Máy giải trình tự tự động được sử dụng để giải trình tự đoạn sản pha åm PCR, sản phẩm PCR được giải trình tự hai chiều tại cơng ty Nam Khoa BIOTEK, các chuỗi trình tự ban đầu được sử dụng phầm mềm Chromaspro 1.34 để kiểm tra các peak và nối lại tạo trình tự hồn chỉnh của đoạn 16S rDNA của các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Sản phẩm sau khi giải trình tự sẽ được kiểm tra sử dụng để BLAST (blastn) trở lại nucleotide database trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Các chủng được xác định cùng lồi khi cĩ mức tương đồng di truyền 97% hoặc cao hơn. Sử dụng cơng cụ Classifier thuộc cơ sở dữ liệu Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/hierarchy.jsp) để xác định độ tương đồng của trình tự 16S rDNA Clostridium sp. nghiên cứu với các trình tự trên cơ sở dữ liệu Ribosomal Database Project, sử dụng phầm mềm MegAlign, FastPCR 5.3 và Chromaspro 1.34 để điều chỉnh trình tự của các lồi Clostridium sp. thu nhận từ EMBL , sau đĩ sử dụng chức năng Multi Aligment của phần mềm Lasergene 7.0 để tạo ma trận về độ tương đồng di truyền và tạo cây phát sinh lồi.
Bảng 3.10: Trình tự 16S rDNA của các lồi Clostridium từ EMBL
STT Tên lồi Acession number Database
1 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 X78070 EMBL 2 Clostridium aciditolerans JW/YJL-B3 DQ114945 EMBL 3 Clostridium aminobutyricum DSM 2634 X76161 EMBL 4 Clostridium aurantibutyricum NCIMB 10659 X68183 EMBL 5 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 CP000721 EMBL 6 Clostridium botulinum ATCC 23387 X68171 EMBL 7 Clostridium butyricum DSM 8082 X68178 EMBL 8 Clostridium celatum DSM 1785 X77844 EMBL 9 Clostridium celatum DSM 1785 X77844 EMBL 10 Clostridium cellulolyticum ATCC 35319 X71847 EMBL 11 Clostridium cellulosi D3 FJ465164 EMBL 12 Clostridium cellulovorans DSM 3052 X73438 EMBL 13 Clostridium glycolicum DSM 1288 X76750 EMBL 14 Clostridium histolyticum JCM 1403 AB566416 EMBL 15 Clostridium lentocellum DSM 5427 X76162 EMBL 16 Clostridium ljungdahlii DSM 13528 CP001666 EMBL 17 Clostridium longisporum DSM 8431 X76164 EMBL 18 Clostridium novyi ATCC 27323 AB041865 EMBL 19 Clostridium pasteurianum JCM 1408 AB536773 EMBL 20 Clostridium perfringens ATCC 13124 AB075767 EMBL 21 Clostridium polysaccharolyticum DSM 1801 X77839 EMBL 22 Clostridium propionicum DSM 1682 X77841 EMBL 23 Clostridium proteolyticum DSM 3090 X73448 EMBL 24 Clostridium saccharobutylicum NRRL B643 U16147 EMBL 25 Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 U16122 EMBL 26 Clostridium scatologenes ATCC 25775 M59104 EMBL 27 Clostridium sporogenes ATCC 3584 X68189 EMBL 28 Clostridium tetani NCTC 279 X74770 EMBL 29 Clostridium thermocellum ATCC 27405 CP000568 EMBL 30 Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 DQ911272 EMBL 31 Clostridium xylanolyticum DSM 6555 X76739 EMBL
VẬT LIỆU VAØ PHƯƠNG PHÁP
83
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập và làm thuần chủng Clostridium sp. cĩ tiềm năng sinh butanol
4.1.1. Thu nhận mẫu phân tích
Chúng tơi đã thu nhận tổng số 24 mẫu gồm 15 mẫu bùn, đất, 9 mẫu phân động vật (bị, voi, nai) được thu từ 9 tỉnh, thành phố ở miền Nam Việt Nam được liệt kê cụ thể trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Các loại mẫu và địa điểm thu mẫu
Loại mẫu STT Địa điểm thu mẫu Thời gian Ký hiệu
Đất (D)
Trồng mía (M)
1 Huyện Gị Dầu, Tây Ninh 03/2010 DM1, DM2 2 Huyện Buơn Đơn, Dak Lak 02/2010 DM3,
DM4 Trồng cao su
(S)
3 Huyện Phú Giáo, Bình Dương 02/2010 DS1 4 TP. Buơn Ma Thuột, Đak Lak 02/2010 DS2 5 Thị xã Đồng Xồi, Bình Phước 02/2010 0 Trồng cà phê
(F)
6 TP. Buơn Ma Thuột, Đak Lak 02/2010 DF1, DF2 7 Huyện Eakar, Đak Lak 01/2010 DF3, DF4
8 Huyện Xuân Lộc, Đồng Nai 03/2010 0
9 Thị xã Bảo Lộc, Lâm Đồng 03/2010 0
Trồng lúa (L)
10 Huyện Nhơn Trạch, Đồng Nai 03/2010 DL1 11 Huyện Cần Giuộc, Long An 03/2010 DL2, DL3 12 Huyện Bình Chánh, TP. HCM 03/2010 DL4 13 Huyện Chợ Gạo, Tiền Giang 03/2010 DL5, DL6 14 Huyện Thuận An, Bình Dương 03/2010 0
Bùn (B) 15 Bàu Sấu ở rừng Nam Cát Tiên 04/2010 DB1,DB2, DB3, DB4
Phân (P)
Bị (B)
16 Quận Thủ Đức, TP.HCM 03/2010 PB1
17 Huyện Long Thành, Đồng Nai 03/2010 PB2, PB3, PB4 18 TP. Buơn Ma Thuột, Đak Lak 02/2010 PB5, PB6
19 Huyện Eaka, Đak Lak 02/2010 PB7
20 Trại bị trường ĐH Nơng Lâm 03/2010 PB8 21 Huyện Buơn Đơn, Đak Lak 02/2010 PB9, PB10 22 Huyện Bình Chánh, TP.HCM 03/2010 0 Nai (N) 23 Đồng cỏ ở rừng Nam Cát Tiên 04/2010 PN1, PN2 Voi (V) 24 Huyện Buơn Đơn, Đak Lak 02/2010 PV1, PV2
0, mẫu khơng phân lập hoặc làm thuần được vi khuẩn Clostridium sinh dung mơi
85
4.1.2. Phân lập và làm thuần chủng Clostridium sp. cĩ tiềm năng sinh butanol
Tổng số 24 mẫu thu nhận gồm sau 4 ngày tăng sinh trong mơi trường lỏng RCM, ở 370C, quan sát các ống nghiệm chúng tơi nhận thấy tất cả các ống nghiệm đều đục, cĩ sự thay đổi màu của mơi trường so với ban đầu và trong mơi trường cĩ sự sinh hơi ở tất cả các ống nghiệm đặc biệt các mẫu phân động vật cĩ sự sinh hơi rất mạnh.
Sau đĩ hút 1ml dịch nuơi cấy chuyển sang ống nghiệm khác chứa mơi trường RCM và tiếp tục ủ trong thời gian 2 ngày ở nhiệt độ 370C, chúng tơi nhận thấy quá trình sinh hơi và làm đục mơi trường diễn ra nhanh và mạnh hơn so với lần tăng sinh thứ nhất, kết quả này là do đây là điều kiện chọn lọc thuận lợi cho Clostridium sinh trưởng và phát triển.
Sau khi làm thuần các chủng vi khuẩn phân lập được kiểm tra hoạt tính catalase, những chủng vi khuẩn cĩ kết quả catalase âm tính sẽ được nhuộm gram và nhuộm bào tử để quan sát hình dạng, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử.
Từ 24 mẫu ban đầu sau quá trình phân lập đã chọn được 34 chủng vi khuẩn mang những đặc trưng thuộc giống Clostridium đĩ là vi khuẩn Gram dương hình que, kỵ khí nghiêm ngặt, catalase âm tính, và cĩ khả năng sinh bào tử, cĩ kết quả định tính acetone trên khuẩn lạc dương tính.
Các chủng vi khuẩn phân lập được từ các mơi trường được phân thành 3 nhĩm phụ thuộc vào pH mẫu phân lập là mẫu cĩ pH acid ứng với những mẫu phân lập cĩ giá trị pH ?6,5 (11 chủng), mẫu cĩ pH trung tính ứng với những mẫu phân lập cĩ giá trị 6,5<pH ?7,5 (9 chủng) và mẫu cĩ pH kiềm ứng với những mẫu phân lập cĩ giá trị pH >7,5 (14 chủng).
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium sp. phân lập được trên mơi trường RCM của nhĩm mẫu I cĩ pH acid (pH ? 6,5).
STT Ký
hiệu
pH
mẫu Catalase Gram Hình thái khuẩn lạc
1 DM1 5,76 + Hình trịn, đường kính 1mm, bề mặt trơn, ẩm
ướt, màu đục, khuẩn lạc gồ lên rìa trịn.
2 DM2 5,76 + Hình dạng khơng đều, đường kính 2-5mm, bề
mặt nhám, ẩm ướt, màu xám, lồi, rìa nhăn. 3 DM3 6,04 + Hình trịn, đường kính 2-5mm bề mặt nhám, ẩm
ướt, màu vàng đục, rìa nhăn.
4 DM4 6,04 + Hình trịn, đường kính 1-3mm, bề mặt trơn, sệt,
màu sáng, khuẩn lạc lồi, rìa trịn.
5 DS1 6,02 + Hình trịn, khuẩn lạc dạng chấm 1mm, bề mặt
trơn, ẩm ướt, rìa trịn.
6 DS2 5,73 + Hình trịn, dạng chấm 1mm, bề mặt trơn, màu
hơi vàng, khuẩn lạc lồi, rìa trịn.
7 DF1 6,08 + Hình trịn, đường kính 2-5mm, bề mặt nhám,ẩm ướt, cĩ vịng đục bao quanh, tâm đục, khuẩn lạc lồi, gợn sĩng, rìa nhám.
8 DF2 6,08 + Hình trịn, đường kính 2-5mm, bề mặt sệt,khuẩn lạc lồi, màu trắng đục, gợn sĩng, rìa
nhám.
9 DF3 5,91 + Hình trịn, đường kính 1-2mm, bề mặt trơn, sệt,
màu sáng, khuẩn lạc nhỏ, lồi, rìa trịn.
10 DF4 5,91 + Hình trịn, 1-3mm, bề mặt trơn, sệt, màu sáng,
khuẩn lạc lồi, rìa trịn.
11 DL4 5,86 + Hình trịn, đường kính 1-2mm, bề mặt trơn, sệt,màu trắng sáng, khuẩn lạc nhỏ, lồi, rìa trịn.
Từ mơi trường cĩ giá trị pH trung tính chúng tơi phân lập được 11 chủng được ký hiệu là DM1, DM2, DM3, DM4, DS1, DS2, DF1, DF2, DF3, DF4, DL4. được liệt kê cụ thể trong bảng 4.2, nhĩm này là các chủng Clostridium sp. chủ yếu được phân lập từ mơi trường đất trồng mía, cao su và cà phê, chỉ cĩ một mẫu đất trồng lúa là cĩ giá trị pH acid và phân lập được chủng DL4.
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium sp. phân lập được trên mơi trường RCM của nhĩm mẫu II cĩ pH trung tính (6,5<pH ? 7,5).
STT Ký
hiệu
pH
mẫu Catalase Gram Hình thái khuẩn lạc
1 DL1 6,65 + Hình trịn, đường kính 1-2mm, bề mặt trơn, sệt,màu trắng đục, khuẩn lạc nhỏ, lồi, rìa trịn. 2 DL2 6,87 + Hình trịn, đường kính 2-5mm, bề mặt trơn, sệt,
màu sáng, khuẩn lạc lồi, rìa trịn.
3 DL3 6,87 + Hình dạng khơng đều, đường kính 3-5mm, bề
mặt nhám, tâm đục, bao quanh mờ, cĩ thùy. 4 DL5 6,52 + Hình dạng khơng đều, đường kính 2-7mm, bề
mặt trơn, tâm trong, màu trắng sáng, cĩ thùy. 5 DL6 6,52 + Hình dạng khơng đều, đường kính 1-5mm, bề
mặt nhám, ẩm ướt, màu xám, lồi, rìa nhăn. 6 DB1 6,80 + Hình trịn, dạng chấm 1mm, bề mặt trơn, màu
hơi vàng, khuẩn lạc lồi, rìa trịn.
7 DB2 6,80 + Hình dạng khơng đều, đường kính 1-5mm, bề
mặt nhám, ẩm ướt, màu xám, lồi, rìa nhăn. 8 DB3 6,80 + Hình dạng khơng đều, đường kính 3-5mm, bềmặt nhám, bề mặt sệt, tâm đục, bao quanh mờ,
cĩ thùy.
9 DB4 6,80 + Hình trịn, đường kính 1-3mm, bề mặt trơn, sệt,
màu trắng sáng, khuẩn lạc lồi, rìa trịn.
Từ mơi trường cĩ giá trị pH trung tính chúng tơi phân lập được 9 chủng được ký hiệu là DL1, DL2, DL3, DL5, DS2, DB1, DB2, DB3, DB4, DB4 được liệt kê cụ thể trong bảng 4.3, nhĩm này là các chủng Clostridium sp. được phân lập từ đất ở tình trạng ẩm ướt như đất trồng lúa, đất bùn đầm lầy.
Từ mơi trường cĩ giá trị pH kiềm chúng tơi phân lập được 14 chủng được ký hiệu là PB1, PB2, PB3, PB4, PB5, PB6, PB7, PB8, PB9, PB10, PN1, PN2, PV1, PV2 được liệt kê cụ thể trong bảng 4.4, nhĩm này là các chủng được phân lập từ mơi trường phân động vật, đặc điểm chung của nhĩm Clostridium phân lập từ mơi trường này là khả năng sinh hơi rất mạnh trong mơi trường tăng sinh RCM.
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của các chủng vi khuẩn Clostridium sp. phân lập được trên mơi trường RCM của nhĩm mẫu III cĩ pH kiềm (pH > 7,5).
STT Ký
hiệu
pH
mẫu Catalase Gram Hình thái khuẩn lạc
1 PB1 7,56 + Hình trịn, 2-5mm, bề mặt nhám, tâm đục, cĩ
vịng mờ, lồi, chia thùy.
2 PB2 7,62 + Hình trịn, 2-5mm, bề mặt nhám, tâm đục, cĩ
vịng mờ, lồi, chia thùy.
3 PB3 7,62 + Hình trịn, 3-5mm, bề mặt trơn, tâm trong, cĩ
vịng sáng, chia thùy.
4 PB4 7,62 + Hình trịn, khuẩn lạc dạng chấm 1mm, bề mặt
trơn, nhớt, màu vàng đục, lồi, rìa trịn.
5 PB5 7,81 + Hình trịn, đường kính 1-3mm, sệt, cĩ vịng đục
bao quanh, tâm đục, u lên, rìa trịn.
6 PB6 7,81 + Hình trịn, dạng chấm 1mm, bề mặt trơn,
nhớt, màu vàng đục, tâm lồi, rìa trịn.
7 PB7 7,62 + Hình trịn, khuẩn lạc dạng chấm 1mm, bề mặt
nhám, ẩm ướt, màu xám, lồi, rìa trịn.
8 PB8 7,80 + Hình dạng khơng đều, đường kính 3-5mm, bềmặt nhám, bề mặt sệt, tâm đục, bao quanh mờ, cĩ thùy.
9 PB9 7,58 + Hình trịn, đường kính 1-3mm, bề mặt trơn, sệt,
màu sáng, khuẩn lạc lồi, rìa trịn.
10 PB10 7,58 + Hình trịn, khuẩn lạc dạng chấm 1mm, bề mặt
nhám, ẩm ướt, màu trắng trong, rìa trịn.
11 PN1 7,72 + Hình trịn, đường kính 1-3mm, bề mặt trơn, tâm
trong, cĩ vịng sáng, lồi, chia thùy.
12 PN2 7,72 + Hình trịn, đường kính 3-5mm, bề mặt trơn, tâm
trong, cĩ vịng sáng, lồi, chia thùy.
13 PV1 7,68 + Hình trịn, dạng chấm 1mm, bề mặt trơn,
nhớt, màu vàng đục, lồi, rìa trịn.
14 PV2 7,68 + Hình trịn, đường kính 1-3mm, cĩ vịng đục bao
quanh, tâm đục, u lên, rìa trịn.
Các khuẩn lạc phân lập được cĩ đặc điểm chung là cĩ khuẩn lạc trịn,
đường kính nhỏ, đường kính khuẩn lạc từ 1-3mm, khơng tạo sắc tố trên mơi trường RCM, cĩ vịng bao quanh từ đục đến sáng, rìa trịn hoặc chia thùy.
DM1 DS1 DF1
DF2 DF3 DL1
DL2 DL3 DL4
DL5 PB7 PB10
Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc của một số chủng Clostridium sp. phân lập được trên mơi trường RCM
Tiến hành nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn phân lập được để kiểm tra sự tạo thành bào tử, kết quả tồn bộ 34 chủng phân lập trong điều kiện kỵ khí đều cĩ khả năng tạo bào tử, đặc điểm chung của bào tử được tạo là cĩ dạng dùi trống hoặc dạng oval. So sánh kích thước của tế bào cĩ bào tử và tế bào sinh dưỡng bình thường, chúng tơi nhận thấy rằng phần lớn các chủng này khi tạo bào tử, bào tử làm căng phồng tế bào mẹ dẫn đến kích thước đường kính tế bào lớn hơn so với kích thước ban đầu, đây là đặc trưng của giống Clostridium [31].
Bảng 4.5 : Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các chủng vi khuẩn thuộc nhĩm mẫu I phân lập được trên mơi trường RCM
STT Ký hiệu
Hình dạng tế bào sinh dưỡng
Kích thước tế bào sinh dưỡng (m) Hình dạng bào tử Kích thước bào tử (?m) 1 DM1 Hình que 0,89 x 2,75 Hình dùi trống 0,92 x 2,20 2 DM2 Hình que 0,69 x 2,52 Hình bầu dục 1,07 x 2,36 3 DM3 Hình que 0,81 x 3,66 Hình dùi trống 0,95 x 2,60 4 DM4 Hình que 0,59 x 2,75 Hình dùi trống 0,79 x 2,58 5 DS1 Hình que 1,07 x 3,14 Hình dùi trống 0,90 x 2,98 6 DS2 Hình que 0,63 x 2,91 Hình dùi trống 0,82 x 2,48 7 DF1 Hình que 0,61 x 2,81 Hình bầu dục 0,95 x 2,61 8 DF2 Hình que 0,59 x 3,72 Hình dùi trống 0,81 x 2,41 9 DF3 Hình que 0,63 x 2,18 Hình bầu dục 1,09 x 2,19 10 DF4 Hình que 0,67 x 3,08 Hình bầu dục 1,05 x 2,55 11 DL4 Hình que 0,86 x 3,04 Hình dùi trống 1,05 x 2,55
Kích thước tế bào của các chủng vi khuẩn Gram dương, hình que phân lập được chiều rộng từ 0,52-1,07?m, chiều dài từ 2,05-4,24?m, kích thước bào tử chiều rộng từ 0,65-1,17?m, chiều dài từ 2,07-2,98?m tuy nhiên hình dạng và kích thước bào tử cịn phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của bào tử.
Bảng 4.6 : Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các chủng vi khuẩn thuộc nhĩm mẫu II phân lập được trên mơi trường RCM
STT hiệuKý Hình dạng tế bào sinh dưỡng
Kích thước tế bào sinh dưỡng (m) Hình dạng bào tử Kích thước bào tử (?m) 1 DL1 Hình que 1,06 x 3,08 Hình bầu dục 1,28 x 2,69 2 DL2 Hình que 0,61 x 2,05 Hình bầu dục 1,19 x 2,77 3 DL3 Hình que 0,85 x 2,91 Hình bầu dục 1,23 x 2,86 4 DL5 Hình que 0,56 x 2,91 Hình bầu dục 0,90 x 2,37 5 DL6 Hình que 0,85 x 3,31 Hình dùi trống 1,05 x 2,83 6 DB1 Hình que 0,52 x 3,79 Hình dùi trống 0,65 x 2,94 7 DB2 Hình que 0,64 x 3,20 Hình bầu dục 0,95 x 2,16 8 DB3 Hình que 0,91 x 3,12 Hình dùi trống 1,01 x 2,23 9 DB4 Hình que 0,92 x 3,05 Hình dùi trống 0,94 x 2,35
10 C.sbu Hình que 0,77 x 3,35 Hình dùi trống 0,85 x 2,36 11 C.bjn Hình que 0,70 x 3,74 Hình bầu dục 1,03 x 2,91
C. sbu: C. saccharobutylicum NRRL B 643; C. bjn: C. beijerinckii NRRL B592 Bảng 4.7 : Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các chủng vi khuẩn thuộc nhĩm mẫu III phân lập được trên mơi trường RCM
STT hiệuKý Hình dạng tế bào sinh dưỡng
Kích thước tế bào sinh dưỡng (m) Hình dạng bào tử Kích thước bào tử (?m) 1 PB1 Hình que 0,65 x 2,87 Hình bầu dục 0,82 x 2,69 2 PB2 Hình que 1,03 x 4,05 Hình dùi trống 1,02 x 2,79 3 PB3 Hình que 0,81 x2,88 Hình dùi trống 0,97 x 2,07