Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12 Phận lập, tuyển chọn, phân loại một số chủng lactobacillus sinh acid lactic mạnh và nhạy cảm với vitamin b12
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ XUÂN HOÀNH
PHÂN LẬP, TUYẾN CHỌN, PHÂN LOẠI MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS
SINH ACID LACTIC MANH VÀ
NHAY CAM VOI VITAMIN B12
LUAN VAN THAC SI DUGC HOC
HA NOI -2006
Trang 2
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ XUÂN HOÀNH
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, PHÂN LOẠI
MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS
SINH ACID LACTIC MANH VA NHAY CAM VOI VITAMIN B12
Chuyên ngành: Công nghệ Dược phẩm và Bào chế
Mã số: 60 73 01
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TỪ MINH KOÓNG
HÀ NỘI -2006
Trang 3
PGS.TS Tir Minh Koong- ngwéi thây đã trực Hếp tận tình hướng
dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này Toi citing xin chan thanh cam on PGS Ts Cao Văn Thu, TS Dam Thanh Xuân, đã đóng góp những ý Riến quí báu cho tôi rong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn Tế Vii Nguyén Thanh- Viện công nghiệp thực phẩm cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của thâỳ
cho tôi trong quá frình thực hiện đề tài
Toàn thành luận văn này tôi cũng đã nhận được nhiều sự giúp
đỡ của các thây cô và đồng nghiệp bộ môn €ông nghiệp Được,
phòng Dao tao sau đại học frường Đại học Được Bà Bội
Cuối cùng tôi xin gửi lời cam ơn sâu sac tới gia đình, bạn bè
những người đã luôn Rhích lệ và động viên tôi đạt được những thành công ngày hôm nay
Hà Nội, tháng 12 năm 2006
Trang 4người, đặc biệt trong lĩnh vực y học, dược học Tuy vậy ở Việt Nam nói chung, trường Đại học Dược Hà Nội nói riêng, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu, sản xuất thuốc, nguyên liệu làm thuốc vẫn
chưa được chú ý và phát triển mạnh mẽ
Ở Việt Nam, do đặc điểm khí hậu nên nhóm vi khuẩn lactic có ở khắp mọi
nơi Vì thế mà ngành công nghiệp thực phẩm dùng các quá trình lên men
lactic để chế biến, bảo quản thực phẩm, ngành dược nghiên cứu quá trình lên
men lactic và sử dụng vi khuẩn lactic vào nhiều mục đích khác nhau Ví dụ
san xuat acid lactic tir Lactobacillus chiém 35% trong céc nguồn sản xuất acid
nay, tao calcilactat, sữa chua có chứa calcilactat và vitamm B12 làm thực
phẩm chức năng điều trị còi xương Thêm vào đó nhóm vi khuẩn lactic còn
được dùng sản xuất nhiều chế phẩm thuốc như: Antibio, Lactomin Đặc biệt nhóm vi khuẩn này còn được dùng làm vi khuẩn kiểm định để định lượng vitamin B12 ở nồng độ thấp và trong dạng hỗn hợp nhiều thành phần mà các
phương pháp phân tích hoá lý không thực hiện được Chính vì vậy, chúng tôi
chon dé tai: “Phan láp, tuyển chọn, phân loại một số chủng Lactobacillus
sinh acid lactic manh va nhay cam voi vitamin B12” theo các mục tiêu:
1 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lacfobacilius cho hiệu suất tổng hợp
acid lactic manh
2 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus nhay cảm vitamin B12
3 Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử chung Lactobacillus tuyển chọn được
Trang 51.1.1 Đặc điểm vi khudn lactic
Vi khuẩn sinh acid lactic nằm chủ yếu trong các chi Lactobacillus,
Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobarterium, Lactococcus Viéc phân loại vi khuẩn lactic được mô tả khá rõ trong khoá phân loại của Bergey và khoá phân loại Prokaryot Ngoài ra một số loài nấm thuộc chi Rh¡zopus cũng có khả năng tạo acid lactic từ các nguồn khác nhau Nhìn chung tất cả các vi khuẩn
lactic đều là những chủng ưa nhiệt, hô hấp yếm khí hoặc vi hiếu khí Đa số các vi
khuẩn trong nhóm này là Gram dương, chúng không có khả năng di động và hầu hết không tạo bào tử [10],[1]
Hình dạng và kích thước của vi khuẩn lactic tương đối đa dạng, có thể là hình
cầu, hình que, có thể là các tế bào đơn độc hoặc liên kết tạo chuỗi Nhóm vi
khuẩn này có thể sinh trưởng tốt trong điều kiện pH thấp, pH tối thích của chúng
là từ 3,5-5, chúng có khả năng đồng hoá nhiều loại đường khác nhau như đường ølucose, lactose, manfose, saccarose Nhờ những đặc điểm này mà nhóm vi
khuẩn lactic có nhiều ưu thế trong bảo quản thực phẩm, đã có từ rất lâu đời trong
lịch sử phát triển của loài người [12],[1] Cho đến những năm đầu của thế ký 20,
các nghiên cứu về quá trình lên men lactic mới được nghiên cứu nhiều và áp
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là thực phẩm và dược phẩm Đến nay, những nghiên cứu về sự lên men lactic vẫn tiếp tục được nghiên
cứu trên thế giới
1.1.2 Chi Lactobacillus
Trang 6hình Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là acid lactic, chiếm khoảng 90- 98% các sản phẩm khác chỉ xuất hiện dưới dạng vết rất nhỏ Trong quá trình
chuyển hoá, acid lactic được tạo thành thông qua chu trình EMP Hình thái và kích thước của nhóm này phụ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy, thông
thường có dạng hình que, hình sợi, sinh sản theo hình thức phân chia tế bào
Nhiệt độ thích hợp cho nhóm này phát triển là 40-60°C đối với loài ưa nhiệt và 28-35°C với loài ưa ấm Đại diện điển hình cho nhóm này 1a L acidophillus, L
bulgaricus, L delbrueckii [12],[17]
Nhóm II: Gồm những chủng thuộc loại lên men lactic dị hình không bắt buộc,
sản phẩm quá trình lên men có thể là acid lactic, acid acetic, acid formic, va
ethanol Việc lên men là đồng hình hay dị hình tuỳ thuộc vào loại đường cung cấp trong môi trường Nếu là đường sáu C như glucose, hexose, frutose thì được lên men đồng hình, còn nếu là các đường khác như pentose thì lên men dị hình tạo acid lactic nhờ sự cảm ứng của enzym phosphoketolase Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy nhóm này có xu thế sử dụng quá trình lên men đồng hình hơn và một số loài có thể tồn tại cả hai quá trình lên men theo hai cơ chế khác nhau Đại diện cho nhóm này là các chủng L pÏantarwm, L casei, L helvesficus,
L leichmanii [30],[10]
Nhóm II: Nhóm này là các chủng lên men di hình bắt buộc, chuyển hoá
ølucose theo con đường ED, tạo ra sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là
acid lactic, acid acetic, CO;, ethanol trong đó đường 5C được chuyển hoá thành
acid lactic và acid acetic Các vi khuẩn trong nhóm này chủ yếu dạng hình que
Trang 72-Bang 1.1: Mét s6 chung Lactobacillus dùng trong sản xuất lactic
STT Ching Nhiệtđộ | Khả năng chuyển | Sản phẩm
ưa thích | hoá đường
1 L acidophillus | 37-45°C lactose L(+) lactic
2 L bulgaricus 40-45°C lactose L(+) lactic
3 L delbrueckii | 48-52°C saccarose L(+) lactic 4 L plantarum 30-35°C_ | glucose, pentose | L(_) lactic
5 L casei 28-32°C | mantose, lactose | L(-) lactic
Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus
1.1.3 Ung dụng của vi khuẩn lactic trong đời sống
Trong thực tế, vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều nhất trong lên men lactic
để bảo quản thực phẩm Bản chất là việc tạo ra môi trường acid giúp ngăn cản sự
phát triển của các vi sinh vật gây thối, đồng thời tạo hương vị chua phù hợp với khẩu vị Acid lactic và vi khuẩn lactic còn giúp kích thích tiêu hoá, tạo sự ngon miệng và góp phần duy trì sự cân bằng hệ vi khuẩn có lợi trong đường ruột Lên men lactic được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm như làm nem
chua, hoa quả muối, công nghiệp sữa và các sản phẩm từ sữa - điển hình là sữa
Trang 8cho các thuốc giàu calci để bổ xung cho bệnh nhân bị thiếu calci dẫn đến co giật,
rối loạn tâm thần hoặc bồi bổ cho phụ nữ có thai và trẻ nhỏ để tránh còi xương,
chậm lớn
Ching Lactobacillus acidophilius còn được sử dụng nhiều trong các chế
phẩm men tiêu hoá như Antibio, Lactomin để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hoá do loạn khuẩn ruột vì dùng kháng sinh dài ngày Sản phẩm này sẽ giúp lập
lại hệ cân bằng vi sinh trong ruột [10]
Acid lactic cũng đóng một vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp như đệt, sản xuất sơn và acid lactic tỉnh khiết còn sử dụng để sản xuất các sản
phẩm cao cấp khác
1.1.4 Một số nghiên cứu và ứng dụng mới của chi Lactobacillus
Mặc dù các nghiên cứu về lên men lactic đã được triển khai rộng rãi và ứng dụng nhiều trong sản xuất acid lactic phục vụ cho nhiều ngành công nghiệp khác
nhau song các nghiên cứu về lên men lactic vẫn tiếp tục được tiến hành trên thế
giới Đã có thêm rất nhiều chủng vi khuẩn lactic mới được phân lập, định tên và
đưa vào sản xuất acid lactic [31] Không chỉ vậy, hiện nay các nghiên cứu về lên men liên tục để thay thế cho lên men gián đoạn đã được triển khai Điển hình là
các nghiên cứu về bất động tế bào như bất động L delbrueckii, Rhiropus oryzea
để sản xuất acid lactic bằng lên men liên tục [16],[26]
LactobacilÏlus còn được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất một số enzym nhu phospho ÿ glycosidase từ chung L delbrueckii, purine 2’ deoxyribosyltransferase tir chung L leichmanii, san xuat xylo-oligo saccharides
Trang 9ức chế sự phát triển của mot s6 vi khuan vi du nhu S aureus, E coli, Shigella Các kháng sinh điển hình được chiết suất và nghiên cứu là: caseicin từ
chủng L casei, plantaricin tử chung L plantarum, curvacin ttt chung L curvatus,
brevicin tir chung L bravis [30]
Một mảng nghiên cứu lớn khác thuộc lĩnh vực công nghệ gen, rất nhiều các chủng thuộc chỉ Løcfobacilius đã được giải trình tự gen tong hop ARN ribosom 1S, một số gen tổng hợp các enzym như phospho _ glycosidase, deoxyribosyltransferase cũng đã được nghiên cứu sâu [33] Một vài plasmid của
vi khuẩn nhóm này cũng được tách chiết để làm vector biểu hiện gen Đặc biệt
hơn nữa là lập ban d6 gen cua mét s6 chung nhu L plantarum, L acidophillus
phục vụ cho các nghiên cứu di truyền vi sinh vật [20]
1.2.Các phương pháp định lượng vitamin B12
1.2.1 Phương pháp đo quang phổ
Những mẫu vitamin B12 thử tương đối tinh khiết thường được định lượng
bằng phương pháp đo quang phổ hoặc phương pháp so màu Các dược điển USP27, BP2001, dược điển Việt Nam III đều sử dụng phương pháp đo quang phổ
dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng của vitamin B12 ở bước sóng ^ = 36lnm
trong vùng tử ngoại và bước sống À =550nm trong vùng nhìn thấy [4].[11],I9],[32] Phương pháp này tương đối đơn giản, nhanh nhưng trong dung
dịch vitamin B12 đo quang có rất nhiều tạp chất, có thể là sản phẩm của những
quá trình oxi hoá, sản phẩm thuỷ phân hay những chất có cơng thức hố học
Trang 10vậy, nồng độ dung dịch vitamin B12 đo được chưa hẳn đã chính xác 1.2.2 Phương pháp hoá học
Phương pháp định lượng hoá học đầu tiên được thực hiện bởi Fantes, trong đó vitamin B12 được thuỷ phân bằng dung dịch HCI đặc, nóng Dung dịch acid màu đỏ thu được sẽ được este hoá với alcol octylic Những tạp chất sẽ được tách ra
bằng cách lắc nhẹ sản phẩm tạo thành với xăng nhẹ rồi sau đó rửa bằng acid
hydrocloric metanoic Cuối cùng vitamin B12 sẽ được định lượng bằng phương pháp so màu Tuy nhiên phương pháp so màu cũng sẽ không chính xác nếu dung dịch có những chất tương tự như vitamin B12 đồng thời các sản phẩm phân huỷ cũng làm ảnh hưởng tới kết quả dù cho acid sinh ra trong quá trình thuỷ phân có thể bị loại bỏ hết trong một số giai đoạn tinh chế [24] Phương pháp này hiện nay không được dùng để định lượng vitamin B12 mà chỉ có ý nghĩa lịch sử
1.2.3 Định lượng vitamin B12 bằng phương pháp vì sinh vật
Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, một số vi sinh vật không phát triển hoặc phát triển chậm trong môi trường không có vitamin B12, hay nói cách khác, vitamin B12 là nhân tố phát triển của một số loài vi sinh vật Kỹ thuật định lượng bằng phương pháp vi sinh vật hay thực hiện nhất hiện nay là tiến hành trong các
ống nghiệm ở môi trường vô khuẩn như sau: Dung dịch vitamin B12 chuẩn và
dung dịch vitamin B12 thử với những nồng độ khác nhau được cho vào các ống
nghiệm sau khi đã cấy vi khuẩn được lựa chọn để thử nghiệm và ủ ở nhiệt độ
thích hợp trong vòng 24h Mức độ phát triển của vi khuẩn được đo bằng máy đo
Trang 11Một phương pháp khác cũng được sử dụng phổ biến là tiến hành trên đĩa
Petri, phương pháp này đối ngược với phương pháp định lượng kháng sinh Trong phương pháp này môi trường dinh dưỡng được làm đặc với agar và trộn với vi
khuẩn rồi đổ vào đĩa Petri Dung dịch vitamin B12 thử và dung dịch vitamin B12
chuẩn được nhỏ vào các lỗ đục sẵn trong môi trường thạch Sau một thời gian ủ,
vitamin B12 sẽ khuyếch tán ra môi trường xung quanh và kích thích vi khuẩn
phát triển Đo đường kính vòng vi khuẩn phát triển của cả hai loại dung dịch rồi
tính kết quả nồng độ vitamin B12 cần xác định
Trong cả hai phương pháp, sự phát triển của vi khuẩn tỉ lệ với logarit nồng độ
của dung dịch vitamin B12 và được biểu diễn bằng đường cong logarit trên đồ
thị Mặc dù vậy, phương pháp này không phải lúc nào cũng dễ thực hiện vì một
số vitamin B12 liên kết với protein huyết tương hoặc không chọn được chủng vi
sinh vật kiểm định phù hợp [7],[3],[18] Tuy nhiên phương pháp định lượng vi
sinh vật tương đối nhạy và được sử dụng trong trường hợp không áp dụng được
phương pháp so màu hoặc phương pháp hoá học Đặc biệt việc định lượng bằng phương pháp vi sinh còn cho phép phân biệt vitamin B12 có hoạt tính sinh học và các chất tương tự trong mẫu thử một cách chính xác, đây là ưu điểm mà các
phương pháp khác không có được Dưới đây là một số chủng vi khuẩn thường
dùng để định lượng vitamni B12 bằng phương pháp vi sinh vật:
Lactobacilii: Ching dau tién duoc Shorp su dung 1a Lactobacillus lactic
Donner Chủng này sau đó được thay thế bằng chủng Lactobacillus leichmanii
đưa ra kết quả chính xác hơn Phương pháp này đã được Campell thẩm định lại
Trang 12Eescherichia coli: Dracis va Mingioli da thu duoc mot s6 chung E.coli dot
biến cần có vitamin B12 trong môi trường phát triển Công trình của họ được
phong thi nghiém Glaxo Laboratories thu nghiém định lượng vitamin B12 với
chung E.coli đột biến M.1133 trong hộp Petri Burkholder cũng thử nghiệm với phương pháp định lượng trong ống nghiệm và cho kết quả khả quan E coli có phần kém nhạy cảm hơn Lzcfobaciiii nhưng môi trường định lượng đơn giản hơn
nhiều và cho kết quả đáng tin cậy trong những định lượng thông thường [7],[10] Euglena gracis: Hunter và cộng sự đã đưa ra một loại vi khuẩn hoàn toàn mới để định lượng vitamin B12 khi phát hiện thấy Euglena gracis cần có vitamin B12
trong quá trình quang hợp Vi khuẩn này phát triển trong môi trường khá đơn
giản và rất nhạy trong các phản ứng định lượng vitamin B12 Tuy vậy, tốc độ
phát triển của vi khuẩn rất chậm nên phải cần tới 4-5 ngày để định lượng Mặt
khác Robbins còn nhận thấy rằng Euglena gracis không đặc hiệu, nó còn nhạy cảm với cả những chất tương tự vitamin B12 [10]
1.3 Ứng dụng sinh học phân tử trong định tên vi sinh vat
Phương pháp phân loại vi sinh vật trước đây chủ yếu dựa vào hệ thống phân loại cổ điển căn cứ vào đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hoá còn thiếu tính ổn
định Ngày nay, công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã giúp cho việc định tên các loài nhanh, chính xác với độ tin cậy cao hơn Hàng loạt các ứng
dụng trong phân tích trình tự ADN đã được triển khai trên thế giới để định tên
Trang 13với phương pháp phân loại kinh điển
1.3.1 Trình tự ARN ribosom [5;2]
Hiện nay đa số các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương
đồng về trình tự ARNr phản ánh mối quan hệ tiến hoá giữa các cá thể vi sinh vật
Tất cả các loài vi sinh vật trong sinh giới đều sử dụng cách thức tổng hợp protein
nhờ ribosom Vì vậy, tiến hành so sánh trình tự nucleotid của gen mã hoá ARMNr ở các vi sinh vật khác nhau để xác định mối quan hệ họ hàng và sự tiến hoá giữa
chúng ARNr là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của vi sinh vật
và mối quan hệ giữa chúng bởi vì chúng là thành phần cơ bản có trong mọi tế bào
vi sinh vat Vai tro và chức năng của chúng là giống nhau ở các ribosom Các
nghiên cứu cũng cho thấy rằng, cấu trúc không gian của phân tử ARNr rất giống nhau giữa các loài vi sinh vật khác nhau Tức là cấu trúc của chúng thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói khác đi là các gen mã hoá cho chúng được bảo tồn rất bền vững và chặt chẽ trong quá trình tiến hoá Tốc độ thay đổi các gen này trong quá trình tiến hoá là rất chậm, nguyên nhân có lẽ là bởi vì sự ốn định là tính chất quan trọng nhất của chúng
Nhìn chung, các gen mã hoá cho ARNr rất bền vững (bảo thủ), tuy vậy ngay
trong bản thân các gen bền vững cũng chứa những vùng có mức độ bền vững cao
hơn và các vùng có mức độ bền vững thấp hơn (vùng biến đổi) Điều này xảy ra
là do các vùng gen đó mã hoá cho những vùng không gian khác nhau của phân tử
ARNr Trong quá trình tiến hoá, các vùng gen đó có thể bị những đột biến nhất
Trang 14làm thay đổi và ảnh hưởng tới cấu trúc không gian cla ARNr, ft anh hưởng đến
quá trình sinh tổng hợp protein của sinh vật Còn những đột biến trong những
vùng không gian quan trọng làm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein
của cơ thể thì ngay lập tức sẽ bị chọn lọc tự nhiên đào thải
Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho phân tử ARNr các nhà
khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuyếch đại các vùng biến đổi So sánh sự khác biệt giữa các vùng này để chỉ ra được những sự khác biệt
giữa các loài gần gũi Theo Robert W Bauman nếu hai loài vi khuẩn có sự khác biệt về trình tự gen ARNr 16S lớn hơn 3% thì có thể xem là hai loài khác nhau Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23S 1a
lớn hơn so với phân tử ARN 16% Tuy vậy trình tự đã xác định hoàn chỉnh của
gen ARNr 23S 1a rat it trong khi đó trình tự gen của ARN 16S là khá phong phú
và được công bố rộng rãi trên ngân hàng gen thế giới Chính vì vậy phương pháp
giải trình tự gen mã hoá ARNr 16S để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh chủng
loại của vi sinh vật vẫn là lý tưởng nhất
Lần xuất bản thit tu cua ca “Bergey manual of Systemmatic Bacteriology” và
“The Prokaryote” đều dựa vào tiêu chuén ARN 16S làm tiêu chuẩn phát sinh loài
tương ứng của vi sinh vật Chính vì vậy có thể nói phương pháp xác định trình tự
gen ARNr 16S là phương pháp phân tử phổ biến nhất được dùng để định loại vi khuẩn
Cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) được xây dựng dựa trên các khoảng cách đã tính toán Nó đang trở thành một công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân loại ở các cấp độ cao hơn chi Sự tương đồng giữa phép phân loại dựa trên các
đặc điểm kiểu hình và cây phát sinh đã và đang được nghiên cứu một cách rộng
Trang 151.3.2 Phan ting PCR (Polymerase Chain Reaction) 1.3.2.1 Nguyén ly
Phản ứng PCR được phát hiện vào những năm 1980, đã tạo một bước đột phá trong cuộc cách mạng di truyền học phân tử Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích gen, hệ gen
PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá
trình sao chép ADN có sự tham gia của enzym ADN-polymerase chịu nhiệt với hai đoạn ngắn ADN một sợi làm mồi và dùng các đoạn ADN mạch đơn làm
khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ xung với nó Do vậy để khởi đầu quá trình
tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotid (6-30 nucleotid) Đoạn này
sẽ gắn kết với ADN khuôn tại điểm khởi đầu quá trình sao chép và được ADN- polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADN đặc thù Chuỗi xoắn kép
ADN được nâng nhiệt độ lên trên 90°C (92-98° C) sẽ bung ra thành các sợi đơn
để làm khuôn [16],[6],[9]
Cả hai sợi ADN đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp ADN nếu
các đoạn mồi (primer hoặc oligonucleotid) được cung cấp đủ và bám vào vị trí tương ứng ở cả hai sợi Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở hai
đầu của đoạn ADN nhân lên để cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm nằm giữa hai đoạn mồi
Độ đài của sản phẩm PCR có thể vài trăm đến vài chục ngàn cặp nucleotid
Trang 16Sau n chu kỳ của phản ứng, sẽ có 2° bản sao các phân tử ADN mạch kép Với
những ưu điểm như vậy, PCR đã nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi trong việc
chẩn đoán các bệnh về vius, vi khuẩn, các bệnh kí sinh trùng Mặt khác, việc
phân tích thành phần, trình tự nucleotid trên phân tử ADN trong hệ gen có giá trị quan trọng trong phân loại các loài sinh vật
1.3.2.2 Tiến hành phản ứng PCR [6].[33]
PCR là một kỹ thuật tương đối dễ làm, vật liệu khởi đầu là ADN có chứa đoạn cần nhân lên Không phải lúc nào cũng cần thiết phải tách chiết đoạn cần nhân
lên vì công việc này có thể được các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định ADN làm khuôn tinh khiết thì phản ứng PCR rất nhạy và đặc hiệu, hàm lượng
ADN làm khuôn thường khoảng 1-100 ng ADN tổng số của hệ gen là đủ
Nguyờn liu
đ ADN khuụn
eâ_ Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN
e Enzym chịu nhiệt ADN-polymerase, hay dùng là taq, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaficus
e Hé6n hop của tất cả 4 tiền chất deoxynucleotid (ở dạng dNTP)
e Môi trường đệm cung cấp ion Mg”” và nước tinh khiết (không có
ADNase, ARNase ) Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR thông
thường là 5Oul hoặc 20UI
Các giai đoạn của phản ứng PCR
e Bung lién kết của ADN (denaturafion): Được thực hiện ở nhiệt độ 90-98°C trong vài giây đến vài phút Ở nhiệt độ này, các phân tử ADN
Trang 17e Modi bam: Hay còn gọi là ủ mồi (annealing), sau bước đầu tiên, ngay lập tức, nhiệt độ hạ xuống còn 37- 68°C để các đoạn mồi bám vào các trình
tự bổ xung tương ứng trên các phân tử ADN làm khuôn
e Téng hop: Hay còn gọi là kéo đài (extension), nhiệt độ ngay lập tức được nâng lên 68-72°C trong vài chục giây đến vài chục phút để các sợi
ADN vừa tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép, chính là sản phẩm
PCR
Phan ứng xảy ra với 25-40 chu kỳ và tiếp tục cho đến chu kỳ cuối cùng Sau
chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72°C trong 5-10 phút để tất cả sợi ADN trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR Cuối cùng nhiệt độ hạ xuống 4°C
để bảo quản Phương pháp PCR không đòi hỏi ADN với số lượng lớn, nên có thể sử dụng trực tiếp ADN mẫu vật để làm khuôn mà không cần phải nuôi cấy
1.3.2.3 Kiểm tra và phát hiện sản phẩm PCR [6].[2].[5]
Sử dụng phương pháp điện di trên gel (thạch) agarose 0,8-2% để phát hiện và đánh giá các sản phẩm PCR Phương pháp này cho phép các acid nucleic hiển thị trực tiếp và dua trên một đặc điểm là các acid nucleic ở pH trung tính tích điện âm nhờ các nhóm photphat nằm trên gốc photphodiester của các sợi acid nucleic
Khi nằm trong một điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển về cực đương Khả năng chuyển dịch của các acid nucleic phụ thuộc vào kích thước, các acid có phân tử lượng lớn sẽ chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ di chuyển nhanh hơn
Trang 18Quá trình điện di được thực hiện bằng cách đưa mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó cho đến khi chất nhuộm đánh dấu (thường là xanh
bromophenol) chạy tới đầu cuối của gel Các acid nucleic ở trên gel thường được
hiển thị khi nhuộm bằng ethidium bromid và được quan sát dưới ánh sáng tử
ngoại Các acid nucleic sẽ hiện lên ở dải băng màu trắng, kích thước các băng ADN so sánh với chỉ thị di truyền (ADN marker) được cho vào cùng lúc với sản
phẩm PCR ở một lỗ riêng biệt cạnh các lỗ dùng phát hiện sản phẩm PCR
ADN marker hay dùng nhất là ADN của thực khuẩn thể Lamda có chiều dài
43kb, được cắt bằng enzym giới hạn HindIII ADN cia thực khuẩn thé nay được
enzym giới hạn cắt thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb Tuy nhiên trên thực tế chỉ nhìn thấy 7 băng, còn
băng có chiều dài 0,125kb thì rất khó phát hiện Nhờ các chỉ thị di truyền này mà người ta xác định được độ dài của đoạn PCR sản phẩm
1.3.2.4 Độ tin cậy của phương pháp PCR [6].[2]
Giống như quá trình sinh học trong tự nhiên, tái bản ADN là một q trình
khơng hồn hảo, đôi khi enzym ADN polymerase cũng nhân nhầm một nucleotid không bổ xung vào chuỗi đang kéo dài của mình, tỷ lệ này trong tự nhiên khoảng
10 Trong tế bào, các bazơ không bổ xung này được một hệ thống sửa sai ngay
nhưng trong invitro Taq-polymerase không có khả năng sửa chữa những bazo
nhân nhầm Do vậy cứ tổng hợp 2*10' nucleotid bằng PCR thì có thể có một
nucleotid không chính xác Tuy nhiên sai sốt này không thực sự đáng ngại vì trong ống nghiệm cùng một lúc có nhiều tập hợp phản ứng cùng nhân một đoạn
ADN giống nhau nên số ADN có một nucleotid sai sót là không lớn và sẽ được điều chỉnh chính xác sau khi so sánh các chuỗi khác nhau của cùng đoạn gen
Trang 19qua vecfor trong vi khuẩn E colï cũng có thể gây nguy hiểm sai khác với vật liệu
ban đầu
1.3.3 Xác định trình tự nucleofid của ADN
Xác định trình tự của các bazơ nucleotid trong ADN là phần trung tâm của sinh học phân tử hiện đại, nó cung cấp những thông tin cấu trúc quan trọng Các phương pháp phân tích nhanh trình tự đã được hoàn thiện vào cuối những năm 70 và kỹ thuật này ngày nay được sử dụng rong rai [9],[2],[25]
Có thể xác định trình tự nucleotid thông qua trình tự acid amin Tuy nhiên, bộ
ba mã hoá của 20 acid amin thường có một số nucleotid trùng lặp cho nên trình
tự ADN thu được chỉ đúng tương đối
Kỹ thuật điện di phân đoạn đánh dấu đầu cuối cho phép xác định chính xác trình tự chuỗi ADN sợi đơn Có hai phương pháp chính để giải trình tự ADN là phương pháp hoá học và phương pháp enzym
1.3.3.1 Phương pháp xác định trình tự Maxam Gilbert (phuong phap hod hoc)
Phương pháp này đòi hỏi phải có một đoạn ADN xác định để làm vật liệu khởi đầu Đoạn này không cần thiết phải tách dòng trong một vector Plasmid, kỹ
thuật có thể cho bất kỳ đoạn ADN nào ADN sẽ được đánh dấu phóng xạ bởi
3P tại đầu 5 của mỗi sợi và các sợi được biến tính tách nhau ra, tính sạch dé
cho một tập hợp các sợi được đánh dấu dùng trong các phản ứng xác định trình tự
[9]
Bước tiếp theo là sửa đổi hoá học với các bazơ trên sợi ADN Việc này được
thực hiên nhờ 1 trong 4 phản ứng đặc hiệu khác nhau Sau đó các bazơ bị sửa đổi
được loại khỏi nhóm đường của chúng và các sợi bị cắt tại vị trí này bằng pipericlin Nguyên lý ở đây là một số lượng lớn các phân tử trong các phản ứng
Trang 201.3.3.2.Phương pháp xdc dinh trinh tu Sanger Coulson (Phương pháp enzym hay dicleoxy)
Mặc dù kết quả cuối cùng cũng hoàn toàn như phương pháp hoá học nhưng kỹ
thuật lai hoàn toàn khác nhau Trong trường hợp này, bản sao của ADN cần xác
định trình tự được tạo ra từ klenom của ADN polymeraza Khuôn dùng cho phản ứng là ADN sợi đơn và đoạn mồi cần được dùng để cung cấp đầu 3` cho ADN
polymeraza nhằm bắt đầu tổng hợp đoạn sao
Việc sản xuất các đoạn xếp được thực hiện bằng cách xen deoxynucleotid tri photphat (dNTP) trong mỗi phản ứng Các dNTP nay thiếu nhóm hydroxyl tại vị trí 3 của deoxyribose, yếu tố này cần thiết cho quá trình kéo dài chuỗi khi tổng hợp ADN Các dNTP được sửa đổi như vậy gọi là các dideoxynucleotid tri
photphat (ddNTP) Bốn dđNTP là A,T, G, C được đưa cả vào 4 phản ứng và mỗi phản ứng đều diễn ra với 4 dNTP bình thường Nồng độ của các dạng dideoxy
phải ở mức để chúng có thể đính vào chuỗi ADN đang tổng hợp một cách liên
tục Như vậy, mỗi phản ứng tạo ra hàng loạt các đoạn kết thúc tại một nucleotid đặc thù và 4 phản ứng gộp lại sẽ cung cấp một bộ các đoạn xếp [2],[29]
Chiều ADN được đánh dấu bằng cách gắn một dNTP phóng xạ trong hỗn hợp phan ứng Đó thường là [œ - ”S]dATP, nó cho phép đọc một đoạn trình tự dài hơn
từ mỗi gen riêng biệt so với đánh dấu bằng ”*P như vẫn dùng trước đây
1.3.3.3 Điện di và đọc trình tự
Các đoạn xếp ADN sinh ra trong các phản ứng trên được tách nhau ra bằng
cách điện di trên gel polyacrylamid Các gel này thường chứa 6-20%
polyacrylamid va 7 M ure, chat nay tác động như một nhân tố biến tính làm giảm
hiệu quả hình thành cấu trúc bậc hai của ADN Điều này là quan trọng vì các đoạn có chiều dài chỉ khác nhau một nucleotid được tách nhau ra trên gel Các
Trang 21chúng lên tới 60-70°C Điều này góp phần duy trì các điều kiện biến tính [27], [29]
Khi gel đã chạy xong, tách ra khỏi máy và được sấy khô trên giấy để dễ vận chuyển Sau đó chúng được áp vào phim nhạy phóng xạ Sự phát xạ của mỗi mẫu đánh dấu sẽ hoạt hoá các hạt bọc trên phim làm cho chúng biến thành màu đen
khi tráng rửa trên phim Kết quả tạo ra biểu đồ phóng xạ Biểu đồ được đọc từ
dưới lên trên, từ đoạn nhỏ nhất về phía trên Trong phương pháp này trình tự hàng trăm bazơ có thể được xác định trên một gel riêng biệt Sau đó các thông số về trình tự được xem xét trên máy vi tính, máy này có thể thực hiện các phép phân tích như dịch sang trình tự các acid amin, xác định các điểm cắt của enzym giới hạn, các đoạn tương đồng và cấu trúc khác nhau như khởi điểm và các đoạn có
chức năng điều khiển
1.4 Áp dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về chỉ
Lactobacillus
Các kĩ thuật gen thông thường được sử dụng nhiều trong nghiên cứu vi sinh vật là PCR, multiplex PCR, sequencing Có nhiều bài báo của các tạp chí uy tín trên thế giới đã công bố những kết quả nghiên cứu về chỉ Lacfobacilius rất đáng quan tâm Các nghiên cứu này đều tập trung đi sâu vào nghiên cứu sự khác nhau
ở mức độ phân tử của cấu trúc gen, đặc biệt là các chủng có quan hệ họ hàng
thân thích để lập nên cây phát sinh chủng giống trong tiến hoá
Qua phân tích trình tự của một số gen quan trọng, người ta đã tiến hành xác
định các gen quí hiếm và các gen có ích để thực hiện bảo tồn và phát triển cơng nghiệp hố sinh Một số chủng đã xác định xong bản đồ gen, vị trí các gen quan
trọng, điểm khởi đầu quá trình sao chép ADN và trình tự các đoạn bảo thủ để
Trang 23CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất
- Bromo cresol purple (BCP) - dung dịch SDS
- Acid lactic chuẩn - dung dịch đệm TAE
- Pepton, cao nấm men - ethidium bromid
- Glucose - phenol/cloroform(1:1)
- Mồi cho phan ting PCR: primer MST,/MST,
- Vi khuẩn Lactobacilius được phân lập từ nước muối đưa, cà, các loại trái cây như: chuối, dứa, khế, đào, mận, xoài
2.1.2 Máy móc, thiết bị
- Box cấy Sanyo ( Nhật)
- Nồi hấp Nga
- Tủ ấm CO, Sanyo (Nhật)
- May li tam Rotofix (Hettich)
- May siéu li tam Sigma (Sartorius)
- May do pH Thuy sy
- May chay PCR Perkin AM 9700 (Mỹ)
- Dién di Bio-rad (MY)
- May sequencing ABI prism 3100 Avant My
Trang 25Môi trường thử độ nhạy cảm của vi khuẩn Lactobacillus v6i vitamin B12 [10] KH;PO, lg MnSO,.4H,O 0,5g Glucose 10g Thạch 15g Nước cất 1000ml pH = 6,5
Các môi trường đều được thanh trùng ở 121°C; 0,6 atm trong 20 phút 2.2 Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phản lập vỉ khuẩn sinh acid
Môi trường sử dụng cho phân lập là môi trường BCP, đây là môi trường chủ
yếu được sử dụng để phát hiện các vi khuẩn sinh acid do khả năng đổi màu của
chỉ thị từ màu tím ở pH trung tính sang màu vàng ở pH acid (<4,5)
Phương pháp phân lập được sử dụng là phương pháp hai lớp thạch Cân
khoảng 5g mẫu trái cây rồi cắt nhỏ cho vào ống falcon chứa 20ml nước cất vô trùng, ngâm và lắc trong vòng 15 phút Lần lượt pha loãng ở nồng độ 102—— 107
và cấy trên đĩa Petri có chứa môi trường phân lập với độ dày từ 2-3mm Sau đó đồ tiếp lớp thạch có nồng độ 1,5% đã đưa về nhiệt độ khoảng 45°C với độ dày khoảng 1-2mm Để các đĩa thạch trên vào tủ ấm 42°C trong 2-3 ngày rồi quan
sát
Trang 26thu được chủng thuần khiết Các đĩa Petri được nuôi cấy trong tủ ấm CO; ở nồng độ 5% và nhiệt độ 379C
Các chủng vi khuẩn sinh acid được giữ giống và bảo quản trong ống nghiệm ở
nhiệt độ 5°C để tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo
2.2.2 Lựa chon céc ching vi khudn Lactobacillus
Các vi khuẩn sinh acid ở trên được cấy truyền và nuôi cấy lỏng trong ống
nghiệm có chứa 15ml môi trường BCP ở nhiệt độ 37°C trong hai ngày Sau đó li tâm 4000 vòng/ phút lấy dịch Các ống nghiệm chứa dịch acid trên đựơc đem
phân tích khả năng sinh acid lactic
Dùng sắc kí lớp mỏng, pha động là hệ dung môi butanol: nước:methanol có tỉ lệ 20:20:1, acid lactic chuẩn pha nồng độ 1% làm đối chiếu để phát hiện các dung dịch có chứa acid lactic Lần lượt chấm các dung dịch acid và dung dịch
acid lactic chuẩn lên bản mỏng có đánh dấu và kí hiệu riêng cho từng mẫu Bản mỏng được đặt trong bình đã chứa sẵn hệ dung môi cho tới khi pha động chạy lên tới 2/3 bản sắc kí thì lấy ra làm bay hơi hết dung môi
Các vết acid trên bản mỏng được phát hiện bằng xanh bromophenol Đối chiếu với vết của acid sinh ra trong dịch nuôi cấy và vết của acid lactic chuẩn để
kết luận chủng vi khuẩn sinh acid lactic
Các chủng vi khuẩn sinh acid lactic được nuôi cấy trên môi trường MRS trong hai ngày Dùng que cấy lấy khuẩn lạc vi khuẩn sinh acid lactic rồi cho lên
lam kính, sau đó nhỏ dung dịch NaOH 5% lên khuẩn lạc Nếu khuẩn lạc tan
Trang 27khuẩn đó cơ bản là G(+) Vi khuẩn G(+) và sinh acid lactic thì có thể sơ bộ kết
luận thuộc chi Lacfobacillus
2.2.3 Sơ bộ tìm ching Lactobacillus cé kha năng sinh tổng hợp acid lacfic
cao
Cac chung Lacfobacius phân lập được lần lượt cấy trong bình nón chứa
150ml] môi trường MRS lỏng đã điều chỉnh pH về 6,8 rồi nuôi ở 37°C trong bốn
ngày Lần lượt lấy 15ml dung dịch nuôi cấy đem kiểm tra độ pH để xác định khả
năng lên men lactic tại các thời điểm 24, 36, 48, 60, 72, 96 giờ Dung dịch nuôi
cấy thu được đem li tâm 4000 vòng/phút để lấy dich acid lactic Dich acid lactic lân lượt được đo độ pH bằng máy đo pH Dung dịch nào cho độ pH thấp nhất thì
khả năng sinh acid lactic của chủng tương ứng là cao nhất so với các chủng còn
lại
2.2.4 Thử độ nhạy cẩm của ching Lactobacillus với vifamin B12
Môi trường sử dụng trong thí nghiệm là môi trường số 3, đây là môi trường có đặc điểm nghèo dinh dưỡng, chỉ những chủng Lactobacillus nao nhay cam và sử dụng vitamin B12 làm chất sinh trưởng mới tồn tại và phát triển được
Cách tiến hành:
Chuẩn bị nhũ dịch vi khuẩn Lacfobacilius: Vì sinh vật kiểm định được giữ
giống và nuôi cấy trên môi trường MRS đặc, sau đó được nuôi cấy trong môi
trường MRS lỏng ở 37°C/24h Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút để lấy tủa Rửa tủa hai lần bằng nước muối sinh lý đã hấp tiệt trùng rồi hoà vi khuẩn trong
dung dich NaCl 0,9% thành nhũ dịch tế bào có nồng độ 1,5.10” tế bào/ mI
Môi trường thử độ nhạy cảm vitamin B12 sau khi hấp thanh trùng được để
Trang 28đều và đổ vào các đĩa Petri (3 đĩa/ mẫu) khoảng 20ml Để đông đặc và đem đục 4
lỗ bằng bộ đục lỗ chân không
Dùng pipetman nhỏ 0,1ml dung dịch vitamin B12 nồng độ 5uùg/ml vào các lỗ
đã đục rồi để hộp Petri trong tủ ấm 37°C/ 24h và đọc kết quả
Chủng Lacfobacilius nào nhạy cảm với vitamin B12 sẽ mọc thành vòng tròn
hữu khuẩn Đường kính vòng phát triển càng rõ thì độ nhạy cảm càng cao
Sau khi chọn được chủng vi khuẩn Lactobacillus c6 hiéu suat tong hop acid
lactic cao và chủng nhạy cảm với vitamin B12 tốt nhất từ những thí nghiệm trên, tiến hành định tên bằng phương pháp sinh học phân tử, đọc trình tự của gen mã hoa ribosom 16S
2.2.5 Dinh tén Lactobacillus bang sinh hoc phan tu 2.2.5.1 Tach chiết ADN
Neguyén tac: Thanh tế bào vi sinh vật được phá vỡ nhờ lysozym và các chất
tẩy mạnh như SDS — tris- HCI giúp giải phóng toàn bộ ADN của vi khuẩn
Protein va ARN được tách ra khỏi ADN nhờ các enzym ARNase, protease và các
dung môi cloroform:phenol (1:1) Cuối cùng ADN được tủa bằng ethanol tuyệt
đối
Tiến hành:
- Dung eppendorf v6 trùng loai 1,5 ml, hit 500ul dung dich SDS
- Cho hai vong que cấy chủng Lacfobacillus cần tách ADN vào mỗi ống - - Lắc đều và đun ở 100°C trong 10 phút, bước này được thực hiện trên máy
thermomexIxer Eppendorf
- - Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 2 phút
Trang 29- - Thêm 100ul hạt thuỷ tinh và 100ul1 hỗn hợp phenol:cloroform (1:1)
- Lac manh trong 10 phút
- _ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút
- - Lấy 10Hl dịch phía trên và thêm 50Oul nước cất vô trùng Giữ lạnh để chạy
PCR
2.2.5.2 Tiến hành phản ting PCR (Polymerase Chain Reaction)
Nguyên tắc: Phương pháp nay su dụng ADN polymerase va cdc oligonucleotid tổng hợp nhân tạo, một đoạn ADN dùng làm khuôn được nhân lên
nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỉ lần mà không cần đến nhiều tế bào vi khuẩn Nhờ phản ứng này, một đoạn gen bất kì sẽ được khuyếch đại khi biết trình
tự nucleotid ở hai đầu, ta đã tổng hợp được cặp mồi bổ sung với trình tự của hai điểm từ đầu 5' tới đầu 3” của sợi bổ sung và nhờ có enzym ADN polymerase mà ADN khuôn được tổng hợp khi đã có sắn dNTP
Tiến hành:
Biến tính sợi ADN bằng nhiệt độ, ADN được tách thành hai sợi đơn Nhiệt độ giảm xuống cho phép mồi bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn của ADN khuôn Hỗn
hợp ADN và mồi được ủ với enzym Taq polymerase và dNTP giúp cho việc tổng hợp ADN bổ xung với sợi ADN gốc Khi các chu kỳ được lặp lại, các đoạn ADN
vừa mới được tổng hợp ở các chu kỳ trước thành khuôn cho chu kỳ sau Số chu
kỳ được lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thường không quá 30 chu kỳ và mỗi
phản ứng PCR thường kéo dài khoảng 2-3 giờ Khi thực hiện PCR, một số yếu tố ảnh hưởng đáng kể tới kết quả của phản ứng như: nồng độ mồi, nhiệt độ và thời
gian ủ mồi, nồng độ ADN khuôn, nồng độ một số ion (Mg”” ) Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR
Trang 30mồi xuôi †16S-8F (5°-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) mồi ngược 16S1510R (5-GGCTACCTTGTTACGA-3) - Công thức cho một phan tng PCR Dung dịch đệm x10x buffer 100 ul MgCl, 25 mM 80 ul Primer (MST1/MST2) 20mM 40 ul dNTP 20 mM 20 ul Template (0,5 ul/10ml/reaction) 50 ul H;O 750 ul Taq 5U/ul 5 ul
Chuong trinh chay PCR
- Bién tinh ADN 6 94°C trong hai phút
- Chay nhac lai 25 chu ky tai 94°C trong 1 phút; 52°C trong một phút; 72°C trong 2 phút
Tổng hợp : 72°C trong 10 phút
Kết thúc chương trình, đưa nhiệt độ về 4°C để bảo quản
e_ Kiểm tra sản phẩm PCR bang dién di trén gel agarose - Pha dém: dung dich TAE x0,5
- D6 gel: can 0,8-1,2g agarose cho vào 100ml dung dịch đệm 0,5 x TAE, đun sôi cho tới khi tan hết agarose Lắc đều và để nguội xuống khoảng 40-50°C
Đổ gel vào khay đã cài sẵn lược, để 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược rồi
đặt khay gel vào máy điện di
Trang 31- Chay điện di trong dung dịch đệm TAE x 0,5, dòng điện ban đầu là 50V
trong vòng 15 phút rồi nâng hiệu điện thế lên 100 V trong 30 phút cho đến khi vạch mầu đến 2/3 bản gel
- - Ngâm và nhuộm gel bằng ethidium bromid trong 30 phút - Soi ban gel trên máy soi gel UV của Bio-rad
Kết quả ADN mới được nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình dưới những vạch đỏ màu da cam trong ánh sáng tử ngoại
2.2.5.3 Phân tích trình tự ADNr 16S theo phương pháp Sanger
Dựa trên trình tự của đoạn mồi đặc hiệu để xác định trình tự ADN của mẫu
cần phân tích trực tiếp sản phẩm PCR
Trình tựưmồổi: mồixi 16S-8F @®$ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 )
mổi ngược 16SI510R (5 -GGCTACCTTGTTACGA-3 )
A Tỉnh sạch sản phẩm PCR bang QIAEX]I từ agarose gel
- Dùng dao mổ sạch cắt băng ADN từ gel rồi cho vào ống li tâm loại 1,5 ml
- _ Bổ xung ba thể tích của đệm QX1
- Đánh tan QAIEX II bằng vortex trong 30 giây Bổ xung QIAEX II vào
mẫu theo công thức đã qui định và lắc đều
- ở 50% trong 10 phút để làm tan agarose và ADN, cứ sau 2 phút lại lắc
bang vortex để giữ QIAEX H trong dạng huyền phù
- _ Ly tâm mẫu trong 30 giây và loại bỏ phần dung dịch phía trên bằng pipet - Rửa phần lắng bằng 500 k1 dung dịch đệm QXI1, đánh tan phần lắng rồi
lại ly tâm trong 30 giây và loại bỏ phần dung dịch
Trang 32- _ Hong khô phần lắng trong 10-15 phút cho tới khi chuyển sang màu trắng
- B6 xung 20 ul 10mM Tris-Cl, pH=8,5 hoac nước sau đó đánh tan bằng
vortex để thu hồi ADN, ủ mẫu theo công thức
- Ly tâm trong vòng 30 giây sau đó dùng pipet chuyển phần dich sang ống mới Irong dung dịch thu được sẽ là ADN sạch
B Xác định trình tựắADN của sản phẩm PCR tỉnh sạch
Sử dụng kit BigDye Terminator để xác định trình tự ADN trực tiếp từ sản
phẩm PCR: lấy khoảng 1ul sản phẩm đã tỉnh sạch (tương đương 30-90ng) làm
ADN khuôn và 3,2 pmol/Hl primer cho vào ống PCR tube (0,2ml, MicroAmp
PCR), 2ul BigDye Téng thể tích khoảng 20ul Các mẫu được làm biến tính ở
96°C trong 3 giây rồi thực hiện 25 chu kỳ theo chu trình sau: 96°C trong 3 giây,
50°C trong 5 giây, 60°C trong 4 phút Chuyển về 4°C để bảo quản
Tủa sản phẩm ADN đã nhuộm và gắn với BigDye: Thêm 2ul dung dịch Na
acetat 3M và 500 ul Ethanol Ly tam tốc độ 15000 vòng/phút trong 20 phút Sau đó mẫu được rửa hai lần 500 pl ethanol 70%, loai bd ethanol bang ly tam 15000 vòng/ phút trong 5 phút rồi làm khô mẫu Sau cùng bổ sung 15 ul Hi-Dye formamnd cho việc tách rời các nucleotid và trộn nhẹ nhàng trong một phút, làm
biến tính trong nước sôi 2 phút
Làm lạnh ngay trong nước đá 5 phút, lấy 10 hl mẫu tra vào giếng của khay
Trang 33CHUONG III: KET QUA VA BAN LUAN
3.1.Két qua
3.1.1 Phân lập vỉ khuẩn sinh acid
Từ 10 mẫu cơ chất được chọn để phân lập theo phương pháp thạch hai lớp, thu
nhận được 52 chủng vi khuẩn sinh acid khác nhau, các chủng này lần lượt được
đặt tên là HL1- HL52 Số lượng từng chủng thu được trong mỗi cơ chất thể hiện trong bang 1 Bảng 3.1: Mức độ phân bố và phát triển của vi khuẩn sinh acid Cơ chất Số chủng Mức độ Kí hiệu chủng
phân lập được | phát triển VSV
Nước muối dưa 6 G HL1 -HL6 Nước muối cà 3 G HL7 -HL9 Dita 2 W HL10, HL11 Nhan 6 D HL12 - HL17 Nho 8 W HL18 - HL25 Chuối 8 G HL26 - HL33 Đào 5 W HL34 - HL38 Mận 5 D HL39 - HL43 Xoài 6 W HL44 - HL49 Khế 3 D HL50 - HL52
Chú thích: W (weak): moc yéu G (good): mọc tốt D (delay): moc cham
Mặc dù không đi sâu vào nghiên cứu sự phân bố của các vi khuẩn sinh acid trong tự nhiên nhưng trong kết quả phân lập này, chúng tôi thấy số lượng vi khuẩn sinh acid phân lập được từ các cơ chất sử dụng khá đa dạng, phong phú
Việc đánh giá khả năng mọc tốt, chậm hay yếu của các chủng vi sinh vật chủ yếu
dựa vào hai tiêu chí chính là khả năng phát triển nhanh hay chậm của khuẩn lạc
Trang 34này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đây của nhiều tác giả khác nhau
về vi khuẩn sinh acid nói chung và vi khuẩn lactic nói riêng
Hình 3.1: Phân lập vi khuẩn sinh acid trên môi trường BCP
3.1.2 Tuyển chon ching vi khudn Lactobacillus
Sau khi nuôi cấy 52 chủng vi khuẩn sinh acid trên môi trường BCP lỏng, tiến hành chạy sắc kí bản mỏng với acid lactic chuẩn, hệ dung môi n-butanol : nước :
methanol (20:20:1) và chất hiện màu là xanh bromo phenol Từ 52 chủng vi
khuẩn sinh acid, thu được 21 chủng có khả năng sinh acid lactic
Trang 35dung dich NaOH 5% thu được 14 chủng vi khuẩn G(+) sinh acid lactic, sơ bộ kết
luận các chủng này thuộc chi Lactobacillus Két qua được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2: Kết quả tuyển chọn vi khuẩn Lactobacilus
ST Chủng Khả năng sinh | Khả năng hòa tan
Trang 3632] HL2 (4) Y 33 HL4 (+) N 34 HLS (+) N 35 HL6 (+) N 36| HL7 (+) N 37 HL9 (+) Y 38 HL11 (+) N 39 | HLI12 (+) N 40|_ HLI15 (+) N 41 HL19 (+) Y 42 HL25 (+) N 43| HL26 (+) N 44| HL28 (+) Y 45| HL32 (+) N 46 HL35 (+) Y 47 HL36 (+) Y 48 HL37 (+) N 49 HL44 (+) N 50 HL46 (+) Y 51] HLA7 (+) Y 52| HL5I (+) N Chú thích :
(-): không hiện vết acid lactic trên sắc đồ; (+): có vết acid lactic trên sắc đồ
N: khuẩn lạc không tan trong NaOH Y: khuẩn lạc tan trong NaOH
Từ kết quả bảng 3.2 cho thấy, tỉ lệ vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic là
khá cao, chiếm khoảng 40% trong số vi khuẩn sinh acid phân lập được Trong điều kiện của thí nghiệm, chúng tôi không thể xác định được hết các loại acid mà
các chủng vi khuẩn sinh acid có thể sinh ra Tuy nhiên đối chiếu với các tài liệu tham khảo và các nghiên cứu trước đây có thể dự đoán những acid này có thể là
Trang 37Trong quá trình chạy sắc kí bản mỏng, ngoài vết acid lactic phát hiện được
nhờ có chuẩn thì ngay trong một mẫu nghiên cứu, chúng tôi cũng phát hiện thấy
nhiều vết của các acid khác Cũng có nhiều trường hợp chỉ có một vết của acid lactic từ mẫu nghiên cứu Kết quả này phản ánh đúng với lý thuyết về sự lên men
lactic Các chủng lên men lactic dị hình, trong dịch nuôi cấy, ngoài acid lactic
còn có rất nhiều các sản phẩm acid hữu cơ khác Còn với trường hợp lên men lactic đồng hình thì sản phẩm chủ yếu là acid lactic, chiếm tỉ lệ rất cao, các chất
khác với nồng độ quá nhỏ sẽ khó phát hiện được trong sắc kí bản mỏng
Vi khuẩn Lactobacillus tuyén chon từ những chủng vi khuẩn sinh acid lactic
phân lập được ở trên bằng phương pháp kiểm tra nhanh khá đơn giản và hiệu quả
So với phương pháp nhuộm Gram và soi hình thái trên kính hiển vi có thể độ
chính xác không cao bằng nhưng tiết kiệm được khá nhiều thời gian Đây là
phương pháp khá hiệu quả khi cần sàng lọc một số lượng lớn các vi khuẩn cần
xác định Gram Từ thí nghiệm này, chúng tôi thu được các chủng Lactobacillus
có kí hiệu HL4, HL5, HLó, HL7, HL11, HL12, HL15, HL25, HL26, HL32,
HL37, HL44, HL46, HL51 để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo
3.1.3 Đánh giá khả năng sinh téng hop acid lactic của các chủng
Lactobacillus
Vi khuẩn Lacfobacilius tuyển chọn ở thí nghiệm trên tiến hành đánh giá khả
năng lên men lactic bằng cách nuôi cấy tĩnh trên môi trường MRS lỏng, các chủng sau khi được nuôi trong môi trường, định kỳ lấy mẫu để đo độ pH Thời điểm lấy mẫu lần lượt là 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 96h Kết quả được thể hiện ở
Trang 38Bảng 3.3: Khả năng biến đổi pH môi trường nuôi cấy theo thời gian của vi khuan Lactobacillus di diém | DO pH | DO pH | ĐộpH | ĐộpH | ĐộpH | Độ pH Chủng 24h | 36h | 48h | 60h | 72h | 96h HL4 4,23 4.12 4.40 4.01 4.09 4,32 HL5 5.21 4,98 4,64 4,54 4,72 4,75 HL6 5,32 5,36 4,78 4,60 4,71 4,92 HL7 3,95 3,67 3,65 3,55 3,51 4,01 HL11 3,51 3,21 3,13 2,87 3,06 3,45 HL12 3,71 3,55 3,56 3,32 3,35 3,68 HL15 4,63 4,56 4,56 4.21 4,54 4,67 HL25 5,12 4.98 4.88 4,63 4,67 4,96 HL26 5,23 5,11 4,78 4,54 4,55 4,89 HL32 4.45 4.67 4.43 4.23 4,28 4,56 HL37 4,56 4,55 4,34 4.37 4.40 4.45 HL44 5,55 5,21 4,93 4,87 4,53 4,98 HL46 3,99 3,57 3,59 3,45 3,56 3,78 HLS51 3,81 3,81 3,56 3,32 3,45 3,67
Kết quả bảng 3.3 cho thấy, dịch nuôi cấy bốn chủng HL11, HL12, HLAó6,
HL51 cho kết quả đo độ pH khá thấp so với các mẫu cùng nghiên cứu Trong đó
chủng HLI1 có độ pH thấp nhất là 2,87 ở thời điểm 60 giờ Điều này cho thấy
đây là chủng Lacfobacillus tự nhiên có hiệu suất tổng hợp acid lactic cao nhất
trong nghiên cứu của chúng tôi Và chủng HLI11 sẽ là chủng được chọn để tiếp
tục nghiên cứu trình tự ADN của gen tổng hop ribosom 16S
Trong quá trình khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới độ pH của môi trường
nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy hầu hết các môi trường nuôi cấy đều có độ pH
giảm dần khi bắt đầu nuôi cấy và đạt pH thấp nhất tương ứng với mỗi chủng ở
thời điểm 60 giờ, sau đó tăng dần Độ pH tăng chậm từ thời điểm 72 giờ trở đi
Trang 39độ pH dao động không nhiều trong quá trình nuôi cấy và tổng hợp acid lactic của vi khuẩn, bởi trong môi trường nuôi cấy có một lượng nhất định CaCO, , khi acid lactic duoc Lactobacillus tiét ra m6i trudéng sé hoa tan CaCO, tao lactat canxi Song thời điểm tốt nhất cho lên men lactic là 60-70 giờ —e HL11 —=#— HL12 —^— HL44 2 Ỉ J Ỉ Ỉ J Ỉ 0 24 36 48 60 r2 96
Hình 3.2: Độ giảm pH của môi trường nuôi cấy theo thời gian
Để đánh giá khả năng lên men lactic có rất nhiều chỉ tiêu khác nhau, trong đó hai
chỉ tiêu cơ bản hay sử dụng là pH dung dịch nuôi cấy và lượng canxilactat tạo thành, định lượng canxilactat mất khá nhiều thời gian và công sức Việc đo độ
pH dung dịch khá đơn giản, dung dịch nuôi cấy có độ pH thấp thì khả năng tổng
hop acid lactic của Lacfobacilius tương ứng là khá cao Các nghiên cứu trước
đây đã đề cập nhiều về lên men lactic, tối ưu hoá quá trình này từ chủng Lactobacillus có sẵn Trong khuôn khổ đề tài, với mong muốn tìm chủng
Trang 40trung khảo sát chỉ tiêu về độ pH của dung dịch nuôi cấy theo thời gian để qua đó
xác định thời điểm cho hiệu suất tổng hợp acid lactic cao nhất từ chủng tự nhiên
3.1.4 Thit d6 nhay cam cua Lactobacillus voi vitamin B12
Mười bốn chủng vi khuan Lactobacillus tuyén chon được ở mục 3.1.2 tiếp tục
được khảo sát độ nhạy cảm với vitamin B12 Sau khi tiến hành thí nghiệm và để
tủ ấm 37°C/24h như đã mô tả ở mục 2.2.4, chúng tôi đo đường kính vòng hữu
khuẩn (đơn vị là mm) để xác định chủng có khả năng nhạy cảm với vitamin B12
cao nhất Đường kính vòng hữu khuẩn càng lớn độ nhạy cảm với vitamin B12
của chủng tương ứng càng cao Bảng 3.4 chỉ ra kết quả về khảo sát độ nhạy cảm v6i vitamin B12 cua Lactobacillus
Bảng 3.4 : Két qua thu d6 nhay cam vitamin B12 cua Lactobacillus STT Chung đường kính | đường kính | đường kính | đường kính T; mm) T, (mm) T; (mm) T, (mm) 1 HL4 - - - - 2 HL5 - - - - 3 HL6 - - - - 4 HL7 13,4 14,2 13,7 15,0 5 HL11 - - - - 6 HL12 18,6 18,7 19,1 17,8 7 HL15 - - - - 8 HL25 - - - - 9 HL26 - - - - 10 HL32 - - - - 11 HL37 - - - - 12 HL44 17,6 16,8 15,9 16,2 13 HL46 - - - - 14 HL51 - - - -
Chú thích: (-) không nhạy cảm với vitamin B12
T; : đường kính vòng hữu khuẩn 1 T; : đường kính vòng hữu khuẩn 3
T;: đường kính vòng hữu khuẩn 2