3 62,6 ± 1,7 72,4 ± 2,2 80,7 ± 0,9 87,2 ± 1,9 92,3 ± 2,1 NM5 ± 4,0 11,7 ± 0,3 17,3 ± 1,7 28,4 ± 1,8 37,5 ± 1,6 41,7 ± 3,0 49,9 ± 2,5 NM6 3,9 ± 4,0 7,9 ± 3,8 14,7 ± 4,6 20,8 ± 0,9 24,2 ± 1,3 32,8 ± 2,2 36 ± 1,8 o Ghi chú: Nhiệt độ 30 C, độ ẩm khơng khí 70% Bảng phụ lục 2: Ảnh hưởng nguồn chất lên khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 TT Nguồn chất Kí hiệu Hoạt tính chitinase (U/ml) Lần Lần Lần Trung bình Lõi ngơ LN 1,19 1,21 1,23 1,21 ± 0,02 Gạo G 1,49 1,44 1,47 1,47 ± 0,02 Cám gạo CG 5,03 4,99 5,00 5,01 ± 0,02 Bột ngô BN 5,99 6,04 6,12 6,05 ± 0,06 Cám gạo + bột ngô CB 5,63 5,59 5,58 5,60 ± 0,03 Bột ngô + lõi ngô BL 4,83 4,86 4,87 4,85 ± 0,02 Gạo + bột ngô GB 4,63 4,59 4,61 4,61 ± 0,02 Cám gạo + gạo CGG 3,37 3,40 3,38 3,39 ± 0,02 Cám gạo +lõi ngô CL 3,14 3,16 3,15 3,15 ± 0,01 10 Gạo + lõi ngô GL 2,69 2,66 2,67 2,68 ± 0,02 Ghi chú: F=11333,93; P< 0,01 Trường đại học khoa học tự nhiên 65 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh Bảng phụ lục 3: Ảnh hưởng độ dày chất bột ngô lên khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 TT Độ dày chất Hoạt tính chitinase (U/ml) Lần Lần Lần Trung bình 2,17 2,17 2,19 2,17 ± 0,01 3,02 3,10 3,08 3,07 ± 0,04 11 4,99 4,97 4,99 4,99 ± 0,01 13,5 5,11 5,14 5,13 5,12 ± 0,02 15 6,02 5,99 6,04 6,02 ± 0,02 17 6.,28 6,30 6,28 6,29 ± 0,01 19 5,58 5,57 5,46 5,54 ± 0,07 21 4,96 5,00 4,97 4,98 ± 0,02 23 3,55 3,56 3,58 3,56 ± 0,02 10 25 2,96 2,94 2,92 2,94 ± 0,02 Ghi chú: F= 7152,24; P< 0,01 Bảng phụ lục 4: Ảnh hưởng độ ẩm lên khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 Lượng nước bổ sung(v/w) Lần Lần Lần Trung bình 40 3,63 3,65 3,66 3,65 ± 0,02 50 5,94 5,94 5,91 5,93 ± 0,02 60 6,39 6,35 6,33 6,36 ± 0,03 70 5,09 5,07 5,03 5,06 ± 0,03 80 4,47 4,47 4,49 4,47 ± 0,01 90 3,20 3,19 3,23 3,21 ± 0,02 100 2,84 2,83 2,82 2,38 ± 0,01 TT Hoạt tính chitinase (U/ml) Ghi chú: F= 14291,84; P< 0,01 Trường đại học khoa học tự nhiên 66 Lớp cao học môi trường K19 Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh Bảng phụ lục 5: Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng lên khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 TT Nồng độ chitin Hoạt tính chitinase (U/ml) (w/w) Lần Lần Lần Trung bình 0,13 0,14 0,18 0,15 ± 0,02 0.5 4,75 4,76 4,76 4,75 ± 0,01 6,36 6,39 6,39 6,38 ± 0,02 1.5 5,21 5,24 5,25 5,23 ± 0,02 4,05 4,09 4,09 4,08 ± 0,02 2.5 2,54 2,55 2,55 2,54 ± 0,01 Ghi chú: F= 25873,15; P< 0,01 Bảng phụ lục 6: Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 TT Nhiệt độ (oC) Hoạt tính chitinase (U/ml) Lần Lần Lần Trung bình 20 0,14 0,16 0,14 0,14 ± 0,01 26 4,10 4,06 4,05 4,07 ± 0,03 28 5,24 5,28 5,25 5,26 ± 0,02 30 6,23 6,22 6,20 6,22 ± 0,02 37 4,91 4,94 4,92 4,93 ± 0,02 40 0,45 0,44 0,42 0,44 ± 0,02 Ghi chú: F= 55645,42; P< 0,01 Bảng phụ lục 7: Ảnh hưởng pH lên khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp M4 TT pH Hoạt tính chitinase (U/ml) Lần Lần Lần Trung bình 2,26 2,30 2,28 2,28 ± 0,02 4,38 4,40 4,41 4,39 ± 0,02 5,67 5,66 5,66 5,66 ± 0,01 6,57 6,59 6,60 6,59 ± 0,02 4,98 4,99 5,02 4,99 ± 0,02 3,08 3,10 3,11 3,09 ± 0,02 1,79 1,75 1,77 1,77 ± 0,02 10 0,10 0,12 0,14 0,12 ± 0,02 Ghi chú: F= 46969,52; P