Kết quả giải trình tự vùng gene 16S rDNA của 8 chủng đều tốt, các peak rõ ràng dễ đọc khơng bị chồng lấp, trình tự nguyên vẹn 16S rDNA của 8 chủng nguyên vẹn được thu nhận nhờ xử lý với phần mềm Chromaspro 1.34 với độ dài trình tự sau khi nối như bảng 4.13.
Bảng 4.13: Chiều dài đoạn gene 16S rDNA giải trình tự
Chủng DF3 DL1 DL2 DL3 DL4 DL5 PB7 PB10
Độ dài trình tự (bp) 1416 1422 1422 1416 1422 1419 1416 1419
Tồn bộ trình tự 16S rDNA của các chủng được BLAST trên NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), để so sánh độ tương đồng. Kết quả về độ tương đồng di truyền của 8 chủng Clostridium sp. phân lập với các chủng đã cơng bố trên NCBI được thể hiện trong bảng 4.14.
Bảng 4.14: Hệ số tương đồng di truyền của 8 chủng Clostridium sp. nghiên cứu với các lồi Clostridium đã được cơng bố trên NCBI
Chủng Tên lồi Clostridium cĩ độ tương đồng cao
Query
coverage Max Ident
DF3 Clostridium sporogenes Clostridium botulinum 100 % 100 % 100 % 100% DL1 Clostridium butyricum 100 % 100 % DL2 Clostridium butyricum 100 % 99 % DL3 Clostridium butyricum 100 % 99 % DL4 Clostridium acetobutylicum 100 % 99 % DL5 Clostridium butyricum 100 % 99 % PB7 Clostridium butyricum 99 % 100 % PB10 Clostridium butyricum 100 % 99 %
Bảng 4.14 cho thấy tất cả 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu đều thuộc giống
Clostridium, cĩ độ tương đồng di truyền 99-100% với các chủng Clostridium đã
được cơng bố trên NCBI, cho thấy sự tương đồng rất cao giữa trình tự 16S rDNA của các chủng nghiên cứu và các chủng đã cơng bố trên NCBI.
Căn cứ vào kết quả BLAST, chúng tơi nhận thấy 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu đều thuộc giống Clostridium và thuộc vào cluster I (Clostridium nhĩm I). Trong đĩ chủng DL1, DL2, DL3, DL5, PB7, PB10 thuộc lồi Clostridium butyricum và DL4 thuộc lồi Clostridium acetobutylicum, cịn lại chủng DF3 chưa thể kết luận chính xác được, để cĩ thể kết luận chính xác 8 chủng vi khuẩn thuộc vào lồi nào thì cần dựa vào kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh lồi.
Thu nhận trình tự 16S rDNA của các lồi Clostridium sp. chuẩn từ cơ sở dữ liệu EMBL–Ribosomal Database Project, sử dụng phầm mềm MegAlign, FastPCR 5.3 và Chromaspro 1.34 để điều chỉnh trình tự của các lồi Clostridium sp., sau đĩ sử dụng chức năng Multi Aligment của phần mềm Lasergene 7.0 để tạo ma trận về độ tương đồng di truyền và tạo cây phát sinh lồi.
Cây phát sinh lồi được xây dựng từ trình tự 16S rDNA xấp xỉ 1235 bp nằm giữa vị trí từ 200 đến 1434 (vị trí theo vùng tương đồng trên gene 16S rDNA ở E. coli) phân tích bằng phương pháp Neighbor – joning.
Theo Collins và cs, 1994, giống Clostridium gồm những vi sinh vật kỵ khí nghiêm ngặt, Gram dương, cĩ khả năng hình thành nội bào tử, được chia thành 19 cluster từ cluster I đến cluster XIX, trong đĩ cluster XIV gồm hai cụm là XIVa và XIVb. Cluster I là nhĩm lớn nhất, chứa nhiều lồi Clostridium sp. mà chúng ta biết kể cả cĩ lợi lẫn cĩ hại đối đời sống với con người và tất cả 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu đều thuộc vào cluster I .
Từ ma trận (%) tương đồng di truyền 16S rDNA của các chủng Clostridium sp. nằm trong cluster I (Bảng 4.15) chúng tơi nhận thấy chủng DF3 cĩ mức độ tương đồng di truyền với lồi Clostridium sporogenes ATCC 3584 là 100%, trong khi độ tương đồng di truyền với Clostridium botulinum ATCC 23387 chỉ là 95,5%, ngồi ra khi quan sát trên hình cây phát sinh lồi ta thấy DF3 và Clostridium sporogenes thuộc cùng một group (chỉ số bootstrap 100%) kết hợp với kết quả BLAST, Classifier cĩ thể kết luận chủng DF3 thuộc giống Clostridium, lồi Clostridium sporogenes, nếu chỉ dựa vào các đặc tính sinh lý sinh hĩa thì khơng thể định danh đến mức lồi chính xác chủng DF3 là Clostridium sporogenes.
Hình 4.8: Cây phát sinh lồi tổng quát thể hiện mối quan hệ của các chủng
Clostridium DF3, DL1, DL2, DL3, DL4, DL5, PB7, PB10 với các chủng vi khuẩn
khác thuộc giống Clostridium. Thước chỉ số thể hiện số nucleotide khác biệt trên 100 nucleotide. Phương pháp phân tích Neighbor-joining dựa vào ma trận của từng cặp trình tự để so sánh, tìm kiếm số nucleotide thay đổi để xếp cụm, cặp trình tự cĩ ít thay đổi nhất hay cĩ độ tương đồng cao nhất sẽ cĩ vị trí gần nhau nhất trên cây phát sinh lồi.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Bảng 4.15: Ma trận (%) tương đồng di truyền 16S rDNA của các chủng Clostridium nằm trong cluster I, được phân tích bằng chương trình MegAlign trong phầm mềm Lasergene 7.0, DNASTAR.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 ID 99,6 93,1 91,5 91,5 91,4 91,3 91,3 91,3 91,3 90,5 91,1 91,3 90,4 90,6 90,6 90,2 1 2 99,6 ID 93,1 91,5 91,5 91,5 91,4 91,3 91,3 91,3 90,5 90,9 91,4 90,4 90,7 90,7 90,2 2 3 93,1 93,1 ID 91,3 91,3 91,3 91,2 91,0 90,9 90,9 90,9 91,1 91,2 90,3 91,3 91,3 92,3 3 4 91,5 91,5 91,3 ID 100 99,9 99,8 99,4 99,4 99,4 97,2 97,1 97,8 95,5 90,2 90,2 90,2 4 5 91,5 91,5 91,3 100 ID 99,9 99,8 99,4 994 99,4 97,2 97,1 97,8 95,5 90,2 90,2 90,2 5 6 91,4 91,5 91,3 99,9 99,9 ID 99,9 99,4 99,4 99,3 97,1 97,0 97,9 95,4 90,3 90,3 90,2 6 7 91,3 91,4 91,2 99,8 99,8 99,9 ID 99,3 99,4 99,4 97,0 96,9 97,8 95,3 90,2 90,2 90,1 7 8 91,3 91,3 91,0 99,4 99,4 99,4 99,3 ID 99,9 99,9 96,8 96,7 97,5 95,6 89,9 89,9 89,9 8 9 91,3 91,3 90,9 99,4 99,4 99,4 99,4 99,9 ID 99,8 96,7 96,7 97,6 95,6 90,0 90,0 89,8 9 10 91,3 91,3 90,9 994 99,4 99,3 99,4 99,9 99,8 ID 96,7 96,7 97,4 95,6 89,8 89,8 89,8 10 11 90,5 90,5 90,9 97,2 97,2 97,1 97,0 96,8 96,7 96,7 ID 97,8 98,4 95,4 90,2 90,2 90,2 11 12 91,1 90,9 91,1 97,1 97,1 97,0 96,9 96,7 96,7 96,7 97,8 ID 98,3 95,6 90,3 90,3 90,3 12 13 91,3 91,4 91,2 97,8 97,8 97,9 97,8 97,5 97,6 97,4 98,4 98,3 ID 95,6 90,3 90,3 90,2 13 14 90,4 90,4 90,3 95,5 95,5 95,4 95,3 95,6 95,6 95,6 95,4 95,6 95,6 ID 89,7 89,7 90,7 14 15 90,6 90,7 91,3 90,2 90,2 90,3 90,2 89,9 90,0 89,8 90,2 90,3 90,3 89,7 ID 100 92,0 15 16 90,6 90,7 91,3 90,2 90,2 90,3 90,2 89,9 90,0 89,8 90,2 90,3 90,3 89,7 100 ID 92,0 16 17 90,2 90,2 92,3 90,2 90,2 90,2 90,1 89,9 89,8 89,8 90,2 90,3 90,2 90,7 92,0 92,0 ID 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1. Clostridium acetobutylicum ATCC 824; 2. DL4; 3. Clostridium pasteurianum JCM 1408; 4. DL1; 5. DL3; 6. PB7; 7. DL5; 8. Clostridium butyricum DSM 8082; 9. PB10; 10. DL2; 11. Clostridium beijerinckii JCM 7833; 12. Clostridium saccharobutylicum NRRL B-643 ; 13. Clostridium saccharoperbutylacetonicum N 1-4; 14. Clostridium botulinum ATCC 23387; 15. Clostridium sporogenes
ATCC 3584; 16. DF3; 17. Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755.
92
Tương tự chủng DL4 cĩ kết quả BLAST với mức độ tương đồng di truyền cao nhất tương ứng Clostridium acetobutylicum là 100%, và khi nhìn vào kết quả ma trận tương đồng thì độ tương đồng của DL4 với chủng Clostridium acetobutylicum ATCC 824 đạt 100%, trên hình cây phát sinh lồi DL4 và Clostridium acetobutylicum thuộc cùng một group (chỉ số bootstrap 100%), ngồi ra khi lên men chủng DL4 cũng cho kết quả lên men sau 168 giờ tốt nhất với lượng butanol tổng hợp được là 3,982g/L vì vậy chúng tơi kết luận DL4 thuộc giống Clostridium, lồi Clostridium acetobutylicum.
Kết quả Classifier cho thấy các chủng cịn lại là DL1, DL2, DL3, DL5, PB7, PB10 thuộc giống Clostridium, khi quan sát trên cây phát sinh lồi ta thấy nhĩm này thuộc vào một cụm cĩ chứa lồi Clostridium butyricum DSM 8082 (chỉ số bootstrap 88,1%) và hồn tồn tách biệt với các nhĩm cịn lại, trong đĩ mức tương đồng di truyền của 2 chủng DL2, PB10 với Clostridium butyricum rất cao đều là 99,9%; kết hợp với kết quả BLAST khi phân tích các chủng này đều cho mức độ tương đồng với Clostridium butyricum là 100% vì vậy 2 chủng này đều thuộc giống Clostridium, lồi Clostridium butyricum. Ta thấy cĩ sự tách biệt của nhĩm 4 chủng này trên cây phát sinh lồi so với Clostridium butyricum DSM
8082, cộng với mức tương đồng của 4 chủng DL1, DL3, DL5, PB7 với
Clostridium butyricum DSM 8082 lần lượt là 99,4%; 99,4%; 99,3%; 99,4%, tuy nhiên với mức độ khác biệt di truyền từ 0,6-0,7% với Clostridium butyricum DSM
8082 khơng đủ cơ sở để kết luận các chủng này là một lồi mới do đĩ cĩ thể chúng là một lồi phụ của Clostridium butyricum. Ngồi ra khi nhìn lại kết quả lên men của các chủng này ta thấy pH mơi trường sau lên men thấp từ 5,06-5,19 nhưng lượng butanol tổng hợp chỉ ở mức từ 0,027-2,958 g/L điều này là do các chủng đã ưu tiên tổng hợp nhiều acid butyric và làm hạ nhanh pH mơi trường.
Theo kết quả sắp giĩng cột ta thấy trên trình tự 16S rDNA của các chủng
Clostridium sp. nghiên cứu cĩ 3 vùng biến động lớn đĩ chính là các vùng cĩ vị trí
93
từ 309-417; 951 -982 và 1115-1147 (vị trí theo vùng tương đồng trên gene 16S rDNA ở E. coli), trong đĩ vùng gen từ vị trí 1115-1147 là cĩ sự biến động lớn nhất, chính sự biến động trong các vùng này quyết định tính đặc trưng của các lồi vi khuẩn trong giống Clostridium, để kiểm chứng lại lập luận này chúng tơi tiến hành xây dựng cây phân phát sinh lồi cho 8 chủng nghiên cứu và các lồi Clostridium thuộc cluster I (hình 4.9).
Hình 4.9: Cây phát sinh lồi chi tiết thể hiện mối quan hệ của các chủng Clostridium DF3, DL1, DL2, DL3, DL4, DL5, PB7, PB10 với các lồi Clostridium sp. khác trong cluster I.
Cây được xây dựng từ trình tự 16S rDNA xấp xỉ 605 bp nằm giữa vị trí từ 602 đến 1206 (vị trí theo vùng tương đồng trên gene 16S rDNA ở E. coli) phân tích bằng phương pháp Neighbor – Joning. Trị số bootstrap (1000 lần lặp) được thể hiện ở các node, chỉ cĩ giá trị bootstrap >50% được thể hiện, thước chỉ số thể hiện số nucleotide khác biệt trên 100 nucleotide, Clostridium glycolicum được sử dụng làm outgroup. Những trình tự được sử dụng để phân tích được thu nhận từ cơ sở dữ liệu Ribosmal Database Project.
11 0
Qua phân tích đặc điểm của vùng 16S rDNA nằm giữa vị trí từ 602 đến
1205 (vị trí theo vùng tương đồng trên gene 16S rDNA ở E. coli) như trên chúng ta thấy kết quả đã một lần nữa khẳng định về vị trí của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là thuộc vào cluster I (cluster cĩ chứa các lồi Clostridium cĩ khả năng tổng hợp dụng mơi) và mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn nghiên cứu với các lồi Clostridium sp. liên quan được làm sáng tỏ.