a. Thử nghiệm sinh H2S
Nguyên tắc: một số vi khuẩn cĩ enzyme desulfohydrase xúc tác sự chuyển hĩa trong điều kiện kỵ khí các acid amin chứa lưu huỳnh như cysteine,
methionine và giải phĩng H2S. Khí H2S sinh ra kết hợp với chỉ thị sắt (II) trong mơi trường nuơi cấy tạo tủa màu đen.
Fe2+ + S2- ? FeS đen.
Cách tiến hành: cấy vào đĩa vơ trùng 1ml dịch mẫu đã được pha lỗng thích hợp vào 1 đĩa petri vơ trùng. Đổ 10ml mơi trường TSI đã được ủ ấm 450C vào đĩa, lắc đều. Sau khi mơi trường đã đơng, đổ thêm lên bề mặt khoảng 5ml TSI. Đĩa đã cấy mẫu được ủ 370C, 2 ngày trong các bình kỵ khí.
Kết quả:
Sinh H2S dương tính (+) thì khuẩn lạc cĩ màu đen
Sinh H2S âm tính (-) thì khuẩn lạc khơng chuyển sang màu đen. b. Kiểm tra khả năng mẫn cảm với rifampicin
Nguyên tắc: khả năng mẫm cảm hay kháng rifampicin là một trong những chỉ tiêu quan trọng được sử dụng để phân loại các chủng Clostridium sp. sinh dung mơi, kháng sinh khuếch tán vào mơi trường thạch chứa vi sinh vật kiểm định sẽ tạo ra các vịng ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định. Dựa vào vịng ức chế, ta xác định được chủng vi sinh vật kiểm định là mẫn cảm hay kháng lại rifampicin.
Cách tiến hành: chủng vi khuẩn được hoạt hĩa từ dạng bào tử trong 3ml RCM và ủ ở 370C trong 12 giờ (mật độ tối ưu được xác định bằng đo mật độ quang OD ở bước sĩng 600nm, giá trị từ 0,3 - 0,4), đĩa agar phải đảm bảo bề mặt đủ khơ trước khi đĩa rifampicin được đặt lên bề mặt agar. Tiến hành trải mẫu lên các đĩa RCM agar, đặt đĩa giấy lọc chứa 10 và 100ng rifampicin đã được sấy khơ lên bề mặt agar, ủ 340C trong 24 giờ. Tính mẫn cảm với rifampicin được xác định bởi vịng kháng khuẩn xung quanh đĩa [33].
Nếu cĩ vịng kháng khuẩn ở đĩa giấy chứa nồng độ kháng sinh là 10ng rifampicin thì chủng vi khuẩn mẫm cảm với rifampicin (RifS).
Nếu khơng cĩ vịng kháng khuẩn ở đĩa giấy chứa nồng độ kháng sinh là 100ng rifampicin thì chủng vi khuẩn cĩ khả năng kháng rifampicin (RifR. c. Thử nghiệm Indol
Nguyên tắc:
Tryptophan là một acid amin cĩ thể bị oxy hố bởi một số vi sinh vật cĩ hệ enzyme tryptophanase tạo indol (skatol), sản phẩm trung gian là indolpyruvic acid. Việc phát hiện Indol được thực hiện bằng thuốc thử p– Dimethylaminobenzaldehyde. Nhân pyrol của indol kết hợp với nhân benzen của p – DMABA tạo phức dạng quinone cĩ màu đỏ.
Cách tiến hành: chọn khuẩn lạc cĩ đường kính lớn hơn 1mm cấy chuyền vào canh trypton, ủ 400C trong 24 giờ. Nhỏ 1ml eter vào ống nghiệm để chiết Indol. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào để yên vài phút. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Kết quả:
Indol dương tính (+): cĩ sự xuất hiện màu đỏ trên bề mặt mơi trường. Indol âm tính (-): cĩ lớp màu vàng của thuốc thử trên bề mặt mơi trường.
Đơi khi cĩ sự xuất hiện màu cam do Skatol là tiền chất methyl hĩa Indol tạo ra.
d. Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate khác nhau
Nguyên tắc: thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng một nguồn carbon nhất định để tăng trưởng. Vi khuẩn cĩ khả năng sử dụng các
nguồn carbon khác nhau để tăng trưởng, các nguồn carbon cĩ thể được chia thành 3 nhĩm là đường đơn (monosaccharide), đường đa (oligo hay polysaccharide) và đường rượu. Khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau để lên men, tùy phương thức biến dưỡng, các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau gồm rượu, acid hữu cơ... trong tất cả các trường hợp, sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH mơi trường. Do đĩ khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate dựa vào sự giảm pH mơi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị phenol red trong mơi trường và sự sinh khí trong mơi trường lỏng được bẫy trong ống durham.
Cách tiến hành: mơi trường sử dụng là Phenol Red Broth Base cĩ pH 7,4, chỉ thị pH thường dùng là phenol red, màu đỏ sẽ chuyển sang vàng khi pH dưới
6,8.
Cấy và ủ 37oC trong 18 – 20 giờ. Tiến hành thí nghiệm với mẫu chứng âm là mơi trường đường khơng cấy vi sinh vật.
Đọc kết quả:
Khả năng sử dụng nguồn carbohydrate của chủng nghiên cứu được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi.
Sinh acid dương tính (+): khi mơi trường với chỉ thị phenol red chuyển thành màu vàng. Ngược lại, nếu mơi trường màu đỏ thì sinh acid là âm tính (-).
Sinh hơi dương tính (+): khi cĩ bọt khí trong ống durham, khơng cĩ bọt khí thì sinh hơi là âm tính (-).