Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12

bộ giáo dục đào tạo y tế trường đại học dược hà nội lê xuân hoành phân lập, tuyển chọn, phân loại số chủng Lactobacillus sinh acid lactic mạnh nhạy cảm với Vitamin b12 luận văn thạc sĩ dược học hà nội -2006 giáo dục đào tạo y tế trường đại học dược hà nội lê xuân hoành phân lập, tuyển chọn, phân loại số chủng Lactobacillus sinh acid lactic mạnh nhạy cảm với Vitamin b12 Chuyên ngành: Công nghệ Dược phÈm vµ Bµo chÕ M· sè: 60 73 01 luËn văn thạc sĩ dược học người hướng dẫn khoa học: PGS TS Từ Minh Koóng hà nội -2006 Lời cảm ơn Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Từ Minh Koóng- người thầy trực tiếp tận tình hướng dẫn suốt trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Cao Văn Thu, TS Đàm Thanh Xuân, đóng góp ý kiến quí báu cho trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Vũ Nguyên ThànhViện công nghiệp thực phẩm giúp đỡ nhiệt tình thâỳ cho trình thực đề tài Hoàn thành luận văn này, nhận nhiều giúp đỡ thầy cô đồng nghiệp môn Công nghiệp Dược, phòng Đào tạo Sau đại học trường Đại học Dược Hà Nội Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người khích lệ động viên đạt thành công ngày hôm Hà Nội, tháng 12 năm 2006 DS Lê Xuân Hoành Đặt Vấn đề Công nghệ sinh học ngày có nhiều ứng dụng đời sống người, đặc biệt lĩnh vực y học, dược học Tuy Việt Nam nói chung, trường Đại học Dược Hà Nội nói riêng, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu, sản xuất thuốc, nguyên liệu làm thuốc chưa ý phát triển mạnh mẽ Việt Nam, đặc ®iĨm khÝ hËu nªn nhãm vi khn lactic cã ë khắp nơi Vì mà ngành công nghiệp thực phẩm dùng trình lên men lactic để chế biến, bảo quản thực phẩm, ngành dược nghiên cứu trình lên men lactic sử dụng vi khuẩn lactic vào nhiều mục đích khác Ví dụ sản xuất acid lactic từ Lactobacillus chiếm 35% nguồn sản xuất acid này, tạo calcilactat, sữa chua có chứa calcilactat vitamin B12 làm thực phẩm chức điều trị còi xương Thêm vào nhóm vi khuẩn lactic dùng sản xuất nhiều chế phẩm thuốc như: Antibio, Lactomin Đặc biệt nhóm vi khuẩn dùng làm vi khuẩn kiểm định để định lượng vitamin B12 nồng độ thấp dạng hỗn hợp nhiều thành phần mà phương pháp phân tích hoá lý không thực Chính vậy, chọn đề tài: Phân lập, tuyển chọn, phân loại số chủng Lactobacillus sinh acid lactic mạnh nhạy cảm với vitamin B12 theo mục tiêu: Phân lập, tuyển chän vi khn Lactobacillus cho hiƯu st tỉng hỵp acid lactic mạnh Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus nhạy cảm vitamin B12 Định tên phương pháp sinh học phân tử chủng Lactobacillus tuyển chọn Nhằm tìm nguồn nguyên liệu cho công nghiệp lên men lactic chủng Lactobacillus để định lượng vitamin B12 phương pháp vi sinh vật chương I: Tổng quan 1.1 Quá trình lên men lactic 1.1.1 Đặc điểm vi khuÈn lactic Vi khuÈn sinh acid lactic n»m chñ yÕu c¸c chi Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobarterium, Lactococcus ViƯc phân loại vi khuẩn lactic mô tả rõ khoá phân loại Bergey khoá phân loại Prokaryot Ngoµi mét sè loµi nÊm thuéc chi Rhizopus có khả tạo acid lactic từ nguồn khác Nhìn chung tất vi khuẩn lactic chủng ưa nhiệt, hô hấp yếm khí vi hiếu khí Đa số vi khuẩn nhóm Gram dương, chúng khả di động hầu hết không tạo bào tử [10],[1] Hình dạng kích thước vi khuẩn lactic tương đối đa dạng, hình cầu, hình que, tế bào đơn độc liên kết tạo chuỗi Nhóm vi khuẩn sinh tr­ëng tèt ®iỊu kiƯn pH thÊp, pH tèi thÝch chúng từ 3,5-5, chúng có khả đồng hoá nhiều loại đường khác đường glucose, lactose, mantose, saccarose Nhờ đặc điểm mà nhóm vi khn lactic cã nhiỊu ­u thÕ b¶o qu¶n thực phẩm, có từ lâu đời lịch sử phát triển loài người [12],[1] Cho đến năm đầu kỷ 20, nghiên cứu trình lên men lactic nghiên cứu nhiều áp dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt thực phẩm dược phẩm Đến nay, nghiên cứu lên men lactic tiếp tục nghiên cứu giới 1.1.2 Chi Lactobacillus Đây chi lớn họ vi khuẩn lactic với nhiều chủng nghiên cứu ứng dụng sản xuất Dựa sở chuyển hoá gluxit tế bào sản phẩm tạo trình lên men mà chia chi nµy thµnh ba nhãm chÝnh Nhãm I: Lµ chủng vi khuẩn lactic lên men đẳng hình hay gọi đồng hình Sản phẩm cuối trình lên men acid lactic, chiếm khoảng 9098% sản phẩm khác xuất dạng vết nhỏ Trong trình chuyển hoá, acid lactic tạo thành thông qua chu trình EMP Hình thái kích thước nhóm phụ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy, thông thường có dạng hình que, hình sợi, sinh sản theo hình thức phân chia tế bào Nhiệt độ thích hợp cho nhóm phát triển 40-60oC loài ưa nhiệt 28-35oC với loài ưa ấm Đại diện điển hình cho nhóm lµ L acidophillus, L bulgaricus, L delbrueckii [12],[17] Nhãm II: Gồm chủng thuộc loại lên men lactic dị hình không bắt buộc, sản phẩm trình lên men có thĨ lµ acid lactic, acid acetic, acid formic, vµ ethanol Việc lên men đồng hình hay dị hình tuỳ thuộc vào loại đường cung cấp môi trường Nếu đường sáu C glucose, hexose, frutose lên men đồng hình, đường khác pentose lên men dị hình tạo acid lactic nhờ cảm ứng enzym phosphoketolase Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy nhóm có xu sử dụng trình lên men đồng hình số loài tồn hai trình lên men theo hai chế khác Đại diện cho nhóm chủng L plantarum, L casei, L helvesticus, L leichmanii [30],[10] Nhãm III: Nhãm nµy lµ chủng lên men dị hình bắt buộc, chuyển hoá glucose theo đường ED, tạo sản phẩm cuối trình lên men acid lactic, acid acetic, CO , ethanol đường 5C chuyển hoá thành acid lactic acid acetic Các vi khuẩn nhóm chủ yếu dạng hình que dài mảnh, không tạo bào tử, có khả tồn nhiệt độ rộng 2- 52oC, nhiệt độ phát triển tối ưu 30-40oC Nhóm phân bố rộng tự nhiên, thường có đất, nước, rau quả, ruột người động vật Đại diện điển hình nhóm L brevis, L buchneri, L fermentum [30],[2] B¶ng 1.1: Mét sè chđng Lactobacillus dïng s¶n xuÊt lactic STT Chñng L acidophillus L bulgaricus L delbrueckii L plantarum L casei NhiƯt ®é ­a thÝch 37-45oC 40-45oC 48-52oC 30-35oC 28-32oC Khả chuyển hoá đường lactose lactose saccarose glucose, pentose mantose, lactose S¶n phÈm L(+) lactic L(+) lactic L(+) lactic L() lactic L(-) lactic Hình 1.1 Hình thái vi khn Lactobacillus 1.1.3 øng dơng cđa vi khn lactic đời sống Trong thực tế, vi khuẩn lactic sử dụng nhiều lên men lactic để bảo quản thực phẩm Bản chất việc tạo môi trường acid giúp ngăn cản phát triển vi sinh vật gây thối, đồng thời tạo hương vị chua phù hợp với vị Acid lactic vi khuẩn lactic giúp kích thích tiêu hoá, tạo ngon miệng góp phần trì cân hệ vi khuẩn có lợi đường ruột Lên men lactic sử dụng phổ biến công nghiệp thực phẩm làm nem chua, hoa muối, công nghiệp sữa sản phẩm từ sữa - điển hình sữa chua, bơ, mát [13],[14],[21] Trong ngành dược acid lactic thường sử dụng dạng calci lactat natrilactat, thành phần chủ yếu dịch truyền Ringerlactat để bù nước điện giải cho bệnh nhân Ngoài calcilactat nguyên liệu chủ yếu cho thuốc giàu calci để bổ xung cho bệnh nhân bị thiếu calci dẫn đến co giật, rối loạn tâm thần bồi bổ cho phụ nữ có thai trẻ nhỏ để tránh còi xương, chậm lớn Chủng Lactobacillus acidophillus sử dụng nhiều chế phẩm men tiêu hoá Antibio, Lactomin để điều trị trường hợp rối loạn tiêu hoá loạn khuẩn ruột dùng kháng sinh dài ngày Sản phẩm giúp lập lại hệ cân vi sinh rt [10] Acid lactic còng ®ãng mét vai trò quan trọng ngành công nghiệp dệt, sản xuất sơn acid lactic tinh khiết sử dụng để sản xuất sản phẩm cao cấp khác 1.1.4 Một số nghiên cứu ứng dụng chi Lactobacillus Mặc dù nghiên cứu lên men lactic triển khai rộng rãi ứng dụng nhiỊu s¶n xt acid lactic phơc vơ cho nhiỊu ngành công nghiệp khác song nghiên cứu lên men lactic tiếp tục tiến hành giới Đã có thêm nhiều chủng vi khuẩn lactic phân lập, định tên đưa vào sản xuất acid lactic [31] Không vậy, nghiên cứu lên men liên tục để thay cho lên men gián đoạn triển khai Điển hình nghiên cứu bất động tế bào bất động L delbrueckii, Rhiropus oryzea để sản xt acid lactic b»ng lªn men liªn tơc [16],[26] Lactobacillus nghiên cứu ứng dụng sản xuất mét sè enzym nh­ phospho β glycosidase tõ chñng L delbrueckii, purine 2’ deoxyribosyltransferase tõ chđng L leichmanii, s¶n xt xylo-oligo saccharides tõ chñng L plantarum [22] Mét nghiên cứu khác Lactobacillus khả kháng khuẩn nhờ kháng sinh có chất peptid triển khai Thái Lan Nghiên cứu cho thấy có nhiều chủng nằm chi Lactobacillus có khả ức chế phát triển mét sè vi khuÈn vÝ dô nh­ S aureus, E coli, Shigella Các kháng sinh điển hình chiết suất nghiên cứu là: caseicin từ chủng L casei, plantaricin tư chđng L plantarum, curvacin tõ chđng L curvatus, brevicin từ chủng L bravis [30] Một mảng nghiên cứu lớn khác thuộc lĩnh vực công nghệ gen, nhiều chủng thuộc chi Lactobacillus giải trình tự gen tỉng hỵp ARN ribosom 16S, mét sè gen tỉng hỵp enzym phospho glycosidase, deoxyribosyltransferase nghiên cứu sâu [33] Một vài plasmid vi khuẩn nhóm tách chiết để làm vector biểu gen Đặc biệt lập đồ gen cña mét sè chñng nh­ L plantarum, L acidophillus phục vụ cho nghiên cứu di truyền vi sinh vật [20] 1.2.Các phương pháp định lượng vitamin B12 1.2.1 Phương pháp đo quang phổ Những mẫu vitamin B12 thử tương đối tinh khiết thường định lượng phương pháp đo quang phổ phương pháp so màu Các dược điển USP27, BP2001, dược điển Việt Nam III sử dụng phương pháp đo quang phổ dựa khả hấp thụ ánh sáng vitamin B12 bước sóng = 361nm vùng tử ngoại bước sóng =550nm vùng nhìn thấy [4],[11],[9],[32] Phương pháp tương đối đơn giản, nhanh dung dịch vitamin B12 đo quang có nhiều tạp chất, sản phẩm trình oxi hoá, sản phẩm thuỷ phân hay chất có công thức hoá học tương tự Những chất có quang phỉ hÊp thơ t­¬ng tù nh­ vitamin B12 lại hoạt tính sinh học làm phép đo xác Mặt khác, có vài chất cobalamin tương tự cyanocobalamin tác dụng sinh học hiệu điều trị lại hấp thụ quang phổ cực đại có bước sóng khác Vì vậy, nồng độ dung dịch vitamin B12 đo chưa hẳn xác 1.2.2 Phương pháp hoá học Phương pháp định lượng hoá học thực Fantes, vitamin B12 thuỷ phân dung dịch HCl đặc, nóng Dung dịch acid màu đỏ thu este hoá với alcol octylic Những tạp chất tách cách lắc nhẹ sản phẩm tạo thành với xăng nhẹ sau ®ã röa b»ng acid hydrocloric metanoic Cuèi cïng vitamin B12 định lượng phương pháp so màu Tuy nhiên phương pháp so màu không xác dung dịch có chất tương tự vitamin B12 đồng thời sản phẩm phân huỷ làm ¶nh h­ëng tíi kÕt qu¶ dï cho acid sinh trình thuỷ phân bị loại bỏ hết số giai đoạn tinh chế [24] Phương pháp không dùng để định lượng vitamin B12 mà có ý nghĩa lịch sử 1.2.3 Định lượng vitamin B12 phương pháp vi sinh vật Các kết nghiên cứu rằng, số vi sinh vật không phát triển phát triển chËm m«i tr­êng kh«ng cã vitamin B12, hay nãi cách khác, vitamin B12 nhân tố phát triển số loài vi sinh vật Kỹ thuật định lượng phương pháp vi sinh vật hay thực tiến hành ống nghiệm môi trường vô khuẩn sau: Dung dịch vitamin B12 chuẩn dung dịch vitamin B12 thử với nồng độ khác cho vào ống nghiệm sau cấy vi khuẩn lựa chọn để thử nghiệm ủ nhiệt độ thích hợp vòng 24h Mức độ phát triển vi khuẩn đo máy đo độ đục Mật độ quang phản ánh nồng độ trung bình vi khuẩn có vitamin B12 43 3.2 Bàn luận 3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic Có nhiều môi trường phương pháp khác sử dụng nghiên cứu phân lập vi khuẩn lactic Đa số báo cáo sử dụng môi trường có chứa lượng sữa đậu lành Tuy nhiên thấy rằng, môi trường chứa sữa phù hợp cho môi trường lỏng, với môi trường đặc khó nhận biết cách rõ ràng Hơn phân lập từ nguồn có tính chất tự nhiên vi khuẩn lactic nhiều vi sinh vật khác, gây khó khăn cho khâu lựa chọn làm khiết Nếu sử dụng môi trường phân lập với thị BCP đề tài thấy bất cập sử dụng sữa khắc phục Khả biến đổi màu thị cho phép cã thĨ lùa chän chÝnh x¸c c¸c vi khn cã khả sinh acid, không bị lẫn vi khuẩn tạp trình lựa chọn Do đặc điểm vi hiếu khí kị khí chủng vi khuẩn lactic nên phương pháp phân lập hai lớp thạch hoàn toàn phù hợp cho kết tốt Những kết nghiên cứu đồng với nghiên cứu trước phân lập vi khuẩn lactic Tuy lưu ý tới khâu cấy truyền làm khiết, sử dụng cấy zigzac đĩa Petri cần nuôi cấy tủ ấm CO2 với nồng độ 5%, nuôi cấy lỏng không cần có tủ CO Phương pháp cấy zigzac cho kết nhanh hơn, dễ thu chủng vi khuẩn sinh acid lactic khiết việc kiểm soát độ tinh môi trường lỏng khó Vì cách tốt cho phân lập vi khuẩn lactic từ tự nhiên dùng môi trường BCP sử dụng phương pháp hai lớp thạch §Ĩ cã thĨ tun chän chÝnh x¸c chđng vi khn sinh acid lactic từ chủng sinh acid phương pháp đơn giản, nhanh tương đối xác sử dụng sắc kí lớp mỏng Ngoài kết hợp với phương pháp kiểm tra 44 nhuộm Gram soi hình thái kính hiển vi cho kết xác Song trình thực đề tài, không tiến hành nhuộm Gram soi hình thái kính hiển vi mà thay vào kiểm tra nhanh khả hoà tan dung dịch NaOH Biện pháp không soi hình thái vi khuẩn để biết vi khuẩn thuộc nhóm Gram xác Do điều kiện phòng thí nghiệm kính hiển vi tốt nên tiến hành thêm bước tuyển chọn thông qua hình thái Nếu phân lập định tên dựa đặc điểm sinh lý sinh hoá thiết phải có đặc điểm hình thái cách tốt sử dụng kính hiển vi điện tử Đề tài không sâu vào nghiên cứu biện pháp phương pháp cho hiệu suất tổng hợp acid lactic cao mà chủ yếu dựa khả chủng hoang dại nên coi khả sinh tổng hợp acid lactic tiêu chuẩn để chọn chủng Lactobacillus tự nhiên phục vụ cho việc định tên phương pháp đọc trình tự gen 3.2.2 Phương pháp thử độ nhạy cảm vi khuẩn Lactobacillus vitamin B12 Đề tài tìm chủng Lactobacillus có độ nhạy cảm cao với vitamin B12 chủng nhiều khả sử dụng để định lượng vitamin B12 ë ViƯt Nam hiƯn chóng ta ch­a cã chđng sử dụng để định lượng vitamin B12 phương pháp vi sinh vật Để sử dụng chủng HL12 định lượng vitamin B12 cần thiết phải có chủng chuẩn sử dụng để đối chiếu Đó nguyên nhân mà đề tài chưa thực khâu đánh giá độ xác định lượng vitamin B12 chủng HL12 Chúng có ý tưởng so sánh độ xác định lượng vitamin B12 đo độ hấp thụ bước sóng 361nm định lượng theo phương pháp vi sinh vËt sư dơng chđng HL12 Tuy nhiªn xÐt vỊ độ tương đồng chưa thực 45 hợp lý, đồng thời mục đích sử dụng hai phương pháp không giống Cách tốt tìm chủng chuẩn sử dụng giới L.leichmanii hay E.coli M1133 để so sánh Trong qúa trình thí nghiệm, nhận thấy có nhiều yếu tố thuộc mặt kĩ thuật ảnh hưởng tới kết cuối Việc thử môi trường đặc cho phép quan sát dễ dàng nhạy cảm dễ cho kết âm tính nhiệt độ trộn vi khuẩn vào môi trường cao quá, hàm lượng thạch cao gây ảnh hưởng Riêng phương pháp nuôi cấy lỏng, sử dụng rộng rãi giới, quan sát dựa độ đục dịch nuôi cấy khó Phương pháp định lượng phải đo độ đục bước sóng 620nm tính toán phức tạp yếu tố ảnh hưởng môi trường đặc lại hạn chế Trong khuôn khổ điều kiện thí nghiệm chọn sử dụng môi trường đặc thí nghiệm mang tính thăm dò chủ yếu, chưa phải định lượng Nếu nghiên cứu sâu định lượng phương pháp nuôi cấy lỏng nên sử dụng 3.2.3 Định tên Lactobacillus phương pháp sinh học phân tử Cũng thao tác gen nào, điều muốn làm việc với đoạn gen cần nghiên cứu phải qua khâu tách chiết ADN gen Đã có nhiều qui trình tách chiết ADN tổng số công bố Trong đề tài sử dụng biện pháp hoá chất đơn giản, so với qui trình khác độ tinh ADN genom chưa cao, ADN có vài đoạn đứt gãy Tuy nhiên điều không ảnh hưởng tới kết nghiên cứu quan tâm tới gen ADNr 16S, nằm sợi ADN nhân Đoạn gen đoạn mồi nhận biết tiến hành chép thông qua phản ứng PCR mà không cần phải xác định xác vị trí đoạn gen 46 phân tử ADN Phương pháp hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu gen nằm ADN Trong chế độ chạy phản ứng PCR, đa phần qui trình chênh mét Ýt vỊ nhiƯt ®é, thêi gian cđa tõng giai đoạn tuỳ vào loại máy khác song kết cuối độ tinh sản phẩm PCR So với nghiên cứu PCR công bố độ tinh sản phẩm PCR nghiên cứu thấp Nguyên nhân có nhiều, đặc biệt vấn đề thao tác người làm Trong trình thực đề tài, lần tiếp xúc thực hành thao tác gen nên không tránh khỏi thiếu sót Tuy kết không ảnh hưởng tới kết đọc trình tự ADN trước đọc trình tinh sản phẩm PCR Hà Nội, hai nơi có máy đọc trình tự gen, hầu hết nghiên cứu trình tự so với giới độ xác không cao Trên số tạp chí lớn, nghiên cứu trình tự Việt Nam ít, chủ yếu phải so trình tự ADNr 16S chủng nghiên cứu với trình tự công bố ngân hàng gen quốc tế Trong kết nghiên cứu, chủng HL11 cho hiƯu st tỉng hỵp acid lactic cao nhÊt định tên L.delbrueckii điều phù hợp với nghiên cứu công bố Đây chủng sử dụng nhiều sinh tổng hợp acid lactic giới Có đến 300 kết trình tự ADNr 16S công bố ngân hàng gen quốc tế chứng tỏ chủng có khả phân bố rộng nhiều nơi giới nghiên cứu Độ tương đồng yếu tố quan trọng phân tích trình tự, chủng Lactobacillus delbrueckii có độ tương đồng cao với chủng công bố Trung Quốc sai khác nucleotid, với khu vực khác thấp mức độ sai khác cao Điều hoàn toàn bình thường phân loại đến loài, mức loài 47 chủng khác chưa đề cập Các khoá phân loại khác dừng mức loài Để giải vấn đề cần phân tích kỹ trình tự, thêm vài đặc điểm hệ gen plasmid để đưa phát sinh chủng giống Đối với chủng có độ nhạy cảm cao với vitamin B12 định tên Lactobacillus plantarum, Việt Nam chưa có công trình công bố tên khoa học chủng có khả nhạy cảm vitamin B12 Các nghiên cứu khác dừng lại mức tìm đựơc chủng, chưa nghiên cứu định tên Trên giới, biết đựơc chủng Lactobacillus leichmanii sử dụng để định lượng vitamin B12 Thử so sánh trình tự thành phần ADN chủng Lactobacillus delbrueckii chủng Lactobacillus plantarum nghiên cứu thấy rằng, trình tự ADNr 16S khác nhau, có vài đoạn tương đồng với độ dài từ 7-12 nucleotid, tỉ lệ nucleotid A, T, G, C giống Điều cho thấy có khả đoạn tương đồng đoạn bảo thủ vi khuẩn nói chung chi Lactobacillus nói riêng 48 kết luận đề xuất 4.1 Kết luận Đề tài phân lập 52 chđng vi khn sinh acid ®ã cã 21 chđng vi khuẩn có khả sinh acid lactic, 14 chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus Bước đầu khảo sát tìm chủng HL11 có khả sinh tổng hợp acid lactic cao Tìm ba chủng HL7, HL12, HL44 có khả nhạy cảm với vitamin B12 Trong chủng HL12 có độ nhạy cao Định tên phương pháp đọc trình tù gen ADNr 16S nhËn thÊy: chđng HL11 lµ Lactobacillus delbrueckii, chủng HL12 Lactobacillus plantarum 4.2 Đề xuất Nghiên cứu sản xuất acid lactic theo phương pháp lên men liên tục bất động vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii Nghiên cứu khả ứng dụng chủng Lactobacillus plantarum định lượng vitamin B12 phương pháp vi sinh vật Nghiên cứu số đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hoá hai chủng Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum để sử dụng vào thực tế ngành dược công nghiệp thực phẩm Danh mục kí hiệu, từ viết tắt BCP : Bromo cresol purple PCR : Polymerase chain reaction sds : Sodium docecyl sulfat adn : acid deoxyribose nucleic arn : Acid ribose nucleoic ADNr : acid deoxyribose nucleic Ribosom ARNr : Acid ribose nucleic Ribosom edta : Ethylen diamine tetra acetic acid dNTP : Deoxynucleotid triphotphat ddNTP : Dideoxynucleotid triphotphat Danh mục bảng Trang Bảng 1.1: Một số chđng Lactobacillus dïng s¶n xt acid lactic B¶ng 3.1: Mức độ phân bố phát triển vi khn sinh acid 29 B¶ng 3.2: KÕt qu¶ tun chän vi khuẩn Lactobacillus 31 Bảng 3.3: Khả biến đổi pH m«i tr­êng nu«i cÊy theo thêi 34 gian cđa vi khuẩn Lactobacillus Bảng 3.4: Kết thử độ nhạy cảm vitamin B12 Lactobacillus 36 danh mục hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1: Hình thái vi khuẩn Lactobacillus Hình 1.2: Cây phát sinh chủng giống dựa trình tự ADNr 16S 18 Hình 1.3: Phân lập vi khuẩn sinh acid môi trường BCP 30 Hình 3.2: Độ giảm pH môi trường nuôi cấy theo thời gian 35 Hình 3.3: Sự nhạy cảm Lactobacillus HL12 với vitamin B12 37 Hình 3.4: Kết điện di sản phẩm PCR 39 Mục lục Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng, hình vẽ, đồ thị Đặt vấn đề Chương Tổng quan 1.1 Quá trình lên men lactic 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn lactic 1.1.2 Chi Lactobacillus 1.1.3 øng dơng cđa vi khn lactic ®êi sống 1.1.4 Một số nghiên cứu ứng dụng chi Lactobacillus 1.2 Các phương pháp định lượng vitamin B12 1.2.1 Phương pháp đo quang phổ 1.2.2 Phương pháp hoá học 1.2.3 Định lượng vitamin B12 phương pháp vi sinh vật 1.3 ứng dụng sinh học phân tử định tên vi sinh vËt 1.3.1 Tr×nh tù ARN ribosom 1.3.2 Phản ứng PCR 11 1.3.2.1 Nguyên lý 11 1.3.2.2 Tiến hành phản ứng PCR 12 1.3.2.3 Kiểm tra phát sản phẩm PCR 13 1.3.2.4 Độ tin cậy phương pháp PCR 14 1.3.3 Xác định trình tự nucleotid ADN 15 1.3.3.1 Phương pháp xác định trình tự Maxam-Gilbert 15 1.3.3.2 Phương pháp xác định trình tự Sanger-Coulson 16 1.3.3.3 Điện di đọc trình tự 16 1.4 ¸p dơng c¸c kÜ tht sinh häc ph©n tư nghiên 17 cứu chi Lactobacillus Chương II: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 19 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 19 2.1.2 Nguyên liệu, hoá chất 19 2.1.2 Máy móc, thiết bị 19 2.1.3 Một số môi trường sử dụng nghiên cứu 20 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phân lập vi khuẩn sinh acid 21 2.2.2 Lùa chän c¸c chđng vi khn Lactobacillus 22 2.2.3 Sơ tìm chủng Lactobacillus có hiệu xuất tổng hợp acid 23 lactic cao 2.2.4 Thử độ nhạy cảm chủng Lactobacillus 23 vitamnin B12 2.2.5 Định tên Lactobacillus sinh học phân tử 24 2.2.5.1 Tách chiết ADN 24 2.2.5.2 Tiến hành phản ứng PCR 25 2.2.5.3 Phân tích trình tự ADNr 16S theo phương pháp 27 Sanger chương III: kết bàn luận 29 3.1 Kết 29 3.1.1 Phân lập vi khuẩn sinh acid 29 3.1.2 Tun chän chđng vi khn Lactobacillus 30 3.1.3 Đánh giá khả sinh tổng hợp acid lactic chủng 33 Lactobacillus 3.1.4 Thử độ nhạy cảm chủng Lactobacillus với vitamin 36 B12 3.1.5 Định tên Lactobacillus sinh học phân tử 38 3.1.5.1 Kết chạy PCR 3.1.5.2 Giải trình tự ADN gen tổng hợp ribosom 16S 3.2 Bàn luận 39 43 3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 43 3.2.2 Phương pháp thử độ nhạy cảm vi khuẩn Lactobacillus 44 vitamin B12 3.2.3 Định tên Lactobacillus phương pháp sinh học phân tử Kết luận đề xuất 45 48 4.1 KÕt ln 48 4.2 §Ị xt 48 Tài liệu tham khảo Tài liệu tham khảo Tiếng việt 1.Trần Thị Phương Anh (1999), Phân lập, sàng lọc tuyển chọn số chủng E.coli Lactobacillus để định tính định lượng vitamin B12, khoá luận tốt nghiệp dược sỹ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội Lê Trần Bình (2003), áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật ViƯt Nam”, NXB khoa häc kü tht Hµ Néi, Tr 46-48 Bùi Xuân Đồng (2004), Kiểm nghiệm thuốc phương pháp vi sinh vật, NXB Hà Nội, Tr 32-35 Dược điển Việt Nam III (2003), Tr 85-87 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ë ViƯt Nam, ln ¸n tiÕn sÜ sinh häc, Tr­êng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Lê Thanh Hoà (2002), Bài giảng Sinh học phân tử, nguyên lý øng dơng”, ViƯn c«ng nghƯ sinh häc, Tr 84-102 Từ Minh Koóng (1994) Bài giảng Định lượng vitamin B12 phương pháp vi sinh vật, Trường Đại học Dược Hà Nôị Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở công nghệ sinh học sản xuất dược phẩm, NXB Y Học, trang 27-40, 121-133 Lê Đình Lương (2001), Nguyên lý kÜ thuËt di truyÒn”, NXB khoa häc Kü thuËt, Tr 31-34 10 Hà Vân Oanh (2000), Lên men lactic tạo chế phẩm lactatcalci-sữavitamin B12 dùng làm thuốc bồi bổ cho trẻ em, khoá luận tốt nghiệp dược sỹ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội 11 Nguyễn Xuân Thắng (2003), Hoá sinh dược lý phân tử, NXB khoa học kỹ thuật, trang 69-95 12 Cao Văn Thu (1997), Tối ưu hóa trình lên men acid L-lactic, tạp chí dược học số 3, Hà Nội Tiếng Anh 13 Ani Idish, Wahidn Suzana, (2006) “Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii“ ScienceDirect, Process Biochemistry 41, page 1117-1123 14 Arnold L, Demain, Julian E Davies, (1999), Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, page 174-176 15 Ausubel, Federick M, Brent Robert, Davide D Moore, (1999), Short protocol in molecular biology, puslished by Jonh Wiley, Inc, page 13-50 16 B.del Ri, A.G Bineti, M.C Martin (2006) “Multiplex PCR for the detection and identification of dairy bacteriophage in milk” Elsevier, Food Microbiology 24, page 75-81 17 Bartlomiej Dziuba, Anderrej Babuchowski (2006) “ Identification of lactic acid bacteria using FTIR spectroscopy and cluster analysis” ScienceDirect, International Dairy Journal 17 page 183-189 18 Brian P.Kelleher, Kleran G.Washi (1987) “Microbiologycal assay for vitamin B12 with use colistin-sulfate- Resistant organism” Clinical chemistry 33/1 page 52-54 19 Bristish pharmacopoeia (2005), page 2592-2594 20 Daniela M Guglielmottti, Jorge A Reinheimer, Ana G Binetti, (2006), “Characterization of spontaneous phage resistant derivatives of Lactobacillus delbrueckii commercial strain”, Science Direct International Journal of Food, Micobiology 111, page 126-133 21 Horishi Ohta, William S Beck, (1976) “ Studies of the Ribosomeassociated vitamin B12 adenosylating Enzym of Lactobacillus leichmanii” Achives of Biochemistry and Biophysics 174, page 713-725 22 http:/biosci.cbs.umn.edu/asire/protocol.html 23 Kharidah muhammad, David Briggs (1993), “The appropriateness of using cyanocobalamin as calibration standart in Lactobacilus leichmanii ATCC 7830 assay of vitamin B12” Food chemistry 48, page 427-429 24 Lester Smith (1972) analysis vitamin B12, Glaxo laboratories 25 Robert W.Bauman (2004), International Edition Microbiology, puslished by Pearson Benjamin, San Francisco 26 Ruma Ganguly, Pallawi Dwivedi, (2006) “Production of lactic acid with loofa sponge immobilized Rhiropus oryzae RBU 2-10” ScienceDirect Bioresouce Technology 98, page 1256-1251 27 Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning volume I page 5.145.86, Cold spring Habbor, New York 28 Shaofing Ding, Tianwei Tan, (2006) “L-lactic acid production by Lactobacillus casein fermentation using different fed-batch feeding strategies” Elsevier, Procees Biochemistry 41, 1451-1454 29 Stakebrant, E Liesack (1993), Nucleic acid and classification, O’Donnell, A.G London: Acedamic press, page 195-250 30 Suwan Thirawarapan (2002), “Characterization and antimicrobial spectrum of bacteriocin C3 produced by Lactococus lactic C3” Mahidol University 31 Tiina Michelson, Karin Kask, Allan Nurk (2006) “L(+)-lactic acid producer Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 and its comparison with Lactobacillus delbrueckii ssp.lactic DSM20073” ScienceDirect Enzym and Micobioal Technology 39, page 861-867 32 United States pharmacopoeia 27, page 499- 501 33 Yiting Kao, Yu-Shan Liu, (2006) “ Identification of Lactobacillus spp in probiotic product by real time PCR and meeting curve analysis” ScienceDirect Food Reseach International 40, page 71-79 ... dược hà nội lê xuân hoành phân lập, tuyển chọn, phân loại số chủng Lactobacillus sinh acid lactic mạnh nhạy cảm với Vitamin b12 Chuyên ngành: Công nghệ Dược phẩm Bào chế Mã số: 60 73 01 luận văn... lactic mạnh nhạy cảm với vitamin B12 theo mục tiêu: Ph©n lËp, tun chän vi khn Lactobacillus cho hiƯu st tổng hợp acid lactic mạnh Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus nhạy cảm vitamin B12. .. lượng vitamin B12 nồng độ thấp dạng hỗn hợp nhiều thành phần mà phương pháp phân tích hoá lý không thực Chính vậy, chọn đề tài: Phân lập, tuyển chọn, phân loại số chủng Lactobacillus sinh acid lactic