Một trong những mục tiêu tổng quát trong phân loại học vi khuẩn là xây dựng một hệ thống phát sinh lồi tự nhiên mà phản ánh đúng lịch sử con đường tiến hĩa của từng nhĩm vi khuẩn giúp cho chúng ta hiểu được mối quan hệ giữa các lồi trong quá trình tiến hĩa. Về mặt thực tế, những nỗ lực xây dựng hệ thống cây phát sinh lồi sẽ giúp cho chúng ta nhiều tiện ích trong việc sắp xếp các nhĩm một cách ổn định, nhờ đĩ sẽ giúp làm giảm mạnh việc tái sắp xếp lại các lồi dựa vào hệ thống phân loại dựa trên kiểu hình thường được sử dụng trong quá khứ [3].
Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào vật liệu di truyền là một phương pháp tin cậy, cĩ độ chính xác cao, tiến hành trong thời gian ngắn, khơng cần nuơi cấy, khắc phục được một nhược điểm lớn của phương pháp định danh truyền thống là phải nuơi cấy, tiến hành nhiều phản ứng sinh hĩa phức tạp, tuy nhiên địi hỏi phải cĩ trang thiết bị hiện đại, cơ sở dữ liệu, thơng tin về đặc điểm di truyền của đối tượng cần nghiên cứu đầy đủ [3].
Việc sử dụng các chỉ thị phân tử đáng tin cậy đã trở thành một chìa khĩa giúp tháo gỡ những điểm thắc mắc trong mối quan hệ tiến hĩa giữa các lồi và thành lập một hệ thống phát sinh lồi dành cho vi khuẩn. Trình tự rRNA với chiều dài khoảng 1500 ribonucleotide thể hiện sự tiến hĩa của hệ thống vi sinh và là một cơng cụ tuyệt vời để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh lồi. Lý do để người ta sử dụng những trình tự này làm chỉ thị phân tử đĩ là cấu trúc phân tử rRNA là yếu tố cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp protein ở tất cả các hệ thống tế bào. Chính vì tính bảo tồn cao của những phân tử này nên trình tự gen mã hĩa cho những phân tử này thay đổi một cách chậm hơn nhiều so với khối lượng gen khổng lồ cịn lại của cơ thể sinh vật và do đĩ sẽ cĩ những vùng tương đồng giữa các lồi và giữa các lồi cĩ mối quan hệ họ hàng thì độ tương đồng càng cao, và dựa vào những trình tự này chúng ta cĩ thể xác định được mối quan hệ giữa các lồi thậm chí đối với những lồi cĩ mối quan hệ tiến hĩa xa và chúng được sử dụng như là một thước đo sự tiến hĩa. Thêm vào đĩ, cĩ những đoạn của những phân tử rRNA cĩ tính biến động cao theo quá trình tiến hĩa và cho phép so sánh giữa các lồi cĩ mối quan hệ gần gũi điều này càng làm tăng thêm giá trị và tính hữu ích của phương pháp phân tích hệ thống phát sinh lồi
[1].
Dữ liệu về trình tự 16S rDNA ngày nay đã được xây dựng rất cơng phu và mang tính cập nhật rất cao, bất cứ trình tự của một lồi vi khuẩn nào được giải trình tự sẽ được đưa lên ngân hàng gen (Genbank) và tất cả các nhà khoa học từ khắp nơi trên thế giới dễ dàng tiếp cận được sử dụng chúng để thiết lập mối quan hệ giữa các lồi vi khuẩn từ đĩ tiếp tục phát triển hệ thống cây phát sinh lồi. Nỗ lực trong việc tạo ra cơ sở dữ liệu trình tự 16S rDNA giúp tạo ra những nguyên tắc cơ bản quan trọng cho việc phân loại các lồi Clostridium sp. [39].
Đến bây giờ giống Clostridium cĩ hơn 150 lồi và cĩ sự khác biệt về hình thái và vật liệu di truyền. Các trình tự 16S rRNA cho thấy rằng các thành viên của giống Clostridium thuộc vào 19 cụm (cluster I–cluster XIX), hơn một nửa các lồi Clostridium sp. đã được mơ tả thuộc về cluster I và đây là cụm Clostridium lớn nhất [13].
Chỉ sử dụng đặc tính khả năng sinh dung mơi khơng phải là cơng cụ hữu ích để phân loại Clostridium [18]. Phương pháp sinh học phân tử gần đây được sử dụng rộng rãi như một cơng cụ cơ bản để phân loại các lồi vi khuẩn, ví dụ như để phân chia các lồi vi khuẩn thành các nhĩm cĩ ý nghĩa sinh học.
Cây phát sinh lồi dựa vào giá trị tương ứng của vùng 23S và 16S rRNA của vi khuẩn là một phương pháp được nhiều nhà khoa học sử dụng ngồi ra người ta cịn sử dụng rất nhiều phương pháp nghiên cứu về sự thay đổi hình dạng và kích thước của nhiều loại marker phát sinh lồi như các nhân tố kéo dài và các tiểu đơn vị của ATPase [39]. Lawson và cs, (1993) đã xác định trịnh tự 16S rDNA của 17 chủng Clostridium sp. bằng cách giải trình tự trực tiếp đoạn gen này thơng qua phương pháp PCR.
Tất cả các chủng vi khuẩn Clostridium sinh dung mơi thuộc một nhĩm khơng đồng nhất, gồm các chủng sau: C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. madisonii, C. saccharoperbutylacetonicum, C. butyricum, C. saccharo-butyl- acetonicum- liquefaciens và một số lồi khác. Gần đây một nghiên cứu cĩ hệ thống 55 lồi vi khuẩn cĩ khả năng sinh dung mơi dựa vào việc sử dụng phân tích điện di PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis), kết quả nghiên cứu này chia nhĩm Clostridium cĩ khả năng sinh dung mơi thành 4 nhĩm, dựa vào trình tự của
Nhĩm I Clostridium acetobutylicum, bao gồm cả chủng Weizmann, chủng ATCC 824 và các chủng C. acetobutylicum được phân lập cĩ khả năng sử dụng tinh bột (bao gồm DSM 1731, 1732, 1733, 1737).
Nhĩm II Clostridium saccharo-butyl-acetonicum-liquefaciens, bao gồm C. NCP262, NRRL B643 và các chủng NCP.
Nhĩm III Clostridium saccharoperbutylacetonicum, bao gồm N1-4 (=ATCC 12564) và N1-504 (=ATCC 27022) .
Nhĩm IV Clostridium beijerinckii, bao gồm các chủng C. acetobutylicum (NCIMB 8052, 8049, 6444, 6445, 8653 và các chủng khác), C. beijerinckii, C.
madisonii và C. saccharoacetobutylicum [33].