Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon

3. Sinh tổng hợp ị3 carotene

2.3.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon

phát triển và tổng hợp carotenoid.

Bốn chủng nấm men được chọn từ 2.3.3 cấy một lượng tế bào tương đương nhau vào bình tam giác dung tích 500 ml có chứa 100ml dịch môi trường tương ứng. Sau đó bình tam giác được lắc và chiếu sáng liên tục trong 8 ngày, tốc độ lắc 140 vòng/1 phút, nhiệt độ 25 °c. Tiến hành so độ đục và độ đậm màu dịch nuôi cấy của các mẫu theo thời gian.Ket quả được thể hiện trong bảng 5.

Bảng 5: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon và thời gian _____ nuôi cấy tới khả năng tổng hợp Carotenoid

Chủng Nguồn c 48h 72h 96h 120 144h 168h 192h Malt + + ++ ++ + + HRY82 ^{Gluco + ++ + + + +++ +++ ++ ++} Ethanol + + + + + + Glycerin 0 0 0 + + + + Malt + + + + + + + + + HRY104 Gluco ^{+ + + + + + + + +} Ethanol ⁺ Glycerin 0 0 0 0 + + Malt ^{++ +++ +++ ++ ++ +} HRY112 Gluco ^{++ + ±} Ethanol + + Glycerin 0 0 0 0 0 0 0 Malt ^{++ ++} HRY149 Gluco ^{+ + + ±} Ehanol + ± + Glycerin + + + + Chú thích: 0: không mọc (-): đục trắng (±): đục, nhạt màu (+) : màu hồng (++): màu đỏ (+++): màu đỏ tốt

Cả bốn chủng đều phát triển tốt trên môi trường Malt-glucose, độ đậm màu đạt cực đại trong khoảng 72h - 96h, bắt đầu giảm độ đậm màu sau 120h. Môi trường có Glucose cũng thích hợp cho các chủng phát triển nhưng không bằng môi trường Malt - glucose, trừ chủng HRY82, chủng này có thời gian bền màu lâu từ 96h-168h. Môi trường có Ethanol, Glycerin thường khả năng đồng hoá kém, tốc độ mọc chậm, hơn, cường độ màu thấp

Hình 3. ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tạo màu của các chủng khảo cứu (1 - Malt, 2 - Gluco-KNOs, 3 - Ethanol-KNOs, 4 - Glycerin-KN03) a: sau 48h nuôi cấy, b: sau 72h nuôi cấy, c: sau 96h nuôi cấy, d: 144h nuôi cấy.

2.3.5. Tách, chiết carotenoỉd từ nấm men.

\ r

Sơ đô tach chief

Quỵ trinh chief tach

Nấm men được cấy vào ống nghiệm chứa 5 ml dịch môi trường, lắc 320 vòng/ phút, 25°c trong 18 giờ. Sau đó chuyển vào bình nón dung tích 500 ml chứa 100 ml dịch nuôi cấy.

Bình tam giác được lắc với tốc độ 140 vòng/phút, chiếu sáng liên tục trong 72 giờ ở 25°c. Sau đó li tâm trong vòng 5 phút với tốc độ 4000vòng/phút. Loại bỏ lớp dịch, đem cân và tính lượng sinh khối tế bào.

Dung môi phá tế bào đã được ngâm nóng ở 55°c cho vào ống fancol với tỷ lệ lg sinh khối: 10 ml dung môi. Lắc mạnh trong 2 phút. Sau đó thêm 1 ml dung dịch đệm phosphat NaH2P 0 4/ Na2HPƠ4 pH= 7; 10 ml dung môi chiết carotenoid vào ống, tiếp tục lắc trong 1 phút.

Li tâm trong 3 phút ở tốc độ 4000 vòng/ phút. Tách lấy lớp dung môi ở trên. Quá trình tách có thể dùng bình gạn hoặc dùng pipet hút lấy lớp dịch carotenoid.

2.3.6.Định lượng carotenoid toàn phần bằng đo độ hấp thụ UV- VIS.

Dịch thu được ở phần 2.3.5 được pha loãng 3 lần bằng dung môi hexan: ethyl acetat (1:1), đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 480 nm với mẫu trắng là dung môi pha loãng. Kết quả được thể hiện ở bảng 6.

Bảng 6. Hàm lượng Carotenoid trong các mẫu được chọn từ 2.3.5

H R Y 104 H R Y 112 H R Y 149 H R Y 8 2

Malt Glucose Malt Glucose Malt Glucose Malt Glucose

Độ hâp thụ OD 0,366 0,364 0,517 0,167 0,576 0,241 0,531 0,379 Tông carotenoid mg/100ml ^{5,106 5,079 7,214 2,33 8,037 3,363 7,41} 5,288

Lượng sinh khôi

ướt (g) 2,036 1,343 1,341 2,031 1,525 1,987 1,798 2,565

mg carotenoid/g

sinh khối ướt 2,51 3,781 5,379 1,147 5,27 1,69 4,12 2,061

Nhận xét : Kết quả bảng 6 cho thấy các chủng HRY 112, HRY 149, HRY82 lượng sinh khối thu được ở môi trường Malt- glucose ít hơn môi

trường glucose nhưng tổng lượng carotenoid ở môi trường Malt - Glucose lại cao hon. Như vậy có thể thấy là tổng Carotenoid không phụ thuộc lượng sinh khối mà phụ thuộc vào khả năng tổng hợp Carotenoid của tế bào nấm men. Chủng HRY112 trong môi trường Malt-glucose cho hiệu suất tổng hợp Carotenoid cao nhất (5,379 mg/g sinh khối ướt) trong khi ở môi trường glucose kết quả là thấp nhất (l,147mg/g). Các mẫu ở môi trường Malt- glucose đều có hiệu suất tổng họp Carotenoid cao hơn môi trường glucose. Nhìn chung môi trường Malt có đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng hơn các môi trường khác và có lẽ do vậy đảm bảo cho quá trình sinh tổng hợp. Chúng tôi chọn các mẫu nuôi cấy trên môi trường Malt đem xác định thành phần cartenoid và định lượng p -Carotene.

2.3.7. Xác định thành phần carotenoid và Carotene.

Xác định carotenoid thành phần dựa vào peak và thời gian lưu của chất trên sắc ký đồ ở bước sóng 450nm, phổ hấp thụ UV-VIS và phổ đạo hàm bậc nhất. Định lượng (3-Carotene được thực hiện thông qua việc xây dựng đường chuẩn (3 -Carotene.

Tiến hành:

Điều Ịáên chaỵ sac ký lỏng, hỉêu năng cao (HPLC): Côt: Symmetry Cis

(Waters) 150 *4,6 mm, pha động: Acetonitril: Methanol (chứa 50 mM amoni acetat): Dicloromethan: Nước với tỷ lệ 70:15:10:5 (v/v), detector PDA 2596 (Photodiod array), tốc độ dòng: 1 ml/phút, nhiệt độ cột: 40°c, thời gian chạy:

20 phút

r-1 r-T- T " X' '-Ỉ...r’~r-'i r T ~ r j - T- r

iaoo 12*00 14.00 16.00 ~1—»—r-r-

18.00 20:00

Hình 5 Sắc ký đồ của a: Ị3-carotene chuẩn, b: mẫu HRY82 tại Â= 450 nm Nhìn vào sắc ký đồ (hình5,10) ta thấy, các chất tách tương đối tốt, cả 4 mẫu dịch chiết được pha loãng 5 lần đều cho sắc ký đồ tương đối giống nhau. Thành phần Carotenoid gồm các hợp chất Xanthin và nhóm Carotene trong đó nhóm Xanthin chứa tỉ lệ lớn hơn. Dựa trên sắc ký đồ, thời gian lưu, phổ hấp thụ UV-VIS, phổ đạo hàm bậc nhất của mẫu và chất chuẩn, chúng tôi xác

định chất có thời gian lưu 5,8 phút là Turolarhodin, chất thứ hai có thời gian lưu 6,2 phút chưa xác định cụ thể.

nm

Hình 6. Phổ hấp thụ và phổ đạo hàm bậc nhất của 3 - Carotene chuẩn và p - Carotene trong mẫu HRY 82.

Các mẫu HRY104, HRY102, HRY149 thành phần carotene rất thấp trong đó Ị3-Carotene chỉ có vết với peak rất nhỏ và bị nhiễu nhiều. Điều này có thể do bản thân các mẫu nấm men tổng hợp được ít p-Carotene, tuy nhiên cũng có thể trong quá trình chiết tách ảnh hưởng của các điều kiện ngoại cảnh như

ánh sáng, nhiệt độ, các chất oxy hoá đã làm biến đổi và giảm đáng kể lượng carotene.

Mầu HRY82 cho kết quả tốt hơn cả, trên sắc ký đồ ngoài hai chất giống với các mẫu khác còn có P-Carotene với đỉnh tương đối đặc trưng. Tuy có sai lệch về thời gian lưu với các chất chuẩn 0,13 phút song khi định tính bằng phổ UV-VIS và phổ đạo hàm bậc nhất đều có đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 454nm và 480nm, hình dáng phổ giống nhau nên có thể khẳng định khá chắc chắn chất trong mẫu là ị3-Carotene. Sự lệch đỉnh hấp thụ cưc đại lnm và thời gian lưu có thể do nồng độ (3-Carotene trong mẫu nhỏ.

Bảng 7. Thành phẩn Carotenoid trong dịch chiết

Dịch chiết Carotenoid ^Thời gian lưu Diện tích peak Tỷ lệ % peak HRY 82 Torularhodin 5,875 351123 68,2 UNK- 450 6,269 105536 20,5 p- carotene ^{14,719 57896 11,3} HRY 104 Toralarhodin 5,856 470400 79,2 UNK- 450 6,241 122799 20,6 p- carotene - - <0,01 HRY 112 Torularhodin 5,842 179813 79,1 UNK- 450 6,235 47455 20,7 P- carotene - - <0,01 HRY 149 Torularhodin 5,823 483448 79,5 UNK- 450 6,206 124351 20,4 |3- carotene - - <0,01 /V/ ^

Xác định hàm lượng Ị3-Carotene trong mâu chúng tôi dựa vào đô thị đường chuẩn và thu được kết quả có 0,27 |ig/ml dịch tiêm mẫu.

STD Area

std 1 1,29 276504 b= -252,141

std 2 1,4 306543 a= 217027,3

0 0

Mau HRY82 0,27 57896

Hình 7. Đồ thị đường chuẩn thể hiện tương quan giữa nồng độ và diện tích peak của Ị3 - carotene

Kết quả bảng 7 và hình 7, cho thấy tỷ lệ % giữa các chất chính trong dịch chiết carotenoid là không khác nhau nhiều. Tổng diện tích peak của mẫu HRY149 cao nhất cho thấy khả năng tổng hợp carotenoid của mẫu này là cao nhất. Mầu HRY82 tổng hợp Carotenoid đứng thứ hai song có thành phần Ị3- carotene với hàm lượng là 13,5 ỊLig. Vì vậy chúng tôi nhận thấy chủng HRY82 tổng hợp carotenoid tốt nhất cả về hàm lượng và thành phần carotenoid trong số các chủng đã phân lập.

Từ kết quả thu được chúng tôi cho rằng trong quá trình tách chiết và bảo quản dịch chiết cần cho thêm c hất bảo quản vào, điều kiện bảo quản c ần tránh ánh sáng, chất oxy hoá và tốt nhất là phân tích ngay sau khi chiết .

Đồng thời quy trình tách chiết cũng cần nghiên cứu sâu hơn để tăng hiệu suất tách chiết.

Một điều khá thú vị là trong quá trình sắc ký chúng tôi còn phát hiện được một thành phần không phải là nhóm carotenoid, hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 278nm.

So sánh hình dáng của peak, phổ hấp thụ u v , phổ đạo hàm bậc nhất của mẫu và của chất đối chiếu là dược chất trong viên nang mềm Eckhart. Q10 chứa 30mg Coenzym Q10 của hãng Eckhart Corp (Mỹ). Chúng tôi xác định được cả bốn mẫu HRY82, HRY104, HRY112, HRY149 trong dịch chiết đều có Coenzym Q10, là chất hiện nay được sử dụng nhiều trong mỹ phẩm, trong điều trị các bệnh tim mạch, chống oxy hoá, cung cấp năng lượng cho tế bào.

Bảng 8. thời gian lưu và diện tích peak của Coenzym Q10 tại A, = 278nm.

STT Dịch chiết Carotenoid Thòi gian lưu Diện tích peak

1 HRY 82 6,922 2237134 2 HRY 104 6,918 5833402 3 HRY 112 6,895 1876717 4 HRY 149 6,874 3183169 0.12 0.10 0.08 ặ 0.06 004 002 0.00 2.00 4.00 6.00 6.00 10.00 12.00 14.00 16.00 16.00 20,00 22.00 Mimầes

3 nm

b

Hình 9. Phổ hấp thụ u v , a - Thuốc Eckhart Qio của Mỹ, b - Mầu HRY 82

Trên kết quả sắc ký đồ mẫu HRY104 tổng hợp được nhiều CoQlO nhất, mẫu HRY149 thứ hai, HRY 82 thứ ba và thấp nhất là HRY112.

Tổng hợp kết quả của carotenoid và CoQlO, mẫu nấm men phân lập được có nhiều ưu điểm, chứa cả hai họp chất chống oxy hoá dùng điều trị trong các bệnh tim mạch, miễn dịch phổ biến hiện nay. Kết quả này sẽ thúc đẩy việc nghiên cứu tìm ra một chế phẩm hỗn họp cả hai chất trên từ chủng nấm

PHẦN 3. KÉT LUẬN VÀ ĐÊ XUẤT

3.1. Kết luận:

Phân lập được 154 chủng nấm men từ 25 mẫu lá. Tuyển chọn được 4 chủng có khả năng tổng hợp carotenoid và một chủng có khả năng tổng hợp

p - Carotene.

Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng và thời gian nuôi cấy tới khả năng tổng hợp carotenoid cho kết quả: với nguồn dinh dưỡng Nitơ là (NH4)2S 04 các chủng mọc tốt hơn KN03 về hình thái, kích thước và độ đậm màu của khuẩn lạc. Các chủng đã thử đều có khả năng sử dụng các nguồn dinh dưỡng cacbon khác nhau trong đó Malt- glucose cho hiệu quả sinh tổng hợp Carotenoid là lớn nhất. Thời gian thích hợp nhất cho việc tích luỹ là 72h- 96h.

Xây dựng được quy trình tách chiết carotenoid từ nấm men, định lượng được tổng carotenoid và P“ Carotene trong chủng HRY82

Xác định được thành phần chính của dịch chiết carotenoid là Torularhodin , bước đầu nhận thấy sự có mặt của CoQlO trong tế bào nấm men.

3.2.Đe xuất

Đe tài của chúng tôi mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu về các chủng nấm men sinh P-carotene. Trong thời gian tới đề tài cần tiếp tục được nghiên cứu thêm để sớm đưa ra chế phẩm chứa (3-carotene phục vụ cho việc tăng cường sức khoẻ cho người dân, cụ thể cần :

- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu hoá cho khả năng tổng hợp P-carotene của chủng đã phân lập ở trên..

- Sử dụng kỹ thuật gây đột biến để tạo ra những chủng mói cho năng suất tổng họp ị3-carotene cao hơn.

-Nghiên cứu tiếp CoQlO

-Nghiên cứu, sản xuất trên quy mô phòng thí nghiệm..

PHỤ LỤC 0 025- 0.020- í' 0,015- i 0.010- C 0.005-

J

Hình 10. Sắc ký đồ của các mẫu tại % = 450 nm, a - HRY 104, b - HRY 12, c - HRY 149

2.00 4.00 6.00 6JOO 10.00 12.00 14,00 16.00 18.00 20.00 22;00 24JM

Mnules

Hình 11. Sắc ký đồ của các mẫu tại X = 278 nm a - HRY 104, b - HRY 12, c - HRY 149

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đái Duy Ban (2001) Lương thực thực phẩm trong phòng chống ung thư- NXB Nông Nghiệp, trang 87-95.

2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997) Vi sinh vật học- NXB Giáo Dục Hà N ộ i.

3. Nguyễn Lân Dũng (1983) một số sản phẩm của vi nấm - NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội

4. Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Lệ Phi (1998) Vi sinh học- Trường Đại học Dược Hà Nội, trang 29- 56

5. Phạm Gia Huệ, Trần Tử An (2002) Hoá phân tích 2, Trường Đại học Dược Hà N ội, trang 13-31,55-98.

6. Lê Thị Thu Hương (2001) Phân lập các chủng nấm men có hoạt tính kháng khuẩn từ một số hoa quả - Luận văn thạc sỹ Trường Đại học Y Hà Nội.

7. Phan Quốc Kinh, Lê Doãn Diên, Cù Thị Tuyết Vân (1995) nghiên cứu p- carotene và a-tocopherol, từ cây gấc và hạt đậu tương nảy mầm, hội thảo quốc gia vi sinh vật học và công nghệ sinh học Trang 356 - 361.

8. Nguyễn Thiện Luân, Lê Doãn Diên, Phan Quốc Kinh (2001) Các chất bổ sung dinh dưỡng- Ngành khoa học công nghệ mới của thế kỷ 21- NXB Nông Nghiệp Hà N ộ i, trang 69-133.

9. Lương Đức Phẩm (2000) Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm- NXB Nông Nghiệp Hà Nội - trang 35-56, 143-145.

11. Lê Thành Phước (1998) Chuyên đề phức chất và gốc tự do- Trường Đại học Dược Hà Nội.

12. Nguyễn Xuân- Thực phẩm chứa dược chất- Dược thực phẩm một vài suy nghĩ dưới góc độ quản lý- Tạp chí Dược học- Bộ y tế tháng 1- 2003, trang 7-10.

13.Từ điển Bách khoa Dược học- NXB Từ điển Bách khoa Hà Nội (1999) trang 108.

14.Delia B. Rodriguez- Amaya- Carotenoid and Food, Preparation: The Retention of Provitamin A Carorenoid, in prepare, processed, and stored foods (1997).

15. European pharmacopoeia 1997, page 28-29, 465.

ló.Intemational Drug Directory 17th Edition 2000, page 116.

17. Official Methods of Analysis of AO AC international 16th Edition Volume 2, ch32, page 40-42.

18. LB- Flores- Costera, R. Mactin- Citrate, a possible precursor of astaxanthin in Phaffic zhodozyma: infhence of varying level of amonium, phosphate and citrate. In a chamically defined medium, (2000).

19. Mayne ST et al. J Nalt Cancer. lust (1994); 86:33- 8

20. PB. Bhosale- R.V.Grade- Production of P- carotene by a mutant of Rhodotorula glutinis, (2001).

21.United States Patent- Phaffia rhodozyma mutants, process for producing (3- carotene and use of Ị3- carotene eich biomass.

22.United States Patent- astaxanthin over- producing Strains of phaffia rhodozyma, methods for their cultication and their use in animal feeds, (2002).