Nguyên tắc: phản ứng PCR (polymerase chain reaction) là phản ứng khuếch đại DNA mạch khuơn cĩ chứa một trình tự mục tiêu với một mồi (primer) và enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Taq DNA polymerase là enzyme bền nhiệt hoạt động tối ưu ở nhiệt độ từ 75-800C được thu nhận từ vi khuẩn Gram âm ưa nhiệt Thermus aquaticus xúc tác phản ứng bằng cách kéo dài một mồi oligonucleotide và 4 loại deoxynucleoside triphosphate (dNTP) để tạo ra hàng triệu bản sao [20].
Tiến hành:
a. Sử dụng mồi chuyên biệt cho vi khuẩn để khuếch đại vùng gene 16S rDNA (Lane, 1991).
Thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 16S rDNA chuyên biệt cho vi khuẩn là mồi Eubac 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’; vị trí 8-27 [vị trí theo hệ thống E. coli]) và mồi 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’; vị trí 1492-1511 [vị trí theo hệ thống E. coli]) như bảng 3.4. Sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước khoảng 1,5kb [27].
Sử dụng cơng c? primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.html) để kiểm tra sản phẩm khuếch đại và các thơng số của mồi.
Bảng 3.4: Oligodeoxynucleotide primer được sử dụng cho phản ứng PCR [27]
Mồi Trình tự (5’-> 3’) Vị trí Chuyên biệt
27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 8-27 Eubacterial
1492R GGTTACCTTGTTACGACTT 1492-1511 Universal
Quy trình PCR được thực hiện với máy luân nhiệt Sprint thermal cycler. Ống PCR được ủ 3 phút ở 940C, sau đĩ là 35 chu kỳ biến tính ở 940C trong 1 phút, bắt cặp ở 550C trong 1 phút, và kéo dài ở 720C trong 2 phút. Ống nghiệm sau đĩ được ủ ở 720C trong 10 phút, bảo quản sản phẩm khuếch đại ở 40C. Sản phẩm PCR sau đĩ được kiểm tra bằng chạy điện di trên gel agarose 1,0% với thang chuẩn DNA 1kb Ladder (0,5–10kb) của Sigma-Aldrich, Inc.
Hình 3.4: Sơ đồ vùng gene 16S rDNA của Clostridium. Hộp đỏ là vùng rất biến động giữa các lồi vi khuẩn. Cặp mồi sử dụng để khuếch đại là Eubac 27F và 1492R [27].
Bảng 3.5: Thành phần cho 1 phản ứng PCR với cặp mồi Eubac 27F và 1492R [46]
Thành phần Nồng độ Thể tích sử dụng (?l) Nồng độ cuối
Buffer 10X 5,0 1X
MgCl2 25 mM 5,0 2,5 mM
Mồi 27F 50 µM 1,0 1 M
Mồi 1492R 50 µM 1,0 1 M
Hỗn hợp dNTP 2,5mM mỗi loại 4,0 200 µM mỗi loại
Taq polymerase 1U/µl 1,25 0,025U/µl
DNA mạch khuơn 5,0
H2O 27,75
Tổng thể tích 50
Phản ứng PCR được chuẩn bị bằng cách pha PCR mix cho 10 phản ứng, 8 cho các chủng được lựa chọn, một m?u đối chứng cho phản ứng PCR dương tính với mạch khuơn là của C. saccharobutylicum và một m?u đối chứng cho phản ứng PCR âm tính bằng cách khơng cho DNA mạch khuơn. Trong quy trình này, tất cả các thành phần được trộn lại trước trong ống chạy PCR loại 0,5ml ngoại trừ DNA polymerase sẽ được bổ sung kế cuối và DNA mạch khuơn sẽ bổ sung cuối cùng.
Bảng 3.6: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R
Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
94 3 phút 1 94 1 phút 35 55 1 phút 72 2 phút 72 10 phút 1 4 Bảo quản
b. Sử dụng mồi chuyên biệt cho Clostridium khuếch đại vùng gene 16S rDNA [42].
Các vùng bảo tồn trong Clostridium được xác định và vị trí của các mồi
(theo báo cáo của Keis và cs, 1995; Rekha và cs, 2006) đã được định vị, theo đĩ vị trí của các mồi này tương ứng với vị trí tương đồng trên bộ gene của E. coli [33],[42].
Chúng tơi sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho Clostridium do Rekha và cs, 2006 thiết kế với mồi xuơi S-G-Clos-0586-S-21 (5’- CTCAACTTGGGTGCTGCATTT-3’; vị trí 586 tới 607 [vị trí theo hệ thống E. coli]) và mồi ngược S-G-Clos-1205-A-21 (5’- ATTGTAGTACGTGTGTAGCCC-
3’ vị trí 1205 tới 1226 [vị trí theo hệ thống E. coli]) vì sản phẩm khuếch đại chứa vùng rất biến động trên 16S rDNA. Đoạn sản phẩm khuếch đại cĩ chiều dài khoảng 600bp [42].
Sử dụng cơng c? primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.html) để kiểm tra sản phẩm khuếch đại và các thơng số của mồi.
Bảng 3.7: Oligodeoxynucleotide primer được sử dụng cho phản ứng PCR [42]
Primer Trình tự (5’-3’) Vị trí Chuyên biệt
SG-Clos-0586 CTCAACTTGGGTGCTGCATTT 586 - 607 Clostridium
SG-Clos-1205 ATTGTAGTACGTGTGTAGCCC 1205 - 1226 Clostridium
Phản ứng PCR được chuẩn bị bằng cách pha PCR mix cho 10 phản ứng, 8 cho các chủng được lựa chọn, một m?u đối chứng cho phản ứng PCR dương tính với mạch khuơn là của C. saccharobutylicum và một m?u đối chứng cho phản ứng PCR âm tính bằng cách khơng cho DNA mạch khuơn. Trong quy trình này, tất cả các thành phần được trộn lại trước trong ống chạy PCR loại 0,5ml ngoại trừ DNA polymerase sẽ được bổ sung kế cuối và DNA mạch khuơn sẽ được bổ sung cuối cùng.
PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt Sprint thermal cycler. Khởi đầu của quá trình khuếch đại mẫu được ủ ở 940C trong 3 phút; sau đĩ theo sau là 35 chu kỳ gồm biến tính ở 940C trong 30 giây, bắt cặp ở 530C trong 1 phút, và kéo dài tại 720C trong 1 phút và cuối cùng kéo dài ở 720C trong 10 phút, bảo quản sản phẩm khuếch đại ở 40C.
Bảng 3.8: Thành phần của 1 phản ứng PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205-A-21 [20] Thành phần Nồng độ Thể tích sử dụng (?l) Nồng độ cuối Buffer 10X 5,0 1X MgCl2 25 mM 5,0 2,5 mM Mồi S-G-Clos-0586 50 µM 1,0 1 M Mồi S-G-Clos-1205 50 µM 1,0 1 M
Hỗn hợp dNTP 2,5mM mỗi loại 4,0 200 µM mỗi loại
Taq polymerase 1U/µl 1,25 0,025U/µl
DNA mạch khuơn 5,0
H2O 27,75
Tổng thể tích 50
Sản phẩm PCR sau đĩ được kiểm tra bằng chạy đện di trên gel agarose 1,0% với thang chuẩn Benchtop PCR marker (50-1000bp) của Promega, Inc.
Bảng 3.9: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G- Clos-1205-A-21
Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
94 3 phút 1 94 30 giây 35 53 1 phút 72 1 phút 72 10 phút 1 4 Bảo quản