Các chủng vi khuẩn Clostridium sp. cĩ khả năng sinh dung mơi được xác định thơng qua thí nghiệm 3.3.3.1 và 3.3.3.2 được cấy vào mơi trường T6: các chủng vi khuẩn Clostridium sp. tăng sinh cấp 1 trong mơi trường RCM 48 giờ/370C, ghi nhận sự sinh hơi và làm đục mơi trường, giống sau tăng sinh cấp 1 sẽ được chuyển sang mơi trường tăng sinh cấp 2 trong ống nghiệm cĩ thể tích
30ml trong 24 giờ/370C, sau đĩ giống được chuyển vào trong mơi trường lên men (dịch thủy phân) với thể tích 80ml trong chai duram loại 100ml (với nồng và ủ ở nhiệt độ 380C trong 168 giờ (7 ngày) và sản phẩm của quá trình lên men được thu nhận và phân tích bằng máy sắc ký HPLC SHIMADZA để xác định lượng butanol sinh tổng hợp được.
Glucose, saccharose, butanol, được đo nồng độ bằng máy sắc ký lỏng SHIMADZA sử dụng pha động là nước cất.
Nguyên tắc: dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử khác nhau trên cột, khi dung mơi rửa giải đi qua, các cấu tử sẽ lần lượt được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự tùy thuộc vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau (thuộc cùng một chất) sẽ cĩ thời gian lưu như nhau, nhờ vào đĩ máy HPLC cĩ thể tách hỗn hợp nhiều chất ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC cĩ khả năng phân tách các chất cao.
Tiến hành: chuẩn bị các dung dịch chuẩn butanol, glucose, saccharose và các chất khác để khảo sát quan hệ chất–thời gian lưu, nồng độ–diện tích peak.
Chuẩn bị pha động: sử dụng nước cất tinh khiết là pha động, thể tích
1000ml, lọc nước cất bằng màng lọc cellulose acetate, kích thước lỗ là 0,45?m sau đĩ cho 1000ml nước cất đã được lọc vào bình chứa, tiến hành loại khí trong pha động, bằng cách sử dụng máy siêu âm. Thực hiện quá trình này trong 20–30 phút đến khi khơng cịn thấy bọt khí trong bình.
Bơm cao áp LC–20AB (hệ thống cung cấp dung mơi): bơm pha động vào cột tách và điều khiển tốc độ dịng, áp suất của pha động
Mẫu và chuẩn được chạy ở chế độ: cột sử dụng phân tích là RNM- carbohydrate Na+ (300 × 7,80mm, 8?m), đầu dị RID–10A, nhiệt độ cột 500C, tốc độ pha động 0,6ml/ phút. Sắc ký đồ phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột tốt hay khơng tốt, được xử lý và in bằng máy in C–R8A. Nếu phân tách tốt thì hỗn
hợp cĩ bao nhiêu chất sẽ cĩ bấy nhiêu peak riêng biệt khơng chập nhau, chất nào bị lưu giữ mạnh sẽ được rửa giải ra sau cùng, chất lưu giữ kém sẽ ra trước. Thời gian lưu các chất: các chất chuẩn được pha chính xác theo nồng độ định trước, đo bằng máy HPLC để xác định thời gian lưu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Thời gian lưu các chất
STT Chuẩn Thời gian lưu
1 Glucose 12,825
2 Butanol 27,733
a. Chuẩn glucose: các dung dịch chuẩn glucose được pha theo nồng độ định trước, đo bằng máy HPLC. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả đo chuẩn glucose
STT Ký hiệu Nồng độ (g/ml) CG Diện tích peak SG 0 1 2 3 4 5 G0 G1 G2 G3 G4 G5 0 0,000078 0,0001 0,00016 0,00021 0,00031 0 68353 90777 111643 153008 205450
Từ bảng số liệu trên, vẽ được đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ glucose – diện tích peak.
Hình 3.2: Đường chuẩn HPLC cho glucose Từ đồ thị trên cĩ thể nội suy ra phương trình sau:
SG = 6.108×CG + 12678
CGlucose SGlu cos e 12678
6
108
(3.1)
Phương trình (3.1) cho phép tính nồng độ glucose khi biết diện tích peak. b. Chuẩn butanol: các dung dịch chuẩn butanol được pha theo nồng độ định trước, đo bằng máy HPLC. Kết quả được trình bày trong bảng 3.3:
Bảng 3.3: Kết quả đo chuẩn butanol
STT Ký hiệu Nồng độ CB,g/ml Diện tích SB 0 1 2 3 4 5 B0 B1 B2 B3 B4 B5 0 0,00054 0,00072 0,00109 0,00145 0,00217 0 183561 255091 320980 427687 647483
Từ bảng số liệu trên, vẽ được đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ butanol – diện tích peak.
Hình 3.3: Đường chuẩn HPLC cho butanol Từ đồ thị trên cĩ thể nội suy ra phương trình sau:
CBu tan ol SBu tan ol
16858 3
108
(3.2)
Phương trình (3.2) cho phép tính nồng độ butanol khi biết diện tích peak. 3.3.4. Bảo quản chủng phân lập bằng phương pháp đơng khơ.
Nguyên tắc: cơng tác giữ giống vi sinh vật là thực hiện các kỹ thuật cần thiết để đưa giống vi sinh vật bảo quản về trạng thái nghỉ và khi được hoạt hĩa trở lại cĩ tỷ lệ sống sĩt cao, các đặc tính di truyền khơng bị biến đổi và khơng bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch sữa gầy
Dung dịch A: Skim milk: 10g
Nước cất: 95ml
Hấp khử trùng ở 1100C/10 phút, để trong 24 giờ kiểm tra xem cĩ ngoại nhiễm hay khơng, nếu khơng nhiễm thì hấp khử trùng tiếp ở 1100C/10 phút lần 2, để nguội.
Dung dịch B: Monosodiumglutamate: 1g
Nước cất : 5ml
Hấp khử trùng ở 1210C/15 phút.
Trước khi sử dụng trộn dung dịch A với dung dịch B và lắc đều ta được dung dịch C.
Chuẩn bị ống đơng khơ: ống đơng khơ ngâm trong dung dịch HCl 2% qua đêm, sau đĩ rửa lại bằng nước, đem sấy khử trùng ở 1500C/30 phút.
Chuẩn bị các dụng cụ cho quá trình đơng khơ: các ống đơng khơ trong máy đơng phải đem rửa sạch và lau cồn.
Chuẩn bị giống vi sinh vật: giống vi sinh vật được nuơi trong mơi trường tăng sinh thích hợp.
Cách tiến hành đơng khơ: hút 1ml dịch nuơi cấy vi khuẩn vào eppendorf sau đĩ ly tâm thu nhận phần cặn ở dưới, bỏ phần dịch nổi, thêm vào 1ml dung dịch C, trộn đều, hút tồn bộ cho vào ống đơng khơ, để qua đêm trong ngăn đá cho đơng cứng lại (nếu khơng đơng cứng lại khi đơng khơ dịch sẽ bị hút lên). Phải bỏ ống đơng khơ nhỏ vào những ống đơng khơ của máy và bọc đầu lại bằng giấy bạc vơ trùng, sau đĩ mới bỏ vào ngăn đá, khi lắp các ống đơng khơ vào máy phải nhanh, chạy máy đơng khơ khoảng từ 8-10 giờ. Sau khi đơng khơ, lấy các ống đơng khơ ra và đậy liền bằng giấy bạc vơ trùng, sau đĩ đem đi đắp nắp của ống đơng khơ nhỏ (nút các ống đơng khơ phải đi gĩi giấy và hấp khử trùng).
Bảo quản trong tủ lạnh - 200C. Thời gian bảo quản là 1 đến nhiều năm, cĩ thể lên đến 10 năm mà hoạt tính vẫn khơng thay đổi.
3.3.5. Định danh các chủng Clostridium sp. sử dụng trình tự 16S rDNA
Nguyên tắc: tất cả vi khuẩn đều cĩ vùng gene 16S rDNA với kích thước khoảng 1,500bp, đây là một vùng gene chứa các vùng cĩ trình tự bảo tồn giống nhau ở các lồi vi khuẩn vì vậy khi dùng cặp mồi universal để khuếch đại kết quả sẽ thu được một băng cĩ kích thước tương tự nhau ở tất cả các lồi vi khuẩn. Tuy nhiên xen kẽ vào đĩ là những vùng biến động chuyên biệt cho các lồi vi khuẩn khác nhau do đĩ chỉ cần phân tích các vùng này cĩ thể định danh được lồi vi khuẩn. Ưu điểm chính của dữ liệu trình tự 16S rDNA là làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh lồi, minh họa khơng thể tốt hơn về sự tiến hĩa xảy ra trong phân loại học giống Clostridium [1], [3].
3.3.5.1. Thu nhận DNA bộ gene cho PCR 16S rDNA
Nguyên tắc: DNAzol Direct là loại kit sinh phẩm sử dụng để xử lý các mẫu sinh học thu nhạân DNA để thực hiện phản ứng PCR. DNAzol Direct xử lý một mẫu vi khuẩn Gram dương trong DNAzol Direct trong 15 phút ở nhiệt độ 80-900C, sau đĩ lấy một thể tích dịch sau xử lý thêm vào trực tiếp vào PCR mix và thực
hiện trực tiếp việc khuếch đại.
Quá trình này dựa vào việc DNAzol Direct sử dụng một dung dịch kiềm cĩ chứa polyethyleneglycol và các chất khác, DNAzol Direct nhanh chĩng ly giải một cách cĩ hiệu quả các mẫu sinh học. Sự kết hợp cĩ hiệu quả giữa dung dịch pH kiềm và các thành phần của DNAzol Direct bất hoạt các chất ức chế phản ứng PCR bao gồm protease và các enzyme thủy phân acid nucleic. Sau quá trình xử lý mẫu trong DNAzol Direct, DNA được biến tính thành mạch đơn, RNA bị thủy phân, protein bị biến tính và bị thủy phân. Hơn nữa, khơng cần phải trung hịa dịch dung giải trước khi sử dụng cho phản ứng PCR [58].
T i e án h a øn h: chọn m ột khuẩn lạc đơn và cấy vào 5ml mơi trường RCM (HiMEDIA) và ủ trong 48 giờ ở 370C. Thu nhận 1ml dịch nuơi cấy ly tâm ở 4000 vịng/ phút/5 phút để thu nhận tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn bị lắng xuống được tái huyền phù với 1ml nước cất, sau đĩ tiếp ly tâm ở 4000 vịng/ phút/5 phút để tái thu nhận viên tủa vi khuẩn, 20?l nước cất được thêm vào, và vortex để thu nhận một dung dịch đồng nhất. 10?l dịch đồng nhất được lấy ra và trộn với 100 ?l dung dịch DNAzol Direct, dịch huyền phù vi khuẩn được ủ trong DNAzol Direct với thời gian 15 phút ở nhiệt độ 80-900C, dịch sau thời gian xử lý đem vortex và chuy?n 5?l trực tiếp vào hỗn hợp PCR.
3.3.5.2. Khuếch đại PCR trình tự 16S rDNA
Nguyên tắc: phản ứng PCR (polymerase chain reaction) là phản ứng khuếch đại DNA mạch khuơn cĩ chứa một trình tự mục tiêu với một mồi (primer) và enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Taq DNA polymerase là enzyme bền nhiệt hoạt động tối ưu ở nhiệt độ từ 75-800C được thu nhận từ vi khuẩn Gram âm ưa nhiệt Thermus aquaticus xúc tác phản ứng bằng cách kéo dài một mồi oligonucleotide và 4 loại deoxynucleoside triphosphate (dNTP) để tạo ra hàng triệu bản sao [20].
Tiến hành:
a. Sử dụng mồi chuyên biệt cho vi khuẩn để khuếch đại vùng gene 16S rDNA (Lane, 1991).
Thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 16S rDNA chuyên biệt cho vi khuẩn là mồi Eubac 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’; vị trí 8-27 [vị trí theo hệ thống E. coli]) và mồi 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’; vị trí 1492-1511 [vị trí theo hệ thống E. coli]) như bảng 3.4. Sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước khoảng 1,5kb [27].
Sử dụng cơng c? primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.html) để kiểm tra sản phẩm khuếch đại và các thơng số của mồi.
Bảng 3.4: Oligodeoxynucleotide primer được sử dụng cho phản ứng PCR [27]
Mồi Trình tự (5’-> 3’) Vị trí Chuyên biệt
27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 8-27 Eubacterial
1492R GGTTACCTTGTTACGACTT 1492-1511 Universal
Quy trình PCR được thực hiện với máy luân nhiệt Sprint thermal cycler. Ống PCR được ủ 3 phút ở 940C, sau đĩ là 35 chu kỳ biến tính ở 940C trong 1 phút, bắt cặp ở 550C trong 1 phút, và kéo dài ở 720C trong 2 phút. Ống nghiệm sau đĩ được ủ ở 720C trong 10 phút, bảo quản sản phẩm khuếch đại ở 40C. Sản phẩm PCR sau đĩ được kiểm tra bằng chạy điện di trên gel agarose 1,0% với thang chuẩn DNA 1kb Ladder (0,5–10kb) của Sigma-Aldrich, Inc.
Hình 3.4: Sơ đồ vùng gene 16S rDNA của Clostridium. Hộp đỏ là vùng rất biến động giữa các lồi vi khuẩn. Cặp mồi sử dụng để khuếch đại là Eubac 27F và 1492R [27].
Bảng 3.5: Thành phần cho 1 phản ứng PCR với cặp mồi Eubac 27F và 1492R [46]
Thành phần Nồng độ Thể tích sử dụng (?l) Nồng độ cuối
Buffer 10X 5,0 1X
MgCl2 25 mM 5,0 2,5 mM
Mồi 27F 50 µM 1,0 1 M
Mồi 1492R 50 µM 1,0 1 M
Hỗn hợp dNTP 2,5mM mỗi loại 4,0 200 µM mỗi loại
Taq polymerase 1U/µl 1,25 0,025U/µl
DNA mạch khuơn 5,0
H2O 27,75
Tổng thể tích 50
Phản ứng PCR được chuẩn bị bằng cách pha PCR mix cho 10 phản ứng, 8 cho các chủng được lựa chọn, một m?u đối chứng cho phản ứng PCR dương tính với mạch khuơn là của C. saccharobutylicum và một m?u đối chứng cho phản ứng PCR âm tính bằng cách khơng cho DNA mạch khuơn. Trong quy trình này, tất cả các thành phần được trộn lại trước trong ống chạy PCR loại 0,5ml ngoại trừ DNA polymerase sẽ được bổ sung kế cuối và DNA mạch khuơn sẽ bổ sung cuối cùng.
Bảng 3.6: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R
Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
94 3 phút 1 94 1 phút 35 55 1 phút 72 2 phút 72 10 phút 1 4 Bảo quản
b. Sử dụng mồi chuyên biệt cho Clostridium khuếch đại vùng gene 16S rDNA [42].
Các vùng bảo tồn trong Clostridium được xác định và vị trí của các mồi
(theo báo cáo của Keis và cs, 1995; Rekha và cs, 2006) đã được định vị, theo đĩ vị trí của các mồi này tương ứng với vị trí tương đồng trên bộ gene của E. coli [33],[42].
Chúng tơi sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho Clostridium do Rekha và cs, 2006 thiết kế với mồi xuơi S-G-Clos-0586-S-21 (5’- CTCAACTTGGGTGCTGCATTT-3’; vị trí 586 tới 607 [vị trí theo hệ thống E. coli]) và mồi ngược S-G-Clos-1205-A-21 (5’- ATTGTAGTACGTGTGTAGCCC-
3’ vị trí 1205 tới 1226 [vị trí theo hệ thống E. coli]) vì sản phẩm khuếch đại chứa vùng rất biến động trên 16S rDNA. Đoạn sản phẩm khuếch đại cĩ chiều dài khoảng 600bp [42].
Sử dụng cơng c? primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.html) để kiểm tra sản phẩm khuếch đại và các thơng số của mồi.
Bảng 3.7: Oligodeoxynucleotide primer được sử dụng cho phản ứng PCR [42]
Primer Trình tự (5’-3’) Vị trí Chuyên biệt
SG-Clos-0586 CTCAACTTGGGTGCTGCATTT 586 - 607 Clostridium
SG-Clos-1205 ATTGTAGTACGTGTGTAGCCC 1205 - 1226 Clostridium
Phản ứng PCR được chuẩn bị bằng cách pha PCR mix cho 10 phản ứng, 8 cho các chủng được lựa chọn, một m?u đối chứng cho phản ứng PCR dương tính với mạch khuơn là của C. saccharobutylicum và một m?u đối chứng cho phản ứng PCR âm tính bằng cách khơng cho DNA mạch khuơn. Trong quy trình này, tất cả các thành phần được trộn lại trước trong ống chạy PCR loại 0,5ml ngoại trừ DNA polymerase sẽ được bổ sung kế cuối và DNA mạch khuơn sẽ được bổ sung cuối cùng.
PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt Sprint thermal cycler. Khởi đầu của quá trình khuếch đại mẫu được ủ ở 940C trong 3 phút; sau đĩ theo sau là 35 chu kỳ gồm biến tính ở 940C trong 30 giây, bắt cặp ở 530C trong 1 phút, và kéo dài tại 720C trong 1 phút và cuối cùng kéo dài ở 720C trong 10 phút, bảo quản sản phẩm khuếch đại ở 40C.
Bảng 3.8: Thành phần của 1 phản ứng PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205-A-21 [20] Thành phần Nồng độ Thể tích sử dụng (?l) Nồng độ cuối Buffer 10X 5,0 1X MgCl2 25 mM 5,0 2,5 mM Mồi S-G-Clos-0586 50 µM 1,0 1 M Mồi S-G-Clos-1205 50 µM 1,0 1 M
Hỗn hợp dNTP 2,5mM mỗi loại 4,0 200 µM mỗi loại
Taq polymerase 1U/µl 1,25 0,025U/µl
DNA mạch khuơn 5,0
H2O 27,75
Tổng thể tích 50
Sản phẩm PCR sau đĩ được kiểm tra bằng chạy đện di trên gel agarose 1,0% với thang chuẩn Benchtop PCR marker (50-1000bp) của Promega, Inc.
Bảng 3.9: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G- Clos-1205-A-21
Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
94 3 phút 1 94 30 giây 35 53 1 phút 72 1 phút 72 10 phút 1 4 Bảo quản
3.3.5.3. Kiểm tra sự khuếch đại
Hỗn hợp 5?l sản phẩm khuếch đại PCR kết hợp với 1?l gel loading dye, được nạp vào gel agarose 1% (1X TAE) cĩ bổ sung 2?l ethidium bromide (10?g/?l) và chạy 125V trong 45 phút trong đệm TAE 1X sau đĩ quan sát dưới máy UVTEC.
3.3.5.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng cách điện di trên agarose 1% được tinh sạch sản bằng IllustragFX PCR DNA and gel Band Purification Kit (GE Healthcare UK Limited), sản phẩm sau tinh sạch sẽ được điện di lại trên gel agarose 1% ?? ki?m tra và sau ?ĩ m?u s? ???c g?i ?i gi?i trình t? hai chi?u.
3.3.5.5. Giải trình tự và tạo cây phát sinh lồi
Máy giải trình tự tự động được sử dụng để giải trình tự đoạn sản pha åm PCR, sản phẩm PCR được giải trình tự hai chiều tại cơng ty Nam Khoa BIOTEK, các chuỗi trình tự ban đầu được sử dụng phầm mềm Chromaspro 1.34 để kiểm tra các peak và nối lại tạo trình tự hồn chỉnh của đoạn 16S rDNA của các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Sản phẩm sau khi giải trình tự sẽ được kiểm tra sử dụng để BLAST (blastn) trở lại nucleotide database trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Các chủng được xác định cùng lồi khi cĩ mức tương đồng di truyền 97% hoặc cao