phân lập và định danh chủng vi khuẩn Clostridium Sp. sinh tổng hợp Butanol

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN HỮU TRÍ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM SP. SINH TỔNG HỢP BUTANOL CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Hoàng Quốc Khánh là người hướng dẫn khoa học trực tiếp em trong quá trình thực hiện luận văn, thầy đã tận tình hướng dẫn em phương pháp nghiên cứu khoa học, gợi ra những ý tưởng, lời khuyên quý báu giúp em luôn giữ được sự tự tin cần thiết để bước đi trên con đường nghiên cứu khoa học. Với tất cả lòng kính trọng em xin gởi lời cảm ơn đến ThS. Lê Ngọc Thông, thầy đã tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành tốt công tác giảng dạy và học tập cũng như thực hiện luận văn. Em xin cảm ơn tất cả thầy cô Khoa Sinh Học đã tận tâm giảng dạy, trang bị biết bao kiến thức cần thiết cho em trong suốt 6 năm qua tại trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. Cảm ơn anh Nguyễn Duy Long, chị Đào Thị Thu Hiền đã quan tâm tận tình hướng dẫn em các bước tiến hành thí nghiệm, đưa ra cho em những lời khuyên bổ ích và đúng lúc. Cảm ơn các bạn, các em sinh viên cùng làm tại phòng Vi sinh Ứng dụng, Viện Sinh học nhiệt đới, các bạn như một gia đình nhỏ luôn cho tôi cảm giác thoải mái, đã bên tôi trong quá trình thực hiện luận văn, chia vui cùng tôi những thành công, góp ý cùng tôi những thất bại, giúp đỡ hỗ trợ nhờ đó tôi thiết kế các thí nghiệm chính xác, đúng tiến độ . Cảm ơn tất cả các bạn cao học Vi sinh K.18 đã bên mình, chia sẽ những buồn vui trên giảng đường và trong cuộc sống, các bạn là những người đã truyền cho mình động lực, những lời động viên chân thành, giúp mình hoàn thành tốt luận văn này. Với tất cả sự biết ơn con xin cảm ơn gia đình, cảm ơn ba mẹ đã nuôi dưỡng và dạy dỗ con, là chỗ dựa vững chắc nhất cho con, luôn tạo điều kiện tốt nhất để con học tập và công tác, cảm ơn các em đã luôn động viên, khích lệ anh. TP.Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 04 năm 2011 Nguyễn Hữu Trí MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT Chương 1. MỞ ĐẦU 1 Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1. Tổng quan về giống Clostridium 6 2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Clostridium 10 2.1.2. Cấu trúc và hình thái tế bào 11 2.1.3. Hình thành nội bào tử 12 2.1.3.1. Đặc tính của bào tử 13 2.1.3.2. Sự nảy mầm bào tử 15 2.2. Quá trình lên men sinh dung môi ABE ở Clostridium 15 2.2.1. Lịch sử của quá trình lên men ABE 15 2.2.2. Cơ chất lên men ABE của Clostridium 18 2.2.3. Con đường biến dưỡng ABE ở C. acetobutylicum 21 2.2.4. Sự thoái biến khả năng sinh dung môi 25 2.2.5. Mối liên hệ giữa quá trình sinh dung môi và sự sinh trưởng, phát triển của Clostridium 26 2.2.6. Phương pháp thu nhận dung môi aceton-butanol-ethanol 27 2.2.7. Nhiên liệu sinh học và ứng dụng của butanol 29 2.2.7.1. Nhiên liệu sinh học 29 - i - 2.2.7.2. Ứng dụng của butanol 30 2.3. Định danh Clostridium bằng kỹ thuật sinh học phân tử 34 2.4. Giới thiệu cây phát sinh loài 37 Ch??ng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 40 3.2. Dụng cụ, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 40 3.2.1. Dụng cụ 40 3.2.2. Thiết bị 40 3.2.3. Môi trường sử dụng nuôi cấy 40 3.2.3.1. Môi trường RCM 40 3.2.3.2. Môi trường T6 41 3.2.3.3. Triple Sugar Iron Agar (TSI) cho thử nghiệm sinh H2S 41 3.2.3.4. Môi trường Indole cho thử nghiệm Indol 41 3.2.3.5. Phenol Red Carbohydrate Broth 42 3.2.3.6. Thuốc thử kiểm tra sự hiện diện của aceton 42 3.2.3.7. Hóa chất dùng trong điện di 42 3.2.3.8. Hóa chất dùng cho PCR 42 3.2.4. Đối tượng nghiên cứu 43 3.2.5. Chủng vi sinh vật chuẩn 44 3.3. Phương pháp nghiên cứu 44 3.3.1. Phương pháp lấy mẫu 44 3.3.2. Phân lập và làm thuần chủng Clostridium sp. có tiềm năng sinh butanol 47 3.3.2.1. Phân lập chủng Clostridium sp 47 3.3.2.2. Làm thuần chủng Clostridium sp. 47 - ii - 3.3.2.4. Nhuộm Gram 49 3.3.2.5. Nhuộm bào tử 50 3.3.2.6. Kiểm tra khả năng tổng hợp dung môi 50 3.3.3. Kiểm tra khả năng sinh butanol của các chủng Clostridium sp. 51 3.3.3.1. Phương pháp định tính acetone 51 3.3.3.2. Ki?m tra kh? n?ng t?o c?c ?ơng trong mơi tr??ng s?a 52 3.3.3.3. Kiểm tra các đặc tính sinh lý sinh hóa khác 52 3.3.3.4. Xác định nồng độ butanol tổng hợp bằng sắc ký lỏng cao năng HPLC 55 3.3.4. Bảo quản chủng phân lập bằng phương pháp đông khô. 60 3.3.5. Định danh các chủng Clostridium sp. sử dụng vùng gene 16S rDNA . 60 3.3.5.1. Thu nhận DNA bộ gen cho PCR 16S srDNA 60 3.3.5.2. Khuếch đại PCR trình tự 16S rDNA 61 3.3.5.3. Kiểm tra sự khuếch đại 66 3.3.5.4. Tinh sạch sản phẩm PCR 66 3.3.5.5. Giải trình tự và tạo cây phát sinh loài 66 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 4.1. Phân lập và làm thuần giống Clostridium có tiềm năng sinh butanol 69 4.1.1. Thu nhận mẫu phân tích 69 4.1.2. Phân lập và làm thuần chủng Clostridium sp. sinh butanol 70 4.1.3 Chọn lọc các chủng Clostridium sp. có khả năng sinh dung môi 78 4.2. Kiểm tra khả năng sinh butanol của các chủng Clostridium sp. phân lập được 78 4.2.1. Kiểm tra khả năng đông tụ sữa và định tính acetone 78 3.3.2.3. Kieåm tra hoaït tính catalase 48 - 5 - 4.2.2.1. Kh nng sinh H2S 80 4.2.2.2.Kh nng mn cm vi rifampicin 80 4.2.2.3. Th nghim Indol 80 4.2.2.4. Th nghim kh nng s dng cỏc ngun carbohydrate khỏc nhau 81 4.2.3. Xỏc nh nng butanol tng hp bng sc ký lng cao nng 84 4.3. Bo qun chng phõn lp bng phng phỏp ụng khụ. 86 4.4. nh danh cỏc chng Clostridium sp. s dng trỡnh t 16S rDNA 87 4.4.1. Khuch i PCR trỡnh t 16S rDNA 87 4.4.2. Kt qu gii trỡnh t v nh danh 88 4.4.3. Tho lun chung 95 Chng 5. KT LUN V NGH 98 5.1. Kt lun 99 5.2. ngh 99 TI LIU THAM KHO PH LC 4.2.2. Kieồm tra caực ủaởc tớnh sinh lyự sinh hoựa kha ự c 80 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Clostridium thủy phân cellulose và sản phẩm tương ứng 19 Bảng 2.2: Đặc tính của butanol so với xăng và các alcol khác 31 Bảng 3.1: Thời gian lưu các chất 57 Bảng 3.2: Kết quả đo chuẩn glucose 57 Bảng 3.3: Kết quả đo chuẩn butanol 58 Bảng 3.4: Oligodeoxynucleotide primer được sử dụng cho phản ứng PCR 62 Bảng 3.5: Thành phần cho 1 phản ứng PCR với cặp mồi Eubac 27F và 1492R 63 Bảng 3.6: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R 63 Bảng 3.7: Oligodeoxynucleotide primer được sử dụng cho phản ứng PCR 64 Bảng 3.8: Thành phần của 1 phản ứng PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S - G - Clos - 1205 - A - 21 65 Bảng 3.9: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G- Clos- 1205-A-21 65 Bảng 3.10: Trình tự 16S rDNA của các loài Clostridium từ NCBI và EMBL 67 Bảng 4.1: Các loại mẫu và địa điểm thu mẫu 69 Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm mẫu I có pH acid (pH ? 6,5). 71 Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm mẫu II có pH trung tính (6,5<pH ? 7,5). 72 Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm mẫu III có pH kiềm (pH > 7,5). 73 - 7 - Bảng 4.5: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu I phân lập được trên môi trường RCM 75 Bảng 4.6: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu II phân lập được trên môi trường RCM 76 Bảng 4.7: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu III phân lập được trên môi trường RCM 76 Bảng 4.8: Kết quả định tính acetone và hình thành cục đông trong môi trường sữa của các chủng vi khuẩn phân lập được 79 Bảng 4.9: Khả năng sinh H2S và mẫn cảm với rifampicin 81 Bảng 4.10: Khả năng sử dụng nguồn carbon của các chủng Clostridium sp. chọn lọc 81 Bảng 4.11: Tổng kết các đặc điểm của 8 chủng Clostridium sp. tuyển chọn 83 Bảng 4.12: Kết quả phân tích sản phẩm sau lên men của các chủng Clostridium nghiên cứu 84 Bảng 4.13: Chiều dài vùng gene 16S rDNA giải trình tự 88 Bảng 4.14: Hệ số tương đồng di truyền của 8 chủng nghiên cứu với các chủng Clostridium đã được công bố trên NCBI 89 Bảng 4.15: Ma trận (%) tương đồng di truyền 16S rDNA của các chủng Clostridium nằm trong cluster I 92 - 8 - DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Tế bào sinh dưỡng C. acetobutylicum 6 Hình 2.2: Sự hình thành bào tử ở C. acetobutylicum trong lên men ABE 13 Hình 2.3: Quá trình tạo bào tử gồm 7 bước ở C. saccharobutylicum 14 Hình 2.4: Chaim Weizmann (1874 – 1952) 16 Hình 2.5: C. beijerinckii sLM01 hoạt động thủy phân cellulose 20 Hình 2.6: Con đường chuyển hóa acid và dung môi của Clostridium 22 Hình 2.7: Quá trình thay đổi hình thái, sinh dung môi kết hợp hình thành bào tử ở C. acetobutylicum 27 Hình 2.8: Cấu trúc butanol (C4H9OH) 31 Hình 2.9: Xe 100% Butanol 34 Hình 2.10: Cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ của các loài Clostridium trong cluster I 38 Hình 3.1: Quy trình phân lập và định danh Clostridium sinh butanol 45 Hình 3.2: Đường chuẩn HPLC cho glucose 57 Hình 3.3: Đường chuẩn HPLC cho butanol 58 Hình 3.4: Bản đồ vùng gene 16S rDNA của Clostridium. 63 Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc của một số chủng Clostridium sp. phân lập 74 Hình 4.2: Hình dạng bào tử của một số chủng Clostridium sp. 77 Hình 4.3: Sự lên men glucose của các chủng Clostridium sp. phân lập 82 Hình 4.4: Lượng butanol tổng hợp của các chủng Clostridium sp. được chọn sau 7 ngày lên men. 85 Hình 4.5: Bảo quản các chủng vi khuẩn bằng phương pháp đông khô 86 Hình 4.6: Sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi 27F-1492R để khuếch đại vùng gen 16S rDNA 87 - 9 - Hình 4.7: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos- 1205-A-21 khuếch đại vùng gen 16S rDNA đặc trưng cho giống Clostridium. . 88 Hình 4.8: Cây phát sinh loài tổng quát thể hiện mối quan hệ của các chủng Clostridium DF3, DL1, DL2, DL3, DL4, DL5, PB7, PB10 với các chủng vi khuẩn khác thuộc giống Clostridium. 91 Hình 4.9: Cây phát sinh loài chi tiết thể hiện mối quan hệ của các chủng Clostridium DF3, DL1, DL2, DL3, DL4, DL5, PB7, PB10 với các loài Clostridium khác trong cluster I 94 - viii - [...]... động vật, bùn ao hồ 2 Kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng Clostridium sp phân lập được là Gram dương, hình thành nội bào tử, sinh tổng hợp butanol 3 Xác định khả sinh tổng hợp butanol của các chủng Clostridium sp phân lập được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao năng HPLC 4 Định danh các chủng Clostridium sp phân lập được bằng kỹ thuật sinh học phân tử: tách chiết DNA bằng DNAzol Direct... dạng sinh học cao thuận lợi cho vi c phân lập các chủng Clostridium sp Do vậy, vi c phân lập, xác định vi khuẩn Clostridium có tiềm năng sinh dung mơi từ các nguồn tài ngun thiên nhiên của Vi t Nam có ý nghĩa to lớn, góp phần khai thác tính đa dạng sinh học và đồng thời thúc đẩy nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học, vì vậy chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: “PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN... cứu phát triển nhiên liệu sinh học, vì vậy chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu: “PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM SP SINH TỔNG HỢP BUTANOL Đề tài được thực hiện nhằm giải quyết các vấn đề: 1 Phân lập, sàng lọc và xác định các chủng vi khuẩn Clostridium sp kỵ khí nghiêm ngặt, có khả năng sinh butanol từ các nguồn mẫu khác nhau như đất canh tác nơng nghiệp, phân của động vật, bùn ao... bào tử, sinh tổng hợp butanol 3 Xác định khả sinh tổng hợp butanol của các chủng Clostridium sp phân lập được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao năng HPLC 4 Định danh các chủng Clostridium sp phân lập được bằng kỹ thuật sinh học phân tử: tách chiết DNA bằng DNAzol Direct PCR, khuếch đại đoạn gene 16S rDNA có kích thước 1,5 kb sử dụng cặp mồi Eubac27F và 1492R Các sản phẩm khuếch đại được tinh sạch và giải... DANH CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM SP SINH TỔNG HỢP BUTANOL Đề tài được thực hiện nhằm giải quyết các vấn đề: 1 Phân lập, sàng lọc và xác định các chủng vi khuẩn Clostridium sp kỵ khí nghiêm ngặt, có khả năng sinh butanol từ các nguồn mẫu khác nhau như đất canh tác nơng nghiệp, phân của động vật, bùn ao hồ 2 Kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng Clostridium sp phân lập được là Gram dương,... saccharoperbutyricum… là những vi sinh vật tiềm năng nhất [7] Vi t Nam là một quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới có độ đa dạng sinh học cao thuận lợi cho vi c phân lập các chủng Clostridium sp Do vậy, vi c phân lập, xác định vi khuẩn Clostridium có tiềm năng sinh dung mơi từ các nguồn tài ngun thiên nhiên của Vi t Nam có ý nghĩa to lớn, góp phần khai thác tính đa dạng sinh học và đồng thời thúc đẩy nghiên... melezitose và inulin Khơng có sự hình thành cục đơng sữa sau 48 giờ và khơng tổng hợp riboflavin [30] Sản phẩm lên men là acid acetic và butyric, acetone, butanol, ethanol, CO2 và H2 Những chủng này được sử dụng trong q trình lên men tổng hợp các dung mơi acetone, butanol và ethanol từ nhiều nguồn cơ chất đường và tinh bột Clostridium saccharobutylicum:(có khả năng tổng hợp butanol từ đường), chủng này... isopropanol, butanol) được biết bởi các lồi vi khuẩn nhiệt trung có hoạt tính phân giải đường như Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii và các chủng khác có liên quan [23] Trong lịch sử, hai lồi Clostridium acetobutylicum và Clostridium butylicum đã được sử dụng hoặc phát triển để lên men tổng hợp dung mơi tuy nhiên theo Montoya và cs, 2005 khi tiến hành phân lập các chủng Clostridium sinh dung... [14], [20] Clostridium thủy phân cellulose có thể được phân lập từ các mơi trường đa dạng bao gồm đất, bùn, phân động vật ăn cỏ và xác bã thực vật đang phân hủy ở nhiều vùng và nhiều khu vực khác nhau Thêm vào đó, những vi sinh này có thể phân lập được từ ruột của các lồi động vật ăn cỏ, nước thải, phân compost và ruột của các lồi động vật ăn cỏ, các lồi động vật ăn gỗ như mối… (Bảng 2.1) Các lồi Clostridium. .. đầu khơng khử [22] Bảng 2.1 Clostridium thủy phân cellulose và sản phẩm tương ứng [22] Loài Nguồn phân lập Clostridium chartatabidum Clostridium longisporum” Dạ cỏ Dạ cỏ Dạ cỏ Cỏ ủ Đất Phân compost Phân compost Đất, compost, phân động vật, suối nước nóng Clostridium cellobioparum Clostridium cellulolyticum Clostridium hungatei Clostridium stercorarium Clostridium cellulosi Clostridium thermocopriae . dạng sinh học cao thuận lợi cho vi c phân lập các chủng Clostridium sp. Do vậy, vi c phân lập, xác định vi khuẩn Clostridium có tiềm năng sinh dung môi từ các nguồn tài nguyên thiên nhiên của Vi t. dạng sinh học cao thuận lợi cho vi c phân lập các chủng Clostridium sp. Do vậy, vi c phân lập, xác định vi khuẩn Clostridium có tiềm năng sinh dung môi từ các nguồn tài nguyên thiên nhiên của Vi t. HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN HỮU TRÍ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM SP. SINH TỔNG HỢP BUTANOL CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA