Nguyên tắc: thử nghiệm catalase dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí với vi sinh vật kỵ khí. Enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật hiếu khí, thơng thường những vi sinh vật khơng cĩ hệ thống cytochrom thì cũng khơng cĩ enzym catalase, vì thế chúng khơng cĩ khả năng phân huỷ hydropeoxide. Catalase xúc tác phản ứng phân hủy hợp chất hydroperoxide, trong phản ứng này một phân tử hydroperoxide đĩng vai trị là một chất cho điện tử và một phân tử hydroperoxide khác đĩng vai trị là một chất nhận điện tử. Cơ chất bị khử bởi nhạân hydrogen cung cấp từ phân tử cho điện tử, quá trình diễn ra giải phĩng oxy
phân tử.
2H2O2 2H2O + O2
Cách tiến hành: dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiến kính sạch, nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính.ghi nhận hiện tượng, Bacillus subtillis được sử dụng làm mẫu đối chứng cho phản ứng Catalase dương tính, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Kết quả:
Catalase dương tính (+) cĩ hiện tượng sủi bọt khí do O2 tạo ra. Catalase dương tính (-) khơng cĩ sủi bọt khí.
3.3.2.4. Nhuộm gram
Nguyên tắc: nhuộm gram hay cịn gọi là phản ứng gram cĩ vai trị quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn. Crystal violet là thuốc nhuộm cơ bản, dựa vào khả năng bắt màu với thuốc nhuộm tím kết tinh (crystal violet) và lugol, tất cả vi khuẩn chia thành 2 nhĩm lớn: vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm Cách tiến hành: ? Dùng que cấy vơ trùng lấy một khuẩn lạc vi khuẩn từ thạch hịa vào 1 giọt nước
cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí. Cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bơi trên ngọn lửa đèn cồn.
? Nhuộm bằng dung dịch tím tinh thể (crystal violet) trong 20 giây, rửa nước 2 giây, thấm khơ.
? Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol (dung dịch cồn Iod 1%) trong 1 phút. Rửa mẫu bằng dung dịch tẩy màu cồn 960, giữ khoảng 10 - 20 giây (để nghiêng tiêu bản, nhỏ từng giọt cồn cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước 2 giây, thấm khơ. ? Nhuộm bằng dung dịch đỏ tía Fuchsin ziehl, 20 giây, rửa nước 2 giây, thấm khơ
nước và để ráo trong khơng khí.
? Quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi, dùng vật kính 100X nhúng dầu.
tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod, kết quả sẽ bắt màu tím. Nhĩm vi
khuẩn Gram âm bị dung mơi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod, do đĩ sẽ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung, kết quả bắt màu đỏ hồng.
3.3.2.5. Nhuộm bào tử
Nguyên tắc: các lồi vi khuẩn thuộc nhĩm Clostridium cĩ khả năng tạo ra cấu trúc gọi là nội bào tử rất bền nhiệt, chúng giúp vi khuẩn kháng lại nhiều hĩa chất vì thế chúng rất dày và dai. Bào tử rất khĩ nhuộm do màng bào tử dày, khĩ bắt màu và chứa nhiều lipid do đĩ phải xử lý bằng nhiệt độ để làm tế bào chất dễ bắt màu. Sau đĩ nhuộm cả tế bào chất và bào tử với thuốc nhuộm cĩ hoạt tính mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi và nhuộm nĩ với thuốc nhuộm phân biệt khác.
Cách tiến hành:
? Dùng que cấy vơ trùng lấy một khuẩn lạc vi khuẩn từ thạch hồ vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí. Cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bơi trên ngọn lửa đèn cồn.
? Đặt lên chỗ vết bơi một mẫu giấy lọc, nhuộm lục malachite 5%, đặt phiến kính lên cốc chứa nước cất đang sơi trong 5 phút. Nếu thuốc nhuộm cạn phải bổ sung ngay. Sau đĩ để phiến kính nguội, bỏ miếng giấy lọc ở trên và rửa nhẹ với nước cất trong 30 giây.
? Nhuộm safranin 0,5% trong khoảng 20 giây, rửa nước để loại bỏ safranin, thấm khơ bằng giấy lọc
? Quan sát bào tử của vi khuẩn dưới kính hiển vi, dùng vật kính 100X nhúng dầu. Kết quả: bào tử màu xanh lục, tế bào sinh dưỡng bắt màu hồng.
3.3.2.6. Kiểm tra khả năng tổng hợp dung mơi
Thu nhận 100?l dịch vi khuẩn đã được làm thuần trải lên mơi trường agar T6, ủ ở nhiệt độ 370C trong 72 giờ trong điều kiện kỵ khí, các khuẩn lạc mọc lên
trên mơi trường agar T6 được kiểm tra khả năng tổng hợp acetone bằng cách nhỏ lên một giọt nhỏ sodium nitroprusiate 5% (w/v) và một giọt amonium hydroxide 2% (w/v), nếu cĩ sự hiện diện của acetone sẽ xuất hiện một vịng hồng bao quanh khuẩn lạc. Các khuẩn lạc dương tính với phản ứng nitroprusiate được ủ ở điều kiện kỵ khí tiếp thêm 96 giờ nữa ở nhiệt độ 370C và nhuộm bào tử để kiểm tra việc tạo bào tử, hình dạng và kích thước của bào tử [39].
Bước tiếp theo là chuyển các chủng thuần phân lập được sang mơi trường bảo quản giống. Sau khi phân lập được các chủng thuần vi khuẩn kỵ khí, ưa nhiệt trung, cĩ khả năng tạo bào tử, cĩ hình que giống Clostridium sẽ tiếp tục được kiểm tra để chọn được các chủng cĩ khả năng sinh tổng hợp butanol, các chủng sau khi kiểm tra cĩ khả năng sinh tổng hợp butanol sẽ được định danh dựa vào các đặc tính sinh hĩa và các đặc điểm sinh học phân tử.
3.3.3. Kiểm tra khả năng sinh butanol của các chủng Clostridium sp. phân lập được3.3.3.1. Phương pháp định tính acetone 3.3.3.1. Phương pháp định tính acetone
Nguyên tắc: vi sinh vật cĩ khả năng sử dụng glucose thực hiện quá trình lên men tổng hợp dung mơi, trong điều kiện lên men bình thường ở vi khuẩn Clostridium acetobutylicum tỷ lệ các dung mơi là 3 acetone : 6 butanol : 1 ethanol, ở các chủng Clostridium sp. khác tỉ lệ này cĩ thể khác nhau, thơng qua việc định tính sự tạo thành acetone ta cĩ thể gián tiếp xác định được các chủng vi khuẩn Clostridium sp. cĩ khả năng tổng hợp butanol. Khi acetone gặp thuốc thử sodium nitroprusiate và ammonium hydroxide thì sẽ tạo màu hồng so với ống đối chứng âm cĩ màu vàng.
Cách tiến hành: dịch lên men đem ly tâm để loại bỏ sinh khối. Hút 1ml
dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm, sau đĩ bổ sung 0,5ml sodium nitroprusiate 5% (w/v) và 0,5ml ammonium hydroxide 2% (w/v). Lắc đều, để yên trong 2 phút,
quan sát sự đổi màu của dung dịch. Tiến hành làm ống đối chứng song song với mẫu, thay thế dịch lên men bằng nước cất đối với mẫu đối chứng âm tính, sau đĩ bổ sung 0,5ml sodium nitroprusiate 5%(w/v) và 0,5ml ammonium hydroxide
2%(w/v). Lắc đều, để yên trong 2 phút, quan sát sự khác nhau giữa màu của ống đối chứng và các ống nghiệm cĩ chứa dịch lên men, thí nghiệm được lặp lại 3 lần
[39].
Kết quả: ống nghiệm nào cĩ màu hồng đậm hơn so với ống đối chứng âm tính thì kết quả là cĩ tạo thành acetone trong mơi trường.
3.3.3.2. Ki?m tra kh? n?ng t?o c?c ?ơng trong mơi tr??ng s?a
Nguyên tắc: quá trình tổng hợp nên các dung mơi của Clostridium trong đĩ cĩ butanol gồm hai pha: pha sinh tổng hợp các acid hữu cơ và pha chuyển các acid hữu cơ này thành dung mơi, do vi khuẩn Clostridium tăng trưởng trong pha sớm sẽ tổng hợp nên các acid acetic, acid butyric…sẽ làm giảm pH của mơi trường dẫn đến làm ngưng kết casein. Những chủng vi khuẩn Clostridium sp. cĩ khả năng tổng hợp nhiều các acid hữu cơ acid acetic, acid butyric…sẽ nhanh chĩng làm cho mơi trường sữa tươi hình thành các cục đơng, tùy vào trạng thái đơng của mơi trường sữa mà ta cĩ thể xác định được những chủng vi khuẩn cĩ tiềm năng sinh tổng hợp được butanol hàm lượng cao [39].
Cách tiến hành: hút 1ml vi khuẩn Clostridium sp. đã nuơi cấy qua đêm cho vào 9ml mơi trường sữa và ủ 37oC. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, quan sát và ghi nhận hiện tượng đơng tụ sữa sau 24 giờ và 48 giờ.
3.3.3.3. Kiểm tra các đặc tính sinh lý sinh hĩa khác a. Thử nghiệm sinh H2S a. Thử nghiệm sinh H2S
Nguyên tắc: một số vi khuẩn cĩ enzyme desulfohydrase xúc tác sự chuyển hĩa trong điều kiện kỵ khí các acid amin chứa lưu huỳnh như cysteine,
methionine và giải phĩng H2S. Khí H2S sinh ra kết hợp với chỉ thị sắt (II) trong mơi trường nuơi cấy tạo tủa màu đen.
Fe2+ + S2- ? FeS đen.
Cách tiến hành: cấy vào đĩa vơ trùng 1ml dịch mẫu đã được pha lỗng thích hợp vào 1 đĩa petri vơ trùng. Đổ 10ml mơi trường TSI đã được ủ ấm 450C vào đĩa, lắc đều. Sau khi mơi trường đã đơng, đổ thêm lên bề mặt khoảng 5ml TSI. Đĩa đã cấy mẫu được ủ 370C, 2 ngày trong các bình kỵ khí.
Kết quả:
Sinh H2S dương tính (+) thì khuẩn lạc cĩ màu đen
Sinh H2S âm tính (-) thì khuẩn lạc khơng chuyển sang màu đen. b. Kiểm tra khả năng mẫn cảm với rifampicin
Nguyên tắc: khả năng mẫm cảm hay kháng rifampicin là một trong những chỉ tiêu quan trọng được sử dụng để phân loại các chủng Clostridium sp. sinh dung mơi, kháng sinh khuếch tán vào mơi trường thạch chứa vi sinh vật kiểm định sẽ tạo ra các vịng ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định. Dựa vào vịng ức chế, ta xác định được chủng vi sinh vật kiểm định là mẫn cảm hay kháng lại rifampicin.
Cách tiến hành: chủng vi khuẩn được hoạt hĩa từ dạng bào tử trong 3ml RCM và ủ ở 370C trong 12 giờ (mật độ tối ưu được xác định bằng đo mật độ quang OD ở bước sĩng 600nm, giá trị từ 0,3 - 0,4), đĩa agar phải đảm bảo bề mặt đủ khơ trước khi đĩa rifampicin được đặt lên bề mặt agar. Tiến hành trải mẫu lên các đĩa RCM agar, đặt đĩa giấy lọc chứa 10 và 100ng rifampicin đã được sấy khơ lên bề mặt agar, ủ 340C trong 24 giờ. Tính mẫn cảm với rifampicin được xác định bởi vịng kháng khuẩn xung quanh đĩa [33].
Nếu cĩ vịng kháng khuẩn ở đĩa giấy chứa nồng độ kháng sinh là 10ng rifampicin thì chủng vi khuẩn mẫm cảm với rifampicin (RifS).
Nếu khơng cĩ vịng kháng khuẩn ở đĩa giấy chứa nồng độ kháng sinh là 100ng rifampicin thì chủng vi khuẩn cĩ khả năng kháng rifampicin (RifR. c. Thử nghiệm Indol
Nguyên tắc:
Tryptophan là một acid amin cĩ thể bị oxy hố bởi một số vi sinh vật cĩ hệ enzyme tryptophanase tạo indol (skatol), sản phẩm trung gian là indolpyruvic acid. Việc phát hiện Indol được thực hiện bằng thuốc thử p– Dimethylaminobenzaldehyde. Nhân pyrol của indol kết hợp với nhân benzen của p – DMABA tạo phức dạng quinone cĩ màu đỏ.
Cách tiến hành: chọn khuẩn lạc cĩ đường kính lớn hơn 1mm cấy chuyền vào canh trypton, ủ 400C trong 24 giờ. Nhỏ 1ml eter vào ống nghiệm để chiết Indol. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào để yên vài phút. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Kết quả:
Indol dương tính (+): cĩ sự xuất hiện màu đỏ trên bề mặt mơi trường. Indol âm tính (-): cĩ lớp màu vàng của thuốc thử trên bề mặt mơi trường.
Đơi khi cĩ sự xuất hiện màu cam do Skatol là tiền chất methyl hĩa Indol tạo ra.
d. Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate khác nhau
Nguyên tắc: thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng một nguồn carbon nhất định để tăng trưởng. Vi khuẩn cĩ khả năng sử dụng các
nguồn carbon khác nhau để tăng trưởng, các nguồn carbon cĩ thể được chia thành 3 nhĩm là đường đơn (monosaccharide), đường đa (oligo hay polysaccharide) và đường rượu. Khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau để lên men, tùy phương thức biến dưỡng, các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau gồm rượu, acid hữu cơ... trong tất cả các trường hợp, sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH mơi trường. Do đĩ khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate dựa vào sự giảm pH mơi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị phenol red trong mơi trường và sự sinh khí trong mơi trường lỏng được bẫy trong ống durham.
Cách tiến hành: mơi trường sử dụng là Phenol Red Broth Base cĩ pH 7,4, chỉ thị pH thường dùng là phenol red, màu đỏ sẽ chuyển sang vàng khi pH dưới
6,8.
Cấy và ủ 37oC trong 18 – 20 giờ. Tiến hành thí nghiệm với mẫu chứng âm là mơi trường đường khơng cấy vi sinh vật.
Đọc kết quả:
Khả năng sử dụng nguồn carbohydrate của chủng nghiên cứu được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi.
Sinh acid dương tính (+): khi mơi trường với chỉ thị phenol red chuyển thành màu vàng. Ngược lại, nếu mơi trường màu đỏ thì sinh acid là âm tính (-).
Sinh hơi dương tính (+): khi cĩ bọt khí trong ống durham, khơng cĩ bọt khí thì sinh hơi là âm tính (-).
3.3.3.4. Xác định nồng độ butanol tổng hợp bằng sắc ký lỏng cao năng HPLC
Các chủng vi khuẩn Clostridium sp. cĩ khả năng sinh dung mơi được xác định thơng qua thí nghiệm 3.3.3.1 và 3.3.3.2 được cấy vào mơi trường T6: các chủng vi khuẩn Clostridium sp. tăng sinh cấp 1 trong mơi trường RCM 48 giờ/370C, ghi nhận sự sinh hơi và làm đục mơi trường, giống sau tăng sinh cấp 1 sẽ được chuyển sang mơi trường tăng sinh cấp 2 trong ống nghiệm cĩ thể tích
30ml trong 24 giờ/370C, sau đĩ giống được chuyển vào trong mơi trường lên men (dịch thủy phân) với thể tích 80ml trong chai duram loại 100ml (với nồng và ủ ở nhiệt độ 380C trong 168 giờ (7 ngày) và sản phẩm của quá trình lên men được thu nhận và phân tích bằng máy sắc ký HPLC SHIMADZA để xác định lượng butanol sinh tổng hợp được.
Glucose, saccharose, butanol, được đo nồng độ bằng máy sắc ký lỏng SHIMADZA sử dụng pha động là nước cất.
Nguyên tắc: dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử khác nhau trên cột, khi dung mơi rửa giải đi qua, các cấu tử sẽ lần lượt được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự tùy thuộc vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau (thuộc cùng một chất) sẽ cĩ thời gian lưu như nhau, nhờ vào đĩ máy HPLC cĩ thể tách hỗn hợp nhiều chất ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC cĩ khả năng phân tách các chất cao.
Tiến hành: chuẩn bị các dung dịch chuẩn butanol, glucose, saccharose và các chất khác để khảo sát quan hệ chất–thời gian lưu, nồng độ–diện tích peak.
Chuẩn bị pha động: sử dụng nước cất tinh khiết là pha động, thể tích
1000ml, lọc nước cất bằng màng lọc cellulose acetate, kích thước lỗ là 0,45?m sau đĩ cho 1000ml nước cất đã được lọc vào bình chứa, tiến hành loại khí trong pha động, bằng cách sử dụng máy siêu âm. Thực hiện quá trình này trong 20–30 phút đến khi khơng cịn thấy bọt khí trong bình.
Bơm cao áp LC–20AB (hệ thống cung cấp dung mơi): bơm pha động vào cột tách và điều khiển tốc độ dịng, áp suất của pha động
Mẫu và chuẩn được chạy ở chế độ: cột sử dụng phân tích là RNM- carbohydrate Na+ (300 × 7,80mm, 8?m), đầu dị RID–10A, nhiệt độ cột 500C, tốc độ pha động 0,6ml/ phút. Sắc ký đồ phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột tốt hay khơng tốt, được xử lý và in bằng máy in C–R8A. Nếu phân tách tốt thì hỗn
hợp cĩ bao nhiêu chất sẽ cĩ bấy nhiêu peak riêng biệt khơng chập nhau, chất nào bị lưu giữ mạnh sẽ được rửa giải ra sau cùng, chất lưu giữ kém sẽ ra trước. Thời gian lưu các chất: các chất chuẩn được pha chính xác theo nồng độ định trước, đo bằng máy HPLC để xác định thời gian lưu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Thời gian lưu các chất
STT Chuẩn Thời gian lưu
1 Glucose 12,825
2 Butanol 27,733
a. Chuẩn glucose: các dung dịch chuẩn glucose được pha theo nồng độ định trước, đo bằng máy HPLC. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả đo chuẩn glucose
STT Ký hiệu Nồng độ (g/ml) CG Diện tích peak SG 0 1 2 3 4 5 G0 G1 G2 G3 G4 G5 0 0,000078 0,0001 0,00016 0,00021 0,00031 0 68353 90777 111643 153008 205450
Từ bảng số liệu trên, vẽ được đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ glucose – diện tích peak.
Hình 3.2: Đường chuẩn HPLC cho glucose