phân lập và định danh chủng vi khuẩn Clostridium Sp. sinh tổng hợp Butanol

Trong đó các vi khuẩn lên men từ sinh khối để sinh dung môi có rất nhiều ưuthế như: hạn chế việc tổng hợp nên các hợp chất có khả năng gây ung thư, sử dụngtạo ra các dẫn xuất dung môi cu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN HỮU TRÍ

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM SP SINH

TỔNG HỢP BUTANOL

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

MÃ SỐ: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Hoàng Quốc Khánh

là người hướng dẫn khoa học trực tiếp em trong quá trình thực hiện luận văn, thầy đã tận tình hướng dẫn em phương pháp nghiên cứu khoa học, gợi ra những ý tưởng, lời khuyên quý báu giúp em luôn giữ được sự tự tin cần thiết

để bước đi trên con đường nghiên cứu khoa học.

Với tất cả lòng kính trọng em xin gởi lời cảm ơn đến ThS Lê Ngọc Thông, thầy đã tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành tốt công tác giảng dạy và học tập cũng như thực hiện luận văn.

Em xin cảm ơn tất cả thầy cô Khoa Sinh Học đã tận tâm giảng dạy, trang bị biết bao kiến thức cần thiết cho em trong suốt 6 năm qua tại trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM.

Cảm ơn anh Nguyễn Duy Long, chị Đào Thị Thu Hiền đã quan tâm tận tình hướng dẫn em các bước tiến hành thí nghiệm, đưa ra cho em những lời khuyên bổ ích và đúng lúc.

Cảm ơn các bạn, các em sinh viên cùng làm tại phòng Vi sinh Ứng dụng, Viện

Sinh học nhiệt đới, các bạn như một gia đình nhỏ luôn cho tôi cảm giác thoải mái, đã bên tôi trong quá trình thực hiện luận văn, chia vui cùng tôi những thành công, góp ý cùng tôi những thất bại, giúp đỡ hỗ trợ nhờ đó tôi thiết kế các thí nghiệm chính xác, đúng tiến độ

Cảm ơn tất cả các bạn cao học Vi sinh K.18 đã bên mình, chia sẽ những buồn vui trên giảng đường và trong cuộc sống, các bạn là những người đã truyền cho mình động lực, những lời động viên chân thành, giúp mình hoàn thành tốt luận văn này.

Với tất cả sự biết ơn con xin cảm ơn gia đình, cảm ơn ba mẹ đã nuôi dưỡng và dạy dỗ con, là chỗ dựa vững chắc nhất cho con, luôn tạo điều kiện tốt nhất để con học tập và công tác, cảm ơn các em đã luôn động viên, khích lệ anh.

TP.Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 04 năm 2011

Nguyễn Hữu Trí

i

-MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC VIẾT TẮT

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Tổng quan về giống Clostridium 6

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu Clostridium 10

2.1.2 Cấu trúc và hình thái tế bào 11

2.1.3 Hình thành nội bào tử 12

2.1.3.1 Đặc tính của bào tử 13

2.1.3.2 Sự nảy mầm bào tử 15

2.2 Quá trình lên men sinh dung môi ABE ở Clostridium 15

2.2.1 Lịch sử của quá trình lên men ABE 15

2.2.2 Cơ chất lên men ABE của Clostridium 18

2.2.3 Con đường biến dưỡng ABE ở C acetobutylicum 21

2.2.4 Sự thoái biến khả năng sinh dung môi 25

2.2.5 Mối liên hệ giữa quá trình sinh dung môi và sự sinh trưởng, phát triển của Clostridium 26

2.2.6 Phương pháp thu nhận dung môi aceton-butanol-ethanol 27

2.2.7 Nhiên liệu sinh học và ứng dụng của butanol 29

2.2.7.1 Nhiên liệu sinh học 29

ii

-2.2.7.2 Ứng dụng của butanol 30

2.3 Định danh Clostridium bằng kỹ thuật sinh học phân tử 34

2.4 Giới thiệu cây phát sinh loài 37

Ch??ng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 40

3.2 Dụng cụ, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 40

3.2.1 Dụng cụ 40

3.2.2 Thiết bị 40

3.2.3 Môi trường sử dụng nuôi cấy 40

3.2.3.1 Môi trường RCM 40

3.2.3.2 Môi trường T6 41

3.2.3.3 Triple Sugar Iron Agar (TSI) cho thử nghiệm sinh H2S 41

3.2.3.4 Môi trường Indole cho thử nghiệm Indol 41

3.2.3.5 Phenol Red Carbohydrate Broth 42

3.2.3.6 Thuốc thử kiểm tra sự hiện diện của aceton 42

3.2.3.7 Hóa chất dùng trong điện di 42

3.2.3.8 Hóa chất dùng cho PCR 42

3.2.4 Đối tượng nghiên cứu 43

3.2.5 Chủng vi sinh vật chuẩn 44

3.3 Phương pháp nghiên cứu 44

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 44

3.3.2 Phân lập và làm thuần chủng Clostridium sp có tiềm năng sinh butanol 47

3.3.2.1 Phân lập chủng Clostridium sp 47

3.3.2.2 Làm thuần chủng Clostridium sp 47

- 3

-3.3.2.3 Kiểm tra hoạt tính catalase 48

3.3.2.4 Nhuộm Gram 49

3.3.2.5 Nhuộm bào tử 50

3.3.2.6 Kiểm tra khả năng tổng hợp dung mơi 50

3.3.3 Kiểm tra khả năng sinh butanol của các chủng Clostridium sp 51

3.3.3.1 Phương pháp định tính acetone 51

3.3.3.2 Ki?m tra kh? n?ng t?o c?c ?ơng trong mơi tr??ng s?a 52

3.3.3.3 Kiểm tra các đặc tính sinh lý sinh hĩa khác 52

3.3.3.4 Xác định nồng độ butanol tổng hợp bằng sắc ký lỏng cao năng HPLC 55

3.3.4 Bảo quản chủng phân lập bằng phương pháp đơng khơ 60

3.3.5 Định danh các chủng Clostridium sp sử dụng vùng gene 16S rDNA 60 3.3.5.1 Thu nhận DNA bộ gen cho PCR 16S srDNA 60

3.3.5.2 Khuếch đại PCR trình tự 16S rDNA 61

3.3.5.3 Kiểm tra sự khuếch đại 66

3.3.5.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 66

3.3.5.5 Giải trình tự và tạo cây phát sinh lồi 66

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68

4.1 Phân lập và làm thuần giống Clostridium cĩ tiềm năng sinh butanol 69

4.1.1 Thu nhận mẫu phân tích 69

4.1.2 Phân lập và làm thuần chủng Clostridium sp sinh butanol 70

4.1.3 Chọn lọc các chủng Clostridium sp cĩ khả năng sinh dung mơi 78

4.2 Kiểm tra khả năng sinh butanol của các chủng Clostridium sp phân lập được 78

4.2.1 Kiểm tra khả năng đơng tụ sữa và định tính acetone 78

4.2.2 Kiểm tra các đặc tính sinh lý sinh hóa khác

80 4.2.2.1 Khả năng sinh H2S 80

4.2.2.2.Khả năng mẫn cảm với rifampicin 80

4.2.2.3 Thử nghiệm Indol 80

4.2.2.4 Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate khác nhau 81

4.2.3 Xác định nồng độ butanol tổng hợp bằng sắc ký lỏng cao năng 84

4.3 Bảo quản chủng phân lập bằng phương pháp đơng khơ 86

4.4 Định danh các chủng Clostridium sp sử dụng trình tự 16S rDNA 87

4.4.1 Khuếch đại PCR trình tự 16S rDNA 87

4.4.2 Kết quả giải trình tự và định danh 88

4.4.3 Thảo luận chung 95

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 98

5.1 Kết luận

99 5.2 Đề nghị 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

- 5

-DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Clostridium thủy phân cellulose và sản phẩm tương ứng 19

Bảng 2.2: Đặc tính của butanol so với xăng và các alcol khác 31

Bảng 3.1: Thời gian lưu các chất 57

Bảng 3.2: Kết quả đo chuẩn glucose 57

Bảng 3.3: Kết quả đo chuẩn butanol 58

Bảng 3.4: Oligodeoxynucleotide primer được sử dụng cho phản ứng PCR 62

Bảng 3.5: Thành phần cho 1 phản ứng PCR với cặp mồi Eubac 27F và 1492R 63 Bảng 3.6: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R 63

Bảng 3.7: Oligodeoxynucleotide primer được sử dụng cho phản ứng PCR 64

Bảng 3.8: Thành phần của 1 phản ứng PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205-A-21 65

Bảng 3.9: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi S-G-0586-S-21 và S-G- Clos-1205-A-21 65

Bảng 3.10: Trình tự 16S rDNA của các loài Clostridium từ NCBI và EMBL 67

Bảng 4.1: Các loại mẫu và địa điểm thu mẫu 69

Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm mẫu I có pH acid (pH ? 6,5) 71

Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm mẫu II có pH trung tính (6,5<pH ? 7,5) 72

Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm mẫu III có pH kiềm (pH > 7,5) 73

- 6

-Bảng 4.5: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của cácchủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu I phân lập được trên môi trường RCM 75Bảng 4.6: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu II phân lập được trên môi trường RCM 76Bảng 4.7: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu III phân lập được trên môi trường RCM 76Bảng 4.8: Kết quả định tính acetone và hình thành cục đông trong môi trường sữa của các chủng vi khuẩn phân lập được 79

Bảng 4.9: Khả năng sinh H2S và mẫn cảm với rifampicin 81Bảng 4.10: Khả năng sử dụng nguồn carbon của các chủng Clostridium sp chọn lọc 81Bảng 4.11: Tổng kết các đặc điểm của 8 chủng Clostridium sp tuyển chọn 83Bảng 4.12: Kết quả phân tích sản phẩm sau lên men của các chủng Clostridiumnghiên cứu 84Bảng 4.13: Chiều dài vùng gene 16S rDNA giải trình tự 88Bảng 4.14: Hệ số tương đồng di truyền của 8 chủng nghiên cứu với các chủng

Clostridium đã được công bố trên NCBI 89

Bảng 4.15: Ma trận (%) tương đồng di truyền 16S rDNA của các chủng

Clostridium nằm trong cluster I 92

- 7

-DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Tế bào sinh dưỡng C acetobutylicum 6

Hình 2.2: Sự hình thành bào tử ở C acetobutylicum trong lên men ABE 13

Hình 2.3: Quá trình tạo bào tử gồm 7 bước ở C saccharobutylicum 14

Hình 2.4: Chaim Weizmann (1874 – 1952) 16

Hình 2.5: C beijerinckii sLM01 hoạt động thủy phân cellulose 20

Hình 2.6: Con đường chuyển hóa acid và dung môi của Clostridium 22

Hình 2.7: Quá trình thay đổi hình thái, sinh dung môi kết hợp hình thành bào tử ở C acetobutylicum 27

Hình 2.8: Cấu trúc butanol (C4H9OH) 31

Hình 2.9: Xe 100% Butanol 34

Hình 2.10: Cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ của các loài Clostridium trong cluster I 38

Hình 3.1: Quy trình phân lập và định danh Clostridium sinh butanol 45

Hình 3.2: Đường chuẩn HPLC cho glucose 57

Hình 3.3: Đường chuẩn HPLC cho butanol 58

Hình 3.4: Bản đồ vùng gene 16S rDNA của Clostridium 63

Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc của một số chủng Clostridium sp phân lập 74

Hình 4.2: Hình dạng bào tử của một số chủng Clostridium sp 77

Hình 4.3: Sự lên men glucose của các chủng Clostridium sp phân lập 82

Hình 4.4: Lượng butanol tổng hợp của các chủng Clostridium sp được chọn sau 7 ngày lên men 85

Hình 4.5: Bảo quản các chủng vi khuẩn bằng phương pháp đông khô 86

Hình 4.6: Sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi 27F-1492R để khuếch đại vùng gen 16S rDNA 87

viii

-Hình 4.7: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 0586-S-21 và 1205-A-21 khuếch đại vùng gen 16S rDNA đặc trưng cho giống Clostridium 88Hình 4.8: Cây phát sinh loài tổng quát thể hiện mối quan hệ của các chủng

S-G-Clos-Clostridium DF3, DL1, DL2, DL3, DL4, DL5, PB7, PB10 với các chủng vi khuẩn

khác thuộc giống Clostridium 91

Hình 4.9: Cây phát sinh loài chi tiết thể hiện mối quan hệ của các chủng

Clostridium DF3, DL1, DL2, DL3, DL4, DL5, PB7, PB10 với các loài

Clostridium khác trong cluster I 94

NGUYỄN HỮU TRÍ 1

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

Kể từ năm 2000, các quốc gia trên thế giới lần lượt thật sự tuân thủ thoả

hiệp Rio de Janeiro (1992) và nghị định thư Kyoto (1997), tìm cách hạn chế thải khínhà kính (CO2, CH4, N2O, ) khi sử dụng nhiên liệu cổ sinh thay thế bằng nănglượng xanh (như năng lượng mặt trời, gió, thủy điện, ), do đó nhiên liệu sinh họcđang được quan tâm phát triển Nhiên liệu sinh học là loại chất đốt tái tạo, sản xuất

từ nguyên liệu động thực vật gọi là sinh khối, gọi là “tái tạo” vì chất đốt cơ bảncarbon (C) nằm trong chu trình quang hợp ngắn hạn, đốt nhiên liệu sinh học thải khíCO2, rồi thực vật hấp thụ lại CO2 đó để tạo thành sinh khối, chế biến nhiên liệu sinhhọc trên lý thuyết coi như không làm gia tăng CO2 trong khí quyển

Nhiên liệu sinh học có thể ở thể rắn như củi, than củi (than đá thuộc loại cổsinh, không tái tạo); thể lỏng (như xăng sinh học, diesel sinh học); hay thể khí nhưkhí methane sinh học (sản xuất từ lò ủ chất phế thải), hydrogen sinh học Nhiên liệu

ở thể lỏng được ưa chuộng hơn vì có độ tinh khiết cao, chứa nhiều năng lượng, dễdàng chuyên chở, dễ tồn trữ và bơm vào bình nhiên liệu của xe Nhiên liệu sinh họcđang là vấn đề quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới vì nhiều lý do: giá xăng cổsinh ngày càng cao, trữ lượng dầu thô và khí đốt ở các mỏ dầu có giới hạn và sẽ cạnkiệt trong tương lai (dự đoán khoảng năm 2100), nhiều quốc gia muốn ít phụ thuộcvào việc nhập khẩu nhiên liệu cổ sinh trong khi quốc gia họ có khả năng sản xuấtnhiên liệu thay thế, và bị áp lực chính trị phải giảm lượng khí CO2 sa thải để phùhợp với nghị định thư Kyoto (1997) quy định

Butanol, acetone, ethanol là những dung môi có khả năng sử dụng làm

nhiên liệu Hiện nay, ethanol đang được sử dụng nhiều, tuy nhiên người ta chú ý đếnbutanol hơn vì cấu tạo của nó có bốn nguyên tử carbon nên nặng hơn, ít bay hơi,đồng thời có khả năng tạo ra năng lượng cao hơn ethanol và acetone [45]

Với kỹ thuật hiện nay, có 2 phương thức hữu hiệu để chế biến nhiên liệusinh học:

?Cho lên men (nhờ vi sinh vật và enzyme trong điều kiện yếm khí) chất đường (từ mía, củ cải đường, v.v.), tinh bột [từ hạt ngũ cốc (bắp, lúa, lúa mì,v.v.) và củ (khoai tây, khoai mì, v.v.)], hay cellulose để tạo ra ethanol(C2H5OH), propanol (C3H7OH) và butanol (C4H9OH)

?Trích dầu từ thực vật, tảo giàu chất dầu, hay từ mỡ động vật (ép với áp

suất cao và nhiệt, hoặc bằng dung môi, hay phối hợp cả hai)

Trong đó các vi khuẩn lên men từ sinh khối để sinh dung môi có rất nhiều ưuthế như: hạn chế việc tổng hợp nên các hợp chất có khả năng gây ung thư, sử dụngtạo ra các dẫn xuất dung môi cung cấp cho nhu cầu của công nghiệp thực phẩm vàhương liệu; các phụ phế phẩm của nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm có thể trởthành nguồn cơ chất đầy tiềm năng, rẻ tiền cho quá trình lên men để sản xuất cácdung môi cho giá trị thương mại cao Tuy nhiên, việc tầm soát để phân lập và chọncác chủng vi sinh vật cần thiết là đòi hỏi đầu tiên trong các quy trình lên men sinhhọc hiện đại, đặc biệt là quá trình chuyển hóa trực tiếp các polysaccharide từ sinhkhối thành các sản phẩm có giá trị cao với sự hiện diện rộng rãi của các enzyme thủyphân ngoại bào rất được quan tâm

Giống Clostridium là tập hợp các loại vi khuẩn Gram dương, kị khí nghiêmngặt, tạo bào tử, hình que [9] Clostridium gồm nhiều chủng dễ dàng được phân lập

từ các mẫu đất ở những vùng miền khác nhau, có khả năng lên men tạo butanol cao,đặc biệt là một số loài có khả năng sử dụng cellulose làm nguồn cơ chất lên men,

các chủng Clostridium acetobutylicum, C beijerinckii, C butyricum, C.

saccharobutyricum, C saccharoperbutyricum… là những vi sinh vật tiềm năng nhất

[7]

Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới có độ đa dạng sinhhọc cao thuận lợi cho việc phân lập các chủng Clostridium sp Do vậy, việc phân lập,xác định vi khuẩn Clostridium có tiềm năng sinh dung môi từ các nguồn tài nguyênthiên nhiên của Việt Nam có ý nghĩa to lớn, góp phần khai thác tính đa dạng sinhhọc và đồng thời thúc đẩy nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học, vì vậy chúng tôitiến hành đề tài nghiên cứu: “PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨNCLOSTRIDIUM SP SINH TỔNG HỢP BUTANOL”.

Đề tài được thực hiện nhằm giải quyết các vấn đề:

1 Phân lập, sàng lọc và xác định các chủng vi khuẩn Clostridium sp kỵ khínghiêm ngặt, có khả năng sinh butanol từ các nguồn mẫu khác nhau như đấtcanh tác nông nghiệp, phân của động vật, bùn ao hồ

2 Kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng Clostridium sp phânlập được là Gram dương, hình thành nội bào tử, sinh tổng hợp butanol

3 Xác định khả sinh tổng hợp butanol của các chủng Clostridium sp phânlập được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao năng HPLC

4 Định danh các chủng Clostridium sp phân lập được bằng kỹ thuật sinh họcphân tử: tách chiết DNA bằng DNAzol Direct PCR, khuếch đại đoạn gene16S rDNA có kích thước 1,5 kb sử dụng cặp mồi Eubac27F và 1492R Cácsản phẩm khuếch đại được tinh sạch và giải trình tự, xây dựng cây phát sinhloài để xác định mối quan hệ giữa các loài phân lập được

NGUYỄN HỮU TRÍ 1

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

Kể từ năm 2000, các quốc gia trên thế giới lần lượt thật sự tuân thủ thoả

hiệp Rio de Janeiro (1992) và nghị định thư Kyoto (1997), tìm cách hạn chế thải khínhà kính (CO2, CH4, N2O, ) khi sử dụng nhiên liệu cổ sinh thay thế bằng nănglượng xanh (như năng lượng mặt trời, gió, thủy điện, ), do đó nhiên liệu sinh họcđang được quan tâm phát triển Nhiên liệu sinh học là loại chất đốt tái tạo, sản xuất

từ nguyên liệu động thực vật gọi là sinh khối, gọi là “tái tạo” vì chất đốt cơ bảncarbon (C) nằm trong chu trình quang hợp ngắn hạn, đốt nhiên liệu sinh học thải khíCO2, rồi thực vật hấp thụ lại CO2 đó để tạo thành sinh khối, chế biến nhiên liệu sinhhọc trên lý thuyết coi như không làm gia tăng CO2 trong khí quyển

Nhiên liệu sinh học có thể ở thể rắn như củi, than củi (than đá thuộc loại cổsinh, không tái tạo); thể lỏng (như xăng sinh học, diesel sinh học); hay thể khí nhưkhí methane sinh học (sản xuất từ lò ủ chất phế thải), hydrogen sinh học Nhiên liệu

ở thể lỏng được ưa chuộng hơn vì có độ tinh khiết cao, chứa nhiều năng lượng, dễdàng chuyên chở, dễ tồn trữ và bơm vào bình nhiên liệu của xe Nhiên liệu sinh họcđang là vấn đề quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới vì nhiều lý do: giá xăng cổsinh ngày càng cao, trữ lượng dầu thô và khí đốt ở các mỏ dầu có giới hạn và sẽ cạnkiệt trong tương lai (dự đoán khoảng năm 2100), nhiều quốc gia muốn ít phụ thuộcvào việc nhập khẩu nhiên liệu cổ sinh trong khi quốc gia họ có khả năng sản xuấtnhiên liệu thay thế, và bị áp lực chính trị phải giảm lượng khí CO2 sa thải để phùhợp với nghị định thư Kyoto (1997) quy định

Butanol, acetone, ethanol là những dung môi có khả năng sử dụng làm

nhiên liệu Hiện nay, ethanol đang được sử dụng nhiều, tuy nhiên người ta chú ý đếnbutanol hơn vì cấu tạo của nó có bốn nguyên tử carbon nên nặng hơn, ít bay hơi,đồng thời có khả năng tạo ra năng lượng cao hơn ethanol và acetone [45]

Với kỹ thuật hiện nay, có 2 phương thức hữu hiệu để chế biến nhiên liệusinh học:

?Cho lên men (nhờ vi sinh vật và enzyme trong điều kiện yếm khí) chất đường (từ mía, củ cải đường, v.v.), tinh bột [từ hạt ngũ cốc (bắp, lúa, lúa mì,v.v.) và củ (khoai tây, khoai mì, v.v.)], hay cellulose để tạo ra ethanol(C2H5OH), propanol (C3H7OH) và butanol (C4H9OH)

?Trích dầu từ thực vật, tảo giàu chất dầu, hay từ mỡ động vật (ép với áp

suất cao và nhiệt, hoặc bằng dung môi, hay phối hợp cả hai)

Trong đó các vi khuẩn lên men từ sinh khối để sinh dung môi có rất nhiều ưuthế như: hạn chế việc tổng hợp nên các hợp chất có khả năng gây ung thư, sử dụngtạo ra các dẫn xuất dung môi cung cấp cho nhu cầu của công nghiệp thực phẩm vàhương liệu; các phụ phế phẩm của nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm có thể trởthành nguồn cơ chất đầy tiềm năng, rẻ tiền cho quá trình lên men để sản xuất cácdung môi cho giá trị thương mại cao Tuy nhiên, việc tầm soát để phân lập và chọncác chủng vi sinh vật cần thiết là đòi hỏi đầu tiên trong các quy trình lên men sinhhọc hiện đại, đặc biệt là quá trình chuyển hóa trực tiếp các polysaccharide từ sinhkhối thành các sản phẩm có giá trị cao với sự hiện diện rộng rãi của các enzyme thủyphân ngoại bào rất được quan tâm

Giống Clostridium là tập hợp các loại vi khuẩn Gram dương, kị khí nghiêmngặt, tạo bào tử, hình que [9] Clostridium gồm nhiều chủng dễ dàng được phân lập

từ các mẫu đất ở những vùng miền khác nhau, có khả năng lên men tạo butanol cao,đặc biệt là một số loài có khả năng sử dụng cellulose làm nguồn cơ chất lên men,

các chủng Clostridium acetobutylicum, C beijerinckii, C butyricum, C.

saccharobutyricum, C saccharoperbutyricum… là những vi sinh vật tiềm năng nhất

[7]

Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới có độ đa dạng sinhhọc cao thuận lợi cho việc phân lập các chủng Clostridium sp Do vậy, việc phân lập,xác định vi khuẩn Clostridium có tiềm năng sinh dung môi từ các nguồn tài nguyênthiên nhiên của Việt Nam có ý nghĩa to lớn, góp phần khai thác tính đa dạng sinhhọc và đồng thời thúc đẩy nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học, vì vậy chúng tôitiến hành đề tài nghiên cứu: “PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨNCLOSTRIDIUM SP SINH TỔNG HỢP BUTANOL”.

Đề tài được thực hiện nhằm giải quyết các vấn đề:

1 Phân lập, sàng lọc và xác định các chủng vi khuẩn Clostridium sp kỵ khínghiêm ngặt, có khả năng sinh butanol từ các nguồn mẫu khác nhau như đấtcanh tác nông nghiệp, phân của động vật, bùn ao hồ

2 Kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng Clostridium sp phânlập được là Gram dương, hình thành nội bào tử, sinh tổng hợp butanol

3 Xác định khả sinh tổng hợp butanol của các chủng Clostridium sp phânlập được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao năng HPLC

4 Định danh các chủng Clostridium sp phân lập được bằng kỹ thuật sinh họcphân tử: tách chiết DNA bằng DNAzol Direct PCR, khuếch đại đoạn gene16S rDNA có kích thước 1,5 kb sử dụng cặp mồi Eubac27F và 1492R Cácsản phẩm khuếch đại được tinh sạch và giải trình tự, xây dựng cây phát sinhloài để xác định mối quan hệ giữa các loài phân lập được

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về giống Clostridium

Clostridium là các loài bao gồm tập hợp các loài Gram dương, kị khí nghiêm

ngặt, hình thành nội bào tử và hình que, hơn 150 loài đã được xác nhận cho thấy sự

đa dạng về kiểu hình, các đặc điểm sinh lý và môi trường phân bố Nhiều loài sinhtrưởng kị khí lên men điển hình, năng lượng bắt nguồn từ sự oxi hóa không hoàntoàn các hợp chất hữu cơ [9], [13]

Các chủng Clostridium sp có sự phân bố rất đa dạng, pH thích hợp từ 6,5 7,0 Tuy nhiên, có những loài có khả năng thích nghi với pH cao thấp hơn tùy theokhả năng trao đổi chất của chúng vì pH làm ảnh hưởng đến khả năng sử dụng đường

-và từ đó dẫn tới những sự giải thích nhầm lẫn về khả năng sử dụng đường của các visinh vật này (trong điều kiện thí nghiệm) [35]

Hình 2.1 Tế bào sinh dưỡng C acetobutylicum [31]

Một số loài có tiềm năng lớn trong công nghệ sinh học, sản xuất các nhiên

liệu sinh học butanol, acetone, ethanol (ABE) như Clostridium acetobutylicum,

Clostridium beijerinckii, Clostridium butyricum, Clostridium saccharobutylicum Bên cạnh đó, một vài chủng lại gây bệnh nguy hiểm như Clostridium perfringens gây bệnh đường ruột, Clostridium difficile gây bệnh tiêu chảy và viêm kết tràng,

Clostridium tetani gây bệnh uốn ván, Clostridium botulinum gây ngộ độc thực phẩm.

Tuy nhiên, một vài độc tố của chúng được xác nhận có giá trị trong ứng

dụng y khoa và mỹ phẩm, vì vậy mà Clostridium thuộc nhóm hữu ích trong côngnghiệp [39].

Theo Bergey’s Manual, Clostridium được phân loại:

Trong suốt hai thập kỉ trước, các nhà khoa học trên thế giới đã nỗ lực khôngmệt mỏi để hiểu được con đường sinh tổng hợp dung môi, được cụ thể bằng hàngloạt hội thảo, hội nghị về sinh hóa và di truyền tổ chức ở Salisbury, Anh (1990),Blacksburg, VA, Mỹ (1992), Evanston, IL, Mỹ (1994), Ulm, Đức (1996), Toulouse,Pháp (1998), Urbana-Champaign, IL, Mỹ (2000) và Rostock,

Đức (2002) Quá trình điều hòa các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

dung môi và điều chỉnh dòng năng lượng trong trao đổi chất của Clostridium đãđược khám phá, trình tự của hầu hết các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

dung môi và acid đã được xác định [16] Bản đồ vật lý về NST của C.

acetobutylicum ATCC 824, C beijerinckii NCIMB 8052 và C saccharobutylicum NCP 262 đã được xây dựng [33], [50] Những nghiên cứu về phân loại học cho phép

xác định đúng về các chủng vi khuẩn được phân lập và sử dụng ở các phòng thí

nghiệm trước đây cho rằng tất cả đều là loài C acetobutylicum [29], [30] Rất nhiều

enzyme liên quan đến quá trình sinh dung môi của C acetobutylicum hoặc của C.

beijerinckii hoặc cả hai loài đã được khám phá [10], [16] Chương trình giải trình tự

bộ gen C acetobutylicum ATCC 824 đã hoàn thành và đóng vai trò quan trọng

trong việc làm sáng tỏ đặc điểm di truyền cũng như quá trình sinh tổng hợp dungmôi của vi khuẩn này [49] Những nghiên cứu này cho thấy hoàn toàn có thể cải

thiện được quá trình lên men sinh tổng hợp dung môi của các chủng Clostridium sp.

Một số loài Clostridium sp đã được nghiên cứu tận tường về sự trao đổichất cũng như những phản ứng sinh hóa quan trọng, trong đó rõ ràng nhất là

Clostridium saccharobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium beijerinckii, và Clostridium acetobutylicum [33].

Clostridium acetobutylicum: C acetobutylicum có khả năng làm tan

gelatin và lên men được raffinose, ngoài ra C acetobutylicum có khả năng lên mensaccharose, pectin và lên men yếu turanose

Clostridium beijerinckii: C beijerinckii, trước đây được gọi là C.

acetobutylicum, là vi khuẩn Gram dương, hình thành bào tử và có hình que C beijerinckii có khả năng biến dưỡng các polysaccharide thành các acid như acetate

và butyrate hoặc thành các dung môi bao gồm acetone, butanol và ethanol C.beijerinckii không có khả năng thủy phân gelatin (ngoại trừ chủng NRRL B593), cókhả năng lên men saccharose, methyl-glucopyranoside, turanose, dextrin, pectin,

có khả năng sử dụng các đường D- và L- arabitol, dulcitol và inositol, nhưng dùngglycerol yếu [34]

Clostridium saccharoperbutylacetonicum (mô tả loài vi khuẩn có khả năng

tổng hợp một lượng lớn butanol và acetone từ đường) C

saccharoperbutylacetonicum lần đầu tiên mô tả bởi Hongo (1960) trong US patent

số 2 945 786 Loài C saccharoperbutylacetonicum ngày nay đã được xác định dựavào phân tích trình tự g e n e 16S rRNA và lai DNA-DNA [30], [33] C .saccharoperbutylacetonicum N1-4 có khả năng sử dụng albumin đã đông rất yếuhoặc âm tính, khả năng lên men arabinose, xylose, glucose, mannose, cellobiose,lactose, maltose, saccharose, D-arabitol, L-arabitol, mannitol, melibiose, methyl-glucopyranoside, raffinose, salicin, trehalose, turanose, amygdalin, starch,glycogen, dextrin, pectin, melezitose và inulin Không có sự hình thành cục đôngsữa sau 48 giờ và không tổng hợp riboflavin [30] Sản phẩm lên men là acid acetic

và butyric, acetone, butanol, ethanol, CO2 và H2 Những chủng này được sử dụngtrong quá trình lên men tổng hợp các dung môi acetone, butanol và ethanol từ nhiềunguồn cơ chất đường và tinh bột

Clostridium saccharobutylicum:(có khả năng tổng hợp butanol từ

đường), chủng này được sử dụng trong công nghiệp lên men được phân lập bởi tậpđoàn Commercial Solvents Corporation dùng dưới cái tên ‘Clostridium saccharo-butyl-acetonicum-liquefaciens’ [33] Loài này có khả năng sử dụng

saccharose, là loài Clostridium sp có khả năng sinh dung môi được nghiên cứulần đầu bởi Arzberger (1938) và Carnarius & McCutchan (1938) Những chủng lênmen công nghiệp này sau đó được gọi như C acetobutylicum.

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu về Clostridium sinh butanol

Sự tổng hợp butanol sinh học hay còn gọi là biobutanol lần đầu tiên đượcnghiên cứu và mô tả bởi nhà khoa học nổi tiếng Louis Pasteur Ông sử dụng chủngVibrion butyrique nuôi cấy trong một môi trường không đảm bảo là thuần khiết, vìvậy có thể chứa thêm cả Clostridium butyricum, và nó tổng hợp butanol dưới mộtđiều kiện đặc biệt [39], [40] Điểm đặc biệt trong nghiên cứu của Pasteur là hướngđến một khía cạnh quan trọng trong sinh học, ông là người đầu tiên chứng minhrằng sự sống có thể tồn tại được trong điều kiện không có oxy Dựa vào những điềuquan sát được, ông đưa ra thuật ngữ “anaerobic” [39] Ngoài ra cũng còn nhiều nhàkhoa học nổi tiếng khác cũng nghiên cứu về sự tổng hợp biobutanol, trong đó cóBeijerinck và Winogradsky Tuy nhiên, Fitz là người đầu tiên phân lập và nuôi cấythuần được chủng vi khuẩn mà ông gọi là Bacillus butylicus [17]

Thuật ngữ Clostridium sau đó được giới thiệu bởi Prazmowski (1880),

thuật ngữ Clostridium bắt nguồn từ “kloth” trong tiếng Hi Lạp có nghĩa là “que

nhỏ” Loài thuộc giống Clostridium được biết đến lần đầu tiên là C butyricum

(Prazmowski, 1880) Năm 1912, Chaim Weizmann đã thành công trong việc phân lập

loài C acetobutylicum có khả năng tổng hợp butanol cao và được gọi là “Weizmannorganism” [17]

Đến thế kỷ XXI, người ta đã phân lập hơn 150 loài Clostridium sp khácnhau và có tác động to lớn về cả khía cạnh công nghệ sinh học cũng như thương mại[17]

2.1.2 Cấu trúc và hình thái tế bào

Clostridium là trực khuẩn Gram dương, kị khí, sinh nội bào tử, phần lớn di

động nhờ các tiên mao mọc khắp quanh cơ thể, tế bào sinh dưỡng hình que nhưng vìbào tử có kích thước lớn hơn chiều ngang của tế bào sinh dưỡng nên bào tử tế bào sẽ

có dạng hình thoi hay hình dùi trống, có thể thủy giải saccharide và protein Chúngphân bố rộng rãi trong tự nhiên, hiện diện thường xuyên trong đất, bùn ruộng, bùn

ao, có thể gây bệnh cho người và động vật, gây hư hỏng thực phẩm, sinh khí H2Sgây mùi khó chịu [16]

Tế bào của hầu hết giống Clostridium có dạng hình que thẳng hoặc cong,phần đầu có thể là nhọn, tù hoặc tròn, đường kính và chiều dài tùy thuộc vào loài,

thời kì phát triển và thành phần môi trường nuôi cấy [37] C acetobutylicum có kích thước khoảng 0,6 – 0,72?m, chiều dài 2,6 – 4,7?m C butyricum có kích thước

khoảng 0,5?m, chiều dài 4 – 12?m Trong điều kiện môi trường không thích hợp

cho sự sinh trưởng, các tế bào sinh dưỡng chuyển hóa thành nội bào tử, nội bào tửkhông hoạt động mà có thể chịu đựng khi gặp điều kiện khắc nghiệt Nội bào tử cóthể có hình tròn hay bầu dục, có vị trí ở giữa, ở một đầu hay gần một đầu của tế bào

mẹ tùy thuộc vào mỗi loài và chúng thường làm căng phồng tế bào [17]

Thành tế bào Clostridium chứa peptidoglycan, một vài giống có thể có acidteichoic, ngoài ra còn chứa các hợp chất phosphate Dưới kính hiển vi điện tử,người ta thấy rằng các tế bào này có thành tế bào một lớp, là điển hình của vi khuẩn

Gram dương Phân tích lớp chất béo trong màng tế bào Clostridium, chủ yếu là

nhóm C butyricum, người ta thấy có sự hiện diện của glycerophospholipid tồn tại

trong cả hai dạng diacyl và plasmalogen (1-alk-1’– enyl-2-acyl) Những thay đổinhiệt độ sinh trưởng kéo theo những thay đổi trong chuỗi acyl, alkyl và thành phầnlớp chất béo, nó cũng chống lại ảnh hưởng của dung môi lên cấu trúc

tế bào bằng cách gia tăng tỷ lệ những chuỗi acyl bão hòa và không bão hòa.

Việc đột biến Clostridium nâng cao nồng độ acetone, butanol, ethanol tạo thành dẫnđến màng tế bào phải thay đổi thành phần cấu tạo lipid để có cơ chế bảo vệ phù hợp[17]

Khoảng nhiệt độ tối thích giữa các chủng Clostridium là khác nhau rất lớn, từnhững chủng ưa nhiệt đến ưa lạnh, chủ yếu là kị khí hoàn toàn sinh trưởng ở nhiệt độtốt nhất từ 30 – 40oC Một số loại ưa nhiệt thì nhiệt độ thích hợp từ 60 –

70oC, được chú ý bởi những enzyme chịu nhiệt và tiềm năng trong các quá trìnhlên men Hiện nay C themohydrosufuricum, C themosulfurogenes được xếp loạithuộc giống Themoanaerobacter và Themoanaerobacterium được nghiên cứuenzyme phân giải polysaccharide Những chủng ưa lạnh có số lượng ít hơn, đại diện

là C estertheticum, C putrefaciens có thể sinh trưởng thích hợp ở những nhiệt độthấp 25oC, không sinh trưởng ở dưới 22oC và trên 30oC [39]

Phần lớn các loài Clostridium sp là dị dưỡng, chúng có thể thủy phânsaccharose hay thủy phân protein hoặc cả hai Môi trường phức chất chứa cao nấmmen, cao thịt, peptone với đường có khả năng lên men đã được sử dụng từ lâu.Chúng có nhu cầu chung về muối, những nguyên tố vi lượng (vết), và vitamin như:p-aminobenzoate, biotin, và thiamine, nhưng nhu cầu về amino acid, purine,pyrimidine thì khác nhau [40]

tế bào chuyển từ dạng tế bào sinh dưỡng đến lúc hình thành bào tử Vào những năm

1960 và 1970, nhờ vào sự phát triển của các phương pháp nuôi

cấy và sử dụng các kính hiển vi điện tử hiện đại đưa đến những hiểu biết chi tiết

về bào tử vi khuẩn cũng như quá trình phát sinh tạo bào tử ở vi khuẩn [17]

Dễ dàng nhận ra rằng do các điều kiện bất lợi mà rõ ràng nhất là tình trạngcạn kiệt dinh dưỡng đã khởi đầu cho sự hình thành nội bào tử Một ngoại lệ là ởClostridium acetobutylicum khi sự tích lũy của các sản phẩm cuối acid là nguyênnhân ức chế tế bào phân chia và khởi đầu cho quá trình sinh dung môi dẫn tới sựthay đổi hình thái tế bào [31]

Hình 2.2: Sự hình thành bào tử ở C acetobutylicum trong lên men ABE [31] Thông thường, sự hình thành bào tử xảy ra khi chất dinh dưỡng bắt đầu

cạn kiệt, nguồn nitrogen cũng có thể là yếu tố cần thiết cho sự hình thành bào

tử Những yếu tố khác cũng có khả năng ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử như:

pH, oxy và nhiệt độ Sự tăng khả năng tiêu thụ cơ chất thường thấy trong giai đoạnđầu của quá trình hình thành bào tử trong khi ở một vài giống của C botulinum,nguồn carbon dự trữ nội sinh được sử dụng trong suốt quá trình hình thành bào tử[17]

2.1.3.1 Đặc tính của bào tử

Bào tử có thể có hình tròn hay bầu dục, bào tử có thể hình thành chính giữa

tế bào, ở một đầu hay gần một đầu của tế bào Khi đường kính của bào tử không lớnhơn đường kính của tế bào thì vi khuẩn thường thuộc giống Bacillus, còn khi đườngkính của bào tử lớn hơn đường kính của tế bào thì vi khuẩn thuộc

giống Clostridium, trong trường hợp này tế bào bị căng phồng ra bởi bào tử Sựhình thành bào tử trong vòng vài giờ phụ thuộc vào hình thái, sinh lý học và nhữngthay đổi hóa sinh [31].

Quá trình tạo bào tử ở C saccharobutylicum khởi đầu bằng sự tích lũy củacác thể hạt tại cuối của pha bùng nổ Thể hạt là một cao phân tử polyglucan, cóchứa duy nhất liên kết ?(1- 4) của các đơn phân D-glucopyranose và sử dụng chúnglàm nguồn carbon và nguồn năng lượng cho quá trình hình thành và trưởng thànhcủa bào tử Tương tự, một polyme phân nhánh không hoàn chỉnh như vậy cũng

được phát hiện ở C botulinum, C butyricum, và C pasteurianum.

Hình 2.3: Quá trình tạo bào tử gồm 7 bước ở C saccharobutylicum [17] Chính

sự tích lũy dẫn đến sự căng phồng, có hình giống như điếu xì gà,

xác định tình trạng bắt đầu hình thành bào tử mạnh mẽ của Clostridium, quá trìnhnày là nét khác biệt chính so với Bacillus Sau đó, sự phân chia không cân xứng ở tếbào gốc, tạo ra hai ngăn là tế bào mẹ lớn hơn và tiền bào tử nhỏ hơn Vách của tếbào gốc vẫn bao quanh cả hai ngăn, màng tế bào chất của tế bào mẹ phát triển baoquanh tiền bào tử, thậm chí nhấn chìm nó hoàn toàn Vùng vỏ có chứa peptidoglycan

và thêm một ít protein, được sinh tổng hợp giữa hai lớp màng Lớp áo gồm vài lớpprotein, được hình thành phía ngoài màng của tiền

bào tử Sau khi hoàn thành, sự ly giải tế bào mẹ xảy ra và nhờ đó bào tử được

giải phóng ra ngoài môi trường Quá trình tạo bào tử vi khuẩn được chia thành 7bước thay đổi hình thái tế bào (hình 2.3), với bước cuối cùng là sự phóng thích bào

tử từ tế bào mẹ [17]

2.1.3.2 Sự nảy mầm bào tử

Trong điều kiện thích hợp, bào tử có thể quay về dạng tế bào sinh dưỡng, sựbiến đổi này được gọi là sự nảy mầm, quá trình nảy mầm bao gồm ba bước: sự hoạthóa, sự nảy mầm và sự phát triển tăng nhanh số lượng tế bào

Sự hoạt hóa là gia tăng tỷ lệ và quy mô của sự nảy mầm, có thể được thựchiện bằng cách gia tăng nhiệt độ dưới ngưỡng gây chết Sự nảy mầm của bào tửClostridium có thể được bắt đầu bởi những chất dinh dưỡng khác nhau gồm: cácacid amin (đặc biệt là L–alanine), các loại đường, lactate, nicotinamide và những hóachất không phải là chất dinh dưỡng như bicarbonate nhưng chúng lại bị ức chế bởioxy Trong suốt giai đoạn nảy mầm, vùng lõi được biến đổi thành tế bào chất vớiribosome và nhân tế bào Giai đoạn phát triển hình thành tế bào được hoàn tất bởi sựtổng hợp RNA, protein, màng tế bào, thành tế bào và DNA Giai đoạn nảy mầm vàtăng sinh được thực hiện trong túi bào tử và kết quả là tế bào sinh dưỡng được phóngthích ra ngoài [17]

2.2 Quá trình lên men sinh dung môi ABE ở Clostridium

2.2.1 Lịch sử của quá trình lên men ABE

Quá trình lên men tổng hợp acetone-butanol đóng vai trò và ảnh hưởng rấtqua trọng trong công nghệ sinh học lẫn chính trị Trong những năm 1913-

1915, Weizman nghiên cứu tại đại học Manchester (Anh quốc) đã phân lập

thành công loài vi khuẩn Clostridium acetobutylicum thực hiện quy trình lên menacetone – butanol – ethanol, chu trình này sau đó được gọi là lên men ABE, chính

là viết tắt của acetone – butanol – ethanol [18]

Hình 2.4: Chaim Weizmann (1874 – 1952) nhà hóa học người Nga sau này trở thành tổng thống đầu tiên của Israel (Dominik Antoni và cs, 2007).

Quy trình Weizmann, sử dụng C acetobutylicum được chọn để trở thành quytrình lên men ở các nước, sau đó được sử dụng trong các nhà máy sản xuất rượu ởCanada (Toronto) và Hoa Kỳ (Terre Haute) [27] Sự thành công trong việc tổng hợpnguồn acetone khổng lồ phục vụ cho chiến tranh đưa lại cho Weizmann nhiều thứ: tiền bạc

và quyền lực, khi nhà nước Israel được thành lập vào năm 1947, Weizmann trở thành tổngthống đầu tiên của Israel Vì vậy, một trong những vi khuẩn có tác động ảnh hưởngđến chính trị rõ ràng nhất đó chính là C acetobutylicum [18]

Sau khi chiến tranh kết thúc vào năm 1918, nhu cầu về acetone sụt giảm vàcác nhà máy sản xuất acetone bị đóng cửa Trong suốt thời gian chiến tranh, butanolđược xem là một sản phẩm không cần thiết và được chứa trong các thùng lớn Mặtkhác, cuộc cách mạng do Henry Ford (sáng lập hãng ô tô Ford nổi tiếng của HoaKỳ) đề nghị cần sử dụng một dung môi làm khô nhanh nitrocellulose trong sơn phủphục vụ cho công nghiệp sản xuất ô tô, mà phù hợp nhất là butyl acetate (đượctổng hợp từ nguồn nguyên liệu chính là butanol), điều này dẫn đến việc mở cửa trởlại đồng thời xây dựng thêm nhiều các nhà máy ở nhiều khu vực trên toàn thế giới.Vào năm 1945, 2/3 butanol sử dụng trong công nghiệp được tổng hợp nhờ sinh học,

vì vậy quá trình lên men acetone-butanol là một trong

những quy trình sinh học lớn nhất đã từng được thực hiện (tổng thể tích lên menchỉ đứng sau lên men ethanol) [39].

Trong suốt thế chiến II, mục tiêu lại tập trung vào sản xuất acetone nhưngsau chiến tranh giá cơ chất tăng lên cộng với hàm lượng đường trong mật rỉ thấpnên quá trình tổng hợp các dung môi từ sản phẩm dầu mỏ rẻ hơn so với quá trìnhlên men Sau đó quá trình tổng hợp sinh học bị gián đoạn và chỉ được tiếp tục ở một

số nước bị giới hạn về nguồn cung dầu mỏ (ví dụ, Ai Cập, Nam Phi, Trung Quốc).Vào năm 1973 với “cơn khủng hoảng dầu mỏ” các nhà khoa học lại chuyển sang sửdụng quá trình lên men để tổng hợp và sản xuất được tái phục hồi, các phương phápsinh học phân tử và điều hòa mới được ứng dụng [39]

Nguồn polysaccharide trong sinh khối thực vật là một nguồn năng lượng

dự trữ khổng lồ có thể phân tách và thu nhận thông qua các quá trình xử lý sinh họcnhằm thu nhận các dạng nhiên liệu sinh học Có thể tiến hành lên men carbohydratenhằm thu nhận các hợp chất C2, C3, C4 (ethanol, acetone, isopropanol, butanol)được biết bởi các loài vi khuẩn nhiệt trung có hoạt tính phân giải đường như

Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii và các chủng khác có liên

quan [23].

Trong lịch sử, hai loài Clostridium acetobutylicum và Clostridium

butylicum đã được sử dụng hoặc phát triển để lên men tổng hợp dung môi tuy nhiên

theo Montoya và cs, 2005 khi tiến hành phân lập các chủng Clostridium sinh dung

môi ở Colombia thì theo đặc tính sinh lý và định danh các chủng được phân loại là

loài Clostridium butylicum [39]

Quy trình lên men acetone–butanol–ethanol (ABE) được thực hiện ở quy môcông nghiệp tại Mỹ trong suốt nửa đầu của thế kỷ trước nhưng bị gián đoạn vàonhững năm đầu thập niên 1960 do không cạnh tranh nổi so với các loại nhiên liệu vàhóa chất của ngành công nghiệp dầu mỏ, hiện nay được sử dụng như một

giải pháp tiềm năng nhất trong việc tổng hợp các dung môi để làm nhiên liệu

nhằm hai mục đích chính đó là thay thế các nguồn nhiên liệu cổ sinh đang gần cạn kiệt và giảm các khí thải gây hiệu ứng nhà kính [38]

2.2.2 Cơ chất lên men ABE của Clostridium

Trước đây, bột bắp, bột mì và mật rỉ là những cơ chất phổ biến cho lên menthương mại, giá của butanol cao do phụ thuộc vào giá cao của nguồn nguyên liệu[35], [47] Do giá thành cao nên lên men ABE từ những cơ chất này không có tínhkhả thi về mặt kinh tế, các polysaccharide như cellulose, xylan, tinh bột, pectinđược phân bố rộng rãi trong sinh khối thực vật và có thể là những cơ chất quan

trọng cho Clostridium trong tự nhiên Clostridium có khả năng chuyển hóa cơ chất

trong phạm vi khá rộng, bao gồm các loại đường từ các monosaccharide đến

disaccharide như glucose, xylose, cellobiose và các phân tử polyme lớn như xylanhay tinh bột Ngày nay, người ta chú ý đến nguồn phế thải trong nông nghiệp nhưrơm rạ khô, chất xơ từ xác thực vật (có chứa cellulose, lignocellulose, hemicellulose)làm nguồn cơ chất sản xuất dung môi với giá rẻ, mang lại nhiều lợi ích cho nhà sảnxuất cũng như phục vụ cho nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng cao [14], [20]

Clostridium thủy phân cellulose có thể được phân lập từ các môi trường đa

dạng bao gồm đất, bùn, phân động vật ăn cỏ và xác bã thực vật đang phân hủy ởnhiều vùng và nhiều khu vực khác nhau Thêm vào đó, những vi sinh này có thểphân lập được từ ruột của các loài động vật ăn cỏ, nước thải, phân compost và ruộtcủa các loài động vật ăn cỏ, các loài động vật ăn gỗ như mối… (Bảng 2.1) Các loàiClostridium sp có khả năng thủy phân cellulose thuộc nhóm vi khuẩn có khả năngphân hủy các polysaccharide và có khả năng phát triển nhanh trong môi trường có sựtích lũy của xác bã thực vật Sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát celluloseđang bị phân hủy trong môi trường nuôi cấy Clostridium

Loài Nguồn phân lập Nhiệt độ tối ưu (oC) Sản phẩm lên men

Clostridium chartatabidum Dạ cỏ 38–42 A, B, E

“Clostridium longisporum” Dạ cỏ 35–42 F, B, A, EClostridium cellobioparum Dạ cỏ 30–37 A, E, F, L

Clostridium cellulolyticum Cỏ ủ 32–35 A, E, L, F

Clostridium hungatei Đất 30–40 A, E, L, F

Clostridium stercorarium Phân compost 65 A, E, LClostridium cellulosi Phân compost 55–60 A, E

Clostridium thermocopriae động vật, suối nướcĐất, compost, phân

Clostridium herbivorans Ruột heo 39–42 B, F, E

C.polysaccharolyticum Dạ cỏ 30–38 F, B, E(v)

Clostridium lenticellum Bùn sông 40 A, E, L(v)

thường ta sẽ thấy cĩ những tế bào cĩ khả năng di động được như kiểu bơi trongmơi trường lỏng, các tế bào quấn vào trong sợi cellulose hoặc bám vào một đầu củasợi cellulose Ngồi ra, các lồi Clostridium sp thủy phân cellulose cĩ thể tạo màngtrên cơ chất khơng tan, cellulose được tìm thấy trong thành tế bào thực vật, là nhữngchuỗi nối tiếp song song ?-1,4-glucoside Sự th?y phân cellulose tinh thể phụ thuộcvào hoạt động phối hợp của hai loại enzyme cellulose: ?-1,4 - endoglucanase cắt cácchuỗi một cách ngẫu nhiên và ?-1,4-exoglucanase (cellobiohydrolases) biến đổi cácđơn vị cellobiose từ đầu khơng khử [22]

Bảng 2.1 Clostridium thủy phân cellulose và sản phẩm tương ứng [22]

Tất cả các chủng kiểm tra đều sinh CO2 và H2 trong quá trình lên men cellulose Sản phẩm được liệt kê theo trật tự sản phẩm trội hơn

Ký hiệu: A, acetate; B, butyrate; E, ethanol; F, formateL, lactate; (v), vết.

Xylan là một polyme nhánh, chủ yếu là ?-1,4-xylose nhưng cũng chứa

những thành phần khác như arabinose, glucose, galactose và glucuronate, nĩ là thànhphần chính của hemicellulose, cấu thành gần 30% khối lượng thành tế bào th?c vật.Xylan được phân hủy bởi hoạt động phối hợp của endoxylanase và ?-

xylosidase Một số loài Clostridium sp có khả năng tổng hợp enzyme xylanase.

Hệ cellulosome của C thermocellum chứa xylanase nhưng không có hoạt tính ? xylosidase vai trò sinh lý của xylanase có thể làm gia tăng sự ảnh hưởng củacellulose đến những enzyme phân giải trong hệ cellulosome [22]

-Hình 2.5: C beijerinckii sLM01 hoạt động thủy phân cellulose [34]

Tinh bột là một polyme rẻ và phong phú với hai thành phần: amylose vàamylopectin Sự thủy phân được thực hiện bằng enzyme ?-amylase và ?- amylase,trong khi những nối ?-1,6 trong amylopectin được thủy phân bởi enzymepullulanase, hoạt động phối hợp của pullulanase và amylase đã được chứng minh

và những chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân loại này là C.thermohydrosulfuricum và C thermosulfurogenes

2.2.3 Con đường biến dưỡng ABE ở C acetobutylicum

Clostridium sử dụng con đường Embden-Meyerhof để tiêu thụ đường

hexose (bao gồm mono-, di-, tri-, và polysaccharides) với 1 mol hexose được chuyểnthành 2 mol pyruvate, kết quả là tạo ra 2 mol ATP và 2 mol NADH Đường pentoseđược biến dưỡng bằng con đường pentose phosphate Pentose được chuyển thànhpentose 5 -phosphate bởi enzyme transketolases - transaldolase, sản phẩm của sựkhử glucose 6-phosphate và glyceraldehyde-3 phosphate sẽ đi vào chu trình đườngphân, 3 mol pentose thu được 5 mol NADH Các đường acid, như là gluconate, đượcbiến dưỡng thông qua con đường Entner- Doudoroff [5]

Pyruvate là nhân tố trung tâm trong con đường tổng hợp nên các sản phẩmdung môi, nó được chuyển thành acetyl-CoA bởi enzyme pyruvate ferredoxin-oxide reductase bởi tất cả các loài Clostridium sp trong quá trình lên men Thêmvào việc acetyl-CoA, CO2 và sản phẩm ferredoxin bị khử được tạo thành trong suốtquá trình lên men Nhiều chủng Clostridium sp sử dụng NADH ferredoxin-oxidoreductase như là enzyme chìa khóa cần acetyl CoA để hoạt hóa và NAD+(sinh ra bởi sản phẩm của sự khử bởi enzyme ferredoxin- oxidoreductase) để tạothành NADPH bằng sinh tổng hợp Dưới điều kiện NADPH thích hợp, ferredoxin ởdạng khử chuyển điện khử cho Sắt chứa trong enzyme hydrogenase, cho phép sửdụng proton là chất nhận điện tử cuối cùng, kết quả là tổng hợp nên hydro (H2).Ferrodoxin chuyển thành dạng oxy hóa trong suốt quá trình này và hydro được giảiphóng ra khỏi tế bào ở dạng khí [5]

Quá trình lên men của Clostridium tổng hợp acetone-butanol là một quá trìnhlên men gồm hai giai đoạn, đã được thấy rõ trong con đường chuyển hóa của C.acetobutylicum, đây là vi khuẩn điển hình chuyển hóa theo con đường acid butyric,với sản phẩm chính gồm acetate, butyrate, hydro, và carbonic

Một lượng nhỏ acetoin có thể được tạo ra, và dưới một số điều kiện có thể tạo

ra lactate, tất cả sản phẩm được tạo ra trong pha tăng trưởng hàm mũ Tại pha ổnđịnh, sự hình thành của các acid giảm xuống, khi đó acetone và butanol trở thànhcác sản phẩm chiếm ưu thế (hoặc 2-propanol thay vì acetone trong một số chủng C.beijerinckii) [31] C a ùc s a ûn p ha åm a c i d đ ư ơ ïc t o ån g h ơ ïp c u ûa qu a ù

không phân ly và vì vậy có thể được đưa ra khỏi tế bào chất thông qua con

đường khuếch tán qua màng, tuy nhiên khi pH của môi trường giảm xuống từ 4,5đến 4,0 phía trong tế bào chúng sẽ bị phân ly thành dạng muối và proton Theo cáchnày, gradient nồng độ proton xuyên màng bị phá hủy và tế bào sẽ chết Sự biến mấtcủa gradient nồng độ proton xuyên màng sẽ ức chế hoạt động của ATPase, làmngừng các quá trình chuyển hóa nội bào quá trình sinh dung môi sẽ cho phép tếbào vi khuẩn giải quyết tình trạng nguy hiểm này, sự chuyển đổi acetate vàbutyrate thành acetone và butanol dẫn đến làm tăng pH [16] Tuy nhiên ở một chiềungược lại, dung môi được tạo ra lại gây độc cho chính bản thân tế bào vi khuẩn, hợpchất nguy hiểm nhất chính là butanol, chính nồng độ cao của butanol làm ngừngquá trình thu nhận và sử dụng đường của vi khuẩn [31] Vì vậy, quá trình sinh tổnghợp dung môi chỉ được sử dụng như một phản ứng khẩn cấp đưa tế bào vào trạngthái hoàn thành quá trình tạo nội bào tử và có thể tồn tại được trong một thời giandài [16], [18], [31]

Quá trình lên men được thực hiện theo phương pháp lên men mẻ và lên menliên tục, phương pháp lên men thứ hai dẫn đến việc tích lũy các chủng đột biếnkhông sinh bào tử, vì bào tử liên tục được đưa ra ngoài, nhưng không ảnh hưởng đếnquá trình sinh dung môi [47]

C acetobutylicum lên men sinh dung môi ABE ở 35–37oC, acetone–

butanol–ethanol thường được tạo ra với tỉ lệ 3: 6: 1 Trong suốt quá trình lên men, C.

acetobutylicum tạo ba sản phẩm chính là acid (acid acetic, acid lactic, acid butyric),

dung môi (acetone, butanol, ethanol) và khí (CO2, H2) Lúc đầu, Clostridium lênmen sinh acid với acetate, butyrate và khi pH môi trường giảm xuống khoảng 4,5 vikhuẩn mới bắt đầu sinh dung môi ABE [31]

Hầu hết tất cả các enzyme liên quan đến con đường tổng hợp dung môi

đều đã được thu nhận và phân tích Sự thay đổi phương thức biến dưỡng xảy ra saukhi hình thành acetoacetyl–CoA, sau đó acetoacetyl–CoA có thể được chuyển hóa

và tổng hợp thành các dung môi acetone, 2–propanol, ethanol và butanol theo cáccon đường khác nhau với sự tham gia của các enzyme tương ứng [25]

A

c eto a c ety l –CoA   a c etoa c etate   a c e t o n e

Acetoacetyl-CoA: acetate/butyrate-coenzyme A transferase (CoA transferasehoặc Ctf) xúc tác chuyển các sản phẩm là acid của pha trước tổng hợp thành các dẫnxuất acyl CoA và acetoacetate Acetoacetate sau đó sẽ bị tách thành acetone và CO2bởi enzyme acetoacetate decarboxylase (Adc) có pH tối ưu khoảng 5 Sự tạo thànhacetone qua acetoacetyl–CoA không tiêu thụ NADPH nên vi khuẩn chỉ có thể sảnsinh acetone ở một mức độ giới hạn và phản ứng có thể bị giảm khi nồng độ sắt bịhạn chế trong tế bào hoặc do hydrogenase bị CO ức chế [39]

A

c eto a c ety l –CoA   a c etoa c etate   a c e t o n e   2 – p r o p a n ol

Trong một vài chủng C beijerinckii, acetone tiếp tục bị khử thành 2–propanol (isopropanol) bởi hoạt tính của enzyme alcohol dehydrogenase (butanol–ethanol–isopropanol dehydrogenase) theo cách sau:

A

c eto a c ety l –CoA   A c id a c eti c l   a c eta l d e h y d e   et h a n ol

Acetyl-CoA và butyryl-CoA được chuyển thành ethanol và butanol bởi cácenzyme khác là aldehyde và alcohol dehydrogenase Ethanol được tạo ra từ Acetyl–CoA bằng cách chuyển nhóm CoA tạo thành acid acetic đồng thời nhận H2 và táchnhóm CoA tạo thành acetaldehyde, chất này sau đó nhận H2 tạo thành ethanol Gâyđột biến bằng transposon và thu nhận protein chỉ ra rằng sự hình thành ethanol (đượctổng hợp trong suốt quá trình lên men nhưng chỉ ở một lượng

nhỏ) được xúc tác bởi một enzyme chuyên biệt là acetaldehyde dehydrogenase,enzyme này không phản ứng với butyryl–CoA và một enzyme khác là NADPH-dependent alcohol dehydrogenase Một enzyme alcohol dehydrogenase khác(thường được gọi là butanol dehydrogenase A hay Bdh I) có thể liên qua đến quátrình tổng hợp ethanol (nó là một con đường cạnh tranh khi quá trình sinh tổng hợpbutanol yếu) BdhA chứa hai tiểu phần đồng nhất, mỗi tiểu phần có trọng lượng phân

tử là 42kDa, và hoạt tính phản ứng với acetaldehyde chỉ bằng một nữa khi phản ứngvới butyraldehyde [39]

A

c eto a c ety l –CoA   bu ty r y l – CoA   b u t a n al   b u ta n ol

Đầu tiên Acetoacetyl–CoA chuyển hoá thành ?–hydroxybutyryl CoA sau đóchuyển thành crotonyl–CoA Crotonyl–CoA chuyển thành butyryl–CoA nhờbutyryl–CoA dehydrogenase Butyryl–CoA chuyển nhóm CoA tạo thành butyricnhờ enzyme butyric transferase Mặt khác, butyryl–CoA vừa nhận H2 và đồng thờitách nhóm CoA tạo thành butyraldehyde, chất này sau đó nhận H2 tạo thành butanol

Sự tổng hợp butanol ở C acetobutylicum diễn ra nhờ phản ứng của enzymebutyraldehyde/butanol dehydrogenase E (AdhE) [39]

2.2.4 Sự thoái biến khả năng sinh dung môi

Sự thoái biến là quá trình làm biến mất khả năng tổng hợp dung môi của

Clostridium, hiện tượng này xảy ra cả trong nuôi cấy mẻ lẫn nuôi cấy liên tục.

Những nghiên cứu sớm nhất đề nghị rằng đã xảy ra đột biến làm tăng các enzymeliên quan đến con đường tổng hợp acetate và butyrate, nhưng làm mất các enzymeliên quan đến con đường tổng hợp dung môi Sau đó các nhà nghiên cứu đã đưa rakhả năng thuyết phục hơn là do thiếu các nhân tố điều hòa kết quả của điều này dẫnđến vi sinh vật bị mất các nhân tố điều hòa đầu nguồn của quá trình tổng hợp dungmôi khi lên men [18] Kashket và Cao (1993) phân lập được chủng đột biến chống

lại sự thoái biến C beijerinckii NCIMB 8052 nhờ vào

phương pháp gây đột biến bằng transposon Trong một nghiên cứu khác, một

chủng C acetobutylicum ATCC 824 bị thoái biến được kiểm tra, kết quả cho thấy bịmất một vùng vật liệu di truyền liên quan đến các gene mã hóa cho các enzyme tổnghợp dung môi [32]

Cornillot và cs, 1997 sau đó đã chứng minh rằng các gene liên quan đến quátrình tổng hợp n–butanol và acetone ở C acetobutylicum ATCC 824 nằm trên mộtplasmid lớn (pSOL1) và chính sự mất đi của nó dẫn đến sự thoái biến của chủng vikhuẩn Một trong những phương pháp được sử dụng để ngăn chặn sự thoái biếnthành công nhất đó là việc sử dụng CaCO3 làm một chất đệm [12] Hartmanis và cs,

1986 đã thu được trên 200 chủng C acetobutylicum ATCC 824 và DSM 792 bằngcách nuôi trong một môi trường phức tạp có chứa thêm 3 g/L CaCO3 [39]

2.2.5 Mối liên hệ giữa quá trình sinh dung môi và sự sinh trưởng phát triển của

Clostridium

Quá trình sinh dung môi đóng vai trò quan trọng với một số loài Clostridium

sp bởi nó giúp cho chúng có thời gian chống lại với những điều kiện bất lợi của môi

trường, khi đó chúng sẽ khởi đầu và hoàn thành quá trình tạo nội bào tử Các thànhphần quan trọng trong quá trình tổng hợp acetone và butanol là các enzyme được mã

hóa bởi hai operon adc, sol của C acetobutylicum và C beijerinckii [29], [30].

Con đường biến dưỡng đầu tiên của chủng Clostridium sp để sản xuất dungmôi là sự kết hợp chặt chẽ với quá trình hình thành nội bào tử [17] Sự hình thànhacid (lactate, acetate, butyrate) trong suốt quá trình tăng trưởng ở giai đoạn đầunhằm acid hóa môi trường Sự hình thành nội bào tử bắt đầu hình thành cùng lúc vớiquá trình tạo dung môi, để vi khuẩn bảo đảm sống sót trong một thời gian dài.Enzyme đòi hỏi cho quá trình tạo dung môi là coenzyme A transferase,