Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc

1 BỘ GIÁO DỤC VIỆN KHOA HỌC VÀ VÀ ĐÀO TẠO CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  HỨA THỊ SƠN Tuyển chọn phân loại số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh lạc LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Tuyển chọn phân loại số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh lạc Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 60 42 40 Học viên: Hứa Thị Sơn Hƣớng dẫn khoa học: TS Lê Nhƣ Kiểu Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin cảm ơn phòng đào tạo thầy cô giáo Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Lê Như Kiểu, Phó viện trưởng Viện Thổ nhưỡng Nông hóa–Viện Khoa học Nông nghiệp Việt nam, người tận tình hướng dẫn, bảo định hướng cho suốt thời gian thực hoàn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể môn Vi sinh vật-Viện Thổ nhưỡng Nông hóa tập thể môn Sinh học Môi trường Nông nghiệp-Viện Môi trường Nông nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện cho trình làm thực nghiệm chia kinh nghiệm công việc để hoàn thành luận văn thời gian qui định Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thân gia đình, bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện, động viên giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Tôi chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó./ Hà nội, ngày tháng 12 năm 2010 Học viên Hứa Thị Sơn Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A, T, G, C ADN ALIV BIV bp DGIV EBI EDTA EHNV Adenine, Thyamine, Guanine, Cytosine Acid deoxyribonucleic African lampeye iridovirus bream iridovirus base pair Dwarf gourami iridovirus European Bioinformatics Institute Ethylenediamin Disodium Tetra Acetate Epizootic haematopoietic necrosis virus GIV GSDIV ISKNV Grouper iridovirus Grouper sleepy disease iridovirus Infectious spleen and kidney necrosis virus kb LCDV MCP NCBI OIE OSGIV PCR RBIV RSIVD SBIV SN-PCR TAE kilo base Lymphocystis disease virus Major capsid protein National Center for Biotechnology Information World Organisation for Animal Health orange spotted grouper iridovirus Polymerase Chain Reaction Rock bream iridovirus red sea bream iridoviral disease Red sea bream iridovirus Semi-nested - Polymerase chain reaction Tris - Acetic – EDTA TE TGIV Tris - EDTA 10 mM Taiwan Grouper Iridovirus Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình trồng trọt giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình sản xuất lạc giới 1.1.2 Tình hình sản xuất lạc nước 1.2 Tình hình bệnh hại lạc giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình bệnh hại lạc giới 1.2.2 Tình hình bệnh hại lạc Việt Nam 14 1.3 Khái niệm kiểm soát sinh học 16 1.4 Tại kiểm soát sinh học lại phổ biến 17 1.5 Những vấn đề kiểm soát sinh học 18 1.6 Cơ chế đối kháng 19 1.6.1.Cơ chế kháng sinh 19 1.6.2.Những hợp chất dễ bay enzim 21 1.6.3.Sự cạnh tranh 22 1.6.4.Sự kí sinh 23 1.6.5.Sự giảm độc tính 23 1.6.6.Kháng hệ thống (Sự kích kháng) 24 1.7.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng nước 25 1.7.1.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng nước 25 1.7.2.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng nước 29 CHƢƠNG II.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1.Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 31 2.1.2 Các môi trường phân lập vi khuẩn 31 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phương pháp phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng 33 2.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phương pháp đục lỗ thạch 34 2.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phương pháp cấy chấm điểm 35 2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn đối kháng 36 2.2.5 Phân loại vi sinh vật đối kháng phương pháp giải trình tự đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom 39 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.1 Phương pháp PCR thông thường (đơn) 2.2.5.2 Phương pháp kiểm tra độ xác định nồng độ 2.2.5.3 Phương pháp làm sản phẩm PCR 2.2.5.4 Phương pháp tách dòng xác định trình tự gen a Phương pháp tách dòng b Phương pháp giải trình tự gen 2.2.5.5 Phương pháp tin sinh học (sử dụng phần mềm NCBI, EBI, Expasy…) CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu mẫu, phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng 3.2 Đánh giá hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn 3.3 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn đối kháng 3.4 Một số đặc điểm chủng vi khuẩn đối kháng 3.4.1.Một số đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn đối kháng 3.4.2 Đánh giá ảnh hưởng chủng vi khuẩn đối kháng đến trình nảy lạc 3.4.3 Đánh giá hiệu phòng trừ bệnh héo xanh R solanacearum chủng vi khuẩn đối kháng 3.4.4 Đánh giá ảnh hưởng chủng vi khuẩn đối kháng lên trình sinh trưởng phát triển lạc 3.5 Xác định vi trí phân loại chủng vi khuẩn nghiên cứu phương pháp giải trình tự đoạn gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom CHƢƠNG IV KẾT LUẬN CHƢƠNG V KIẾN NGHỊ CHƢƠNG VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 39 40 41 43 43 46 46 47 47 50 52 54 54 57 58 61 63 75 76 77 MỤC LỤC BẢNG Bảng 3.1 Nguồn gốc đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn Trang 47 phân lập Bảng 3.2 Hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn với đại diện chủng vi khuẩn 50 gây bệnh héo xanh R Solanacearum Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn đối kháng 52 Bảng 3.4 Một số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn đối kháng 55 Bảng 3.5 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đối kháng lên khả nảy mầm 57 hạt lạc Bảng 3.6 Hiệu phòng trừ bệnh héo xanh R solanacearum 58 chủng vi khuẩn đối kháng lạc điều kiện nhà kính Bảng 3.7 Các tiêu sinh trưởng lạc có bổ sung 61 vi khuẩn đối kháng Bảng 3.8 Kết so sánh trình tự đoạn 16S ARN riboxom chủng TH24 với 71 chủng vi khuẩn ngân hàng gen quốc tế Bảng 3.9 Kết so sánh trình tự đoạn 16S ARN riboxom chủng NA10 với 72 chủng vi khuẩn ngân hàng gen quốc tế Bảng 3.10 Một số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn đối kháng Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 73 MỤC LỤC HÌNH Trang Hình 3.1 Hoạt tính đối kháng số chủng vi khuẩn đối kháng với 51 R solanacearum BHT gây bệnh héo xanh lạc Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc điển hình số chủng 53 vi khuẩn đối kháng đại diện Hình 3.3 Hình thái tế bào chủng vi khuẩn TH24 chụp kính hiển vi 54 điện tử với độ phóng đại 20.000 lần Hình 3.4 Hiệu phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn chủng 60 vi khuẩn đối kháng Lạc Hình 3.5 Điện di đồ ADN tổng số hai chủng vi khuẩn nghiên cứu 64 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR chủng vi khuẩn nghiên cứu 65 Hình 3.7 Tuyển chọn khuẩn lạc mang gen mã hóa đoạn 16S ARN riboxom 66 chủng vi khuẩn NA10 TH24 phương pháp colony PCR Hình 3.8 Tách kiểm tra plasmid mang đoạn gen mã hóa phần tử 16S 67 riboxom chủng vi khuẩn đối kháng Hình 3.9 Kết tinh vectơ tái tổ hợp enzim ARNaza 68 Hình 3.10 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom 70 chủng TH24 Hình 3.11 Trình tự nucleotit gen mã hóa phần tử 16S ARN riboxom chủng vi khuẩn NA10 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 70 MỞ ĐẦU Bệnh héo xanh trồng khuẩn Ralstonia solanacearum bệnh phổ biến nghiêm trọng nhiều loại trồng cà chua, khoai tây, lạc, ớt, gừng (1, 2, 54,58,57) Đây bệnh chủ yếu làm giảm suất mùa lạc nhiều nước Trung Quốc, Thái Lan, Việt nam, Indonesia Hàng năm dịch bệnh gây thiệt hại từ 50-80% suất trồng Tình hình gây hại nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn lạc vừng chủ yếu giới hạn phạm vi xác định mức độ thiệt hại, phân bố bệnh bước đầu xác định nguồn gen kháng tập đoàn giống có Kiểm soát dịch bệnh phương pháp sinh học (kiểm soát sinh học) dần trở thành xu hướng phổ biến áp dụng rộng rãi nông nghiệp nhiều nước giới Bằng việc áp dụng biện pháp sinh học người ta thay loại thuốc trừ sâu hóa học có hại đến sức khỏe người môi trường sinh thái Trong biện pháp sử dụng vi sinh vật tác nhân kiểm soát phòng ngừa bệnh hại dần trở lên phổ biến (5, 7) hiệu rõ rệt mà mang lại, chủng vi sinh vật lựa chọn phải có hoạt tính đối kháng cao, ổn định thời gian dài không gây hại cho động, thực vật Với mục đích giao nhiệm vụ thực đề tài “Tuyển chọn phân loại số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh lạc” Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình trồng lạc giới Việt nam 1.1.1 Tình hình sản xuất lạc giới Trong loại trồng làm thực phẩm cho người, lạc có vị trí quan trọng Mặc dù có nguồn gốc từ lâu đời tầm quan trọng kinh tế lạc 36 xác định cách khoảng 100 năm Khi xưởng ép dầu Macxây (Pháp) bắt đầu nhập cảng lạc từ Tây Phi, mở đầu cho thời kỳ dùng lạc ép dầu qui mô lớn Công nghiệp ép dầu hình thành phát triển nhanh chóng nước Châu Âu lan toàn giới Phần lớn diện tích trồng lạc giới sản xuất theo lối cổ truyền, kỹ thuật canh tác lạc hậu Những năm gần nhờ ứng dụng tiến khoa học kỹ thuật vào sản xuất suất lạc nâng lên Tuy nhiên tiến kỹ thuật nước không đồng đều, nước phát triển suất lạc tăng nhanh nước chậm phát triển hàng năm suất lạc tăng không đáng kể Các nước có suất lạc tăng nhanh là: Mỹ vòng từ năm 1961 đến 1975 suất bình quân tăng từ 1.564kg/ha lên 2.875kg/ha Ở Trung Quốc chương trình nghiên cứu nâng cao suất lạc tiến hành từ 1979 đạt kết khả quan Các thành tựu chọn giống lạc năm 80 ứng dụng vào sản xuất tạo nên điển hình suất cao giống Nonghua 22 đạt suất trung bình 4.219kg/ha miền trung miền nam Trung Quốc Ngoài nhiều giống lạc có suất cao đưa sản xuất mở rộng (5, 14) Cây lạc trồng tất châu lục với 100 nước giới, diện tích trồng lạc khoảng 20-21 triệu ha, suất biến động từ 11-12tạ/ha Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... thái chủng vi khuẩn Trang 47 phân lập Bảng 3.2 Hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn với đại diện chủng vi khuẩn 50 gây bệnh héo xanh R Solanacearum Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn đối. .. QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu mẫu, phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng 3.2 Đánh giá hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn 3.3 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn đối kháng 3.4 Một số đặc điểm chủng vi khuẩn. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO VI N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Tuyển chọn phân loại số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia