3.2.3.1. Mơi trường RCM Cao nấm men 3g Casein peptone 10g Cao thịt 10g Glucose 5g Tinh bột 10g NaCl 5g Sodium acetate 3g Cysteine HCl 0,5g Nước cất đủ 1000ml pH: 6,8 ± 0,1
3.2.3.2. Mơi trường T6KH2PO4 0,5g KH2PO4 0,5g MgSO4 . 7H2O 0,3g FeSO4 . 7H2O 0,01g Ammonium acetate 3g Cao nấm men 2g Tryptone 6g Cysteine HCl 0,5g Agar 18g Glucose 60g Nước cất 1000ml Điều chỉnh pH: 6,5 bằng NaOH 10N.
3.2.3.3. Triple Sugar Iron Agar (TSI) cho thử nghiệm sinh H2S
Cao thịt 3g Cao nấm men 3g Pepton 15g Proteose Pepton 5g Lactose 10g Glucose 1g Saccharose 10g FeSO4 0,2g NaCl 5g Na2S2O3 0,3g Agar 12g Phenol red 0,024g Nước cất 1000ml
3.2.3.4. Mơi trường Indole cho thử nghiệm Indol
L-Tryptophan 1g
NaCl 1g
K2HPO4 3,13g
KH2PO4 0,27g
Nước cất 200ml
Chỉnh pH đến 7,3 ± 0,2. Phân phối 4ml vào các ống nghiệm. Hấp ở 121oC trong 15 phút, pH cuối 7,2 ± 0,2.
3.2.3.5. Phenol Red Carbohydrate Broth:Proteon Pepton 10g Proteon Pepton 10g NaCl 5g Cao thịt 1g Phenol Red 0,018g Nước cất 1000ml Carbohydrate 10g
Carbohydrate: dextrose, fructose, galactose, lactose, maltose, malnitol, sorbose, saccharose, trehalose, xylose.
Rĩt 2,5ml mơi trường vào các ống nghiệm chứa ống durham kiểm tra sự lên men. Hấp 118oC trong 15 phút. pH cuối 7,4 ± 0,2.
3.2.3.6. Thuốc thử kiểm tra sự hiện diện của acetone [39]* Sodium nitroprusiate 5% (w/v) * Sodium nitroprusiate 5% (w/v) Sodium nitroprusiate 5g Nước cất 100ml * Ammonium hydroxide 2% (w/v) NH4OH 25% 8,0ml Nước cất 92ml
3.2.3.7. Hĩa chất dùng trong điện diAgarose Agarose
TAE 1X (TRIS – Acetate 40mM; EDTA 0,1mM, pH 8,0)
Dung dịch nạp mẫu 6X (Bromophenol Blue 0,25%;glycerol 40% trong TAE 1X) Thang chuẩn DNA 1kb Ladder (0,5–10kb) của Sigma-Aldrich, Inc;
Thang chuẩn Benchtop PCR marker (50-1000bp) của Promega, Inc 3.2.3.8. Hĩa chất dùng cho PCR
Bộ hĩa chất của PCR của Promega dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) Buffer
MgCl2
Tad Polymerase Dung dịch TE
Cặp primer (do Invitrogen, Inc tổng hợp)
Cặp mồi 16S rDNA chuyên biệt cho vi khuẩn (Lane, 1991);
Eubac 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
Cặp mồi 16S rDNA chuyên biệt cho Clostridium do Rani Rekha và cs, 2006 thiết kế [42]:
S-G-Clos-0586-S-21 5’- CTCAACTTGGGTGCTGCATTT-3’
S-G-Clos-1205-A-21 5’- ATTGTAGTACGTGTGTAGCCC-3’
3.2.4. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các chủng Clostridium sp. cĩ khả năng sinh tổng hợp butanol được phân lập từ các mẫu đất và phân động vật tại các địa điểm khác nhau như bảng 4.1.
Mơi trường Reinforced Clostridia Medium (RCM; HiMEDIA) được sử dụng để phân lập, mơi trường T6 với nồng độ glucose (6% w:v) được sử dụng làm nguồn carbon trong các thí nghiệm kiểm tra sự tổng hợp butanol.
Mơi trường nuơi cấy lỏng được chuẩn bị trong erlen 500ml, khuấy bằng con cá từ ở nhiệt độ 500C và sục với ống dẫn hỗn hợp khí N2-CO2 bổ sung resazurin, nĩ sẽ tự động chuyển thành chỉ thị oxy hĩa khử resorufin cĩ màu hồng khi bị oxy hĩa và khơng màu khi bị khử, chuyển từng thể tích 6ml mơi trường vào ống nghiệm cĩ nắp với chuơng durham và tiếp tục sục khí cho đến khi mơi trường trong ống nghiệm mất màu hồng và tiến hành khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau khi cấy vi sinh vật, bổ sung 1ml dung dịch sodium thioglycolate 0,2% (w/v) để
duy trì mơi trường kỵ khí và 1ml parafin lỏng để ngăn cản sự khuếch tán của oxy khơng khí vào trong mơi trường.
Mơi trường nuơi cấy trên các đĩa Petri agar: sau khi cấy chủng vi sinh vật được đặt trong các hộp thủy tinh cĩ nắp được đệm bằng màng cao su, mơi trường kỵ khí trong hộp được duy trì bằng túi kỵ khí Anaeocult®C (Merck) với thanh chỉ thị kỵ khí theo kèm.
3.2.5. Chủng vi sinh vật chuẩn
Clostridium saccharobutylicum NRRL B-643, Clostridium beijerinckii
NRRL B-594 được sử dụng để tham khảo thu nhận từ bộ sưu tập giống NRRL, U.S Peoria, Ill.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
Sau thu nhận mẫu, mẫu được xử lý và cho 1,0g mẫu đất và 0,5g mẫu phân vào 6ml mơi trường RCM lỏng chứa trong các ống nghiệm cĩ nắp thêm 1ml parafin lỏng và cuối cùng bổ sung 1ml sodium thioglycolate 0,2% để tạo mơi trường kỵ khí, đem các ống nghiệm này đi ủ trong bể ổn nhiệt 700C trong 10 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng và các loại vi khuẩn khác cĩ trong mẫu, chọn lọc các lồi vi khuẩn Clostridium sp. cĩ khả năng tạo bào tử và bước này cũng là bước kích thích việc nảy mầm của các bào tử Clostridium cĩ trong mẫu, ủ trong thời gian 4 ngày ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ kiểm tra sự sinh hơi trong chuơng durham và độ đục của mơi trường, sau thời gian 4 ngày, lấy 1ml mẫu từ ống nghiệm đã ủ được chuyển sang ống nghiệm cĩ nắp khác chứa mơi trường RCM thêm 1ml parafin lỏng và bổ sung 1ml sodium thoglycolate 0,2% để tạo mơi trường kỵ khí, đem các ống nghiệm này đi ủ trong bể ổn nhiệt 700C trong 10 phút để chọn lọc các chủng vi khuẩn Clostridium sp. cĩ khả tạo bào tử và tiếp tục ủ trong thời gian 48 giờ ở nhiệt độ 370C, ghi nhận hiện tượng sinh hơi và làm đục mơi trường.
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Đối với mẫu đất: đất là cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các lồi vi sinh vật, chọn những vùng đất trồng khơ ráo, khơng lấy mẫu khi đất bị ướt trên cùng một vùng chia thành các lơ khác nhau để thu mẫu. Mẫu khơng được lấy ở những vùng đất đã được bĩn phân hữu cơ hoặc phân trộn trong vịng 6 tháng hay những vùng đất vừa bị đốt cháy. Mẫu được thu ở những độ sâu khác nhau
của những vùng đất canh tác nơng nghiệp từ những địa điểm khác nhau.
Mẫu
Cho vào mơi trường RCM,
bổ sung sodium thioglycolate và parafin Ủ trong bể ổn nhiệt 70oC, 10 phút Tăng sinh
Ủ trong bể ổn nhiệt 70oC, 10 phút Trải đĩa
Phân lập Ủ 3 - 5 ngày, 37 oC
Lặp lại 2 – 3 lần Kiểm tra hoạt tính catalase, nhuộm Gram Kiểm tra sinh acetone, nhuộm bào tử
Làm thuần
Kiểm tra khả năng sinh butanol
Bảo quản giống Định danh Hình 3.1 Quy trình phân lập và định danh Clostridium sinh butanol
Dùng xẻng rửa sạch, lau cồn để lấy mẫu đất ở nhiều độ sâu khác nhau.
Đầu tiên ta cần loại bỏ lớp đất bề mặt dày 2 – 3cm trên cùng tránh bị nhiễm bởi các vi sinh vật bên ngồi, sau đĩ lấy những tảng nguyên vẹn theo độ sâu của lớp đất nghiên cứu, chiều dài của tảng đất bằng chiều dày của tảng đất muốn lấy.
Trên diện tích 1 hecta lấy từ 2–5 mẫu/ lơ/hecta, tại mỗi vị trí lấy thêm một mẫu phụ dự trữ. Các mẫu đất được trộn đều, sau đĩ lấy khoảng 100g đất cho vào túi plastic sạch và khơ, ghi nhận các thơng tin về địa điểm thu mẫu, ngày thu mẫu.
Đối với mẫu bùn: dùng xẻng sạch gạt bỏ lớp bùn trên mặt và thu nhận lớp dưới khoảng 100g, cho vào vào túi plastic sạch và khơ, ghi nhận các thơng tin về địa điểm thu mẫu, ngày thu mẫu.
Đối với mẫu phân động vật: mẫu lấy phải khơ ráo, khơng lấy mẫu bị ướt. Dùng xẻng rửa sạch, lau cồn để lấy mẫu. Đối với mẫu phân thu nhận bằng cách lấy từ 2 – 5 mẫu ở các khu vực (hoặc trang trại) khác nhau. Các mẫu phân được trộn đều sau đĩ lấy khoảng 10g cho vào túi plastic sạch và khơ, ghi nhận các thơng tin về địa điểm thu mẫu, ngày thu mẫu.
Các mẫu được phơi khơ trong 1 tuần, lưu ý, đối với mẫu phân phải phơi
thật khơ nếu khơng sẽ cĩ mùi khĩ chịu và khĩ thao tác, mẫu được tán nhỏû và được ria qua rây (lỗ cĩ kích thước 2mm). Mẫu bùn khơng cần phơi khơ mà được sử dụng trực tiếp để phân lập.
Mẫu sau đĩ được chia nhỏ thành 10g đối với mẫu đất, bùn, 5g đối với mẫu phân và bảo quản ở nhiệt độ phịng trong các túi plastic nhỏ.
Huyền phù 1g mẫu vào 10ml nước cất thành dung dịch đồng nhất sau 20 phút tiến hành xác định pH mẫu [39].
3.3.2. Phân lập và làm thuần chủng Clostridium sp. cĩ tiềm năng sinh butanol
Nguyên tắc: phân lập là cơng việc tách rời một loại tế bào từ quần thể vi sinh vật sau đĩ cấy chúng lên bề mặt mơi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau khi ủ ở điều kiện thích hợp, các tế bào sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể riêng biệt gọi là khuẩn lạc. Một khuẩn lạc được ch?n và cấy vào ống mơi trường giữ giống và ủ ở điều kiện thích hợp để chúng phát triển thành một quần thể mới. Quần thể tế bào trong ống nghiệm này được gọi là một chủng.
3.3.2.1. Phân lập chủng Clostridium sp.
Cách tiến hành: 1g mẫu đất, bùn hoặc 0,5g phân động vật được cho vào ống nghiệm chứa 6ml mơi trường RCM kỵ khí, ủ ở 80oC trong vịng 10 phút để bất hoạt tế bào sinh dưỡng, mục đích chọn lọc được những chủng Clostridium sp. cĩ khả năng hình thành bào tử. Các ống nghiệm được ủ ở 37 oC, 4 ngày trong điều kiện kỵ khí. Điều kiện kỵ khí được duy trì bằng cách thêm 1ml parafin lỏng sau đĩ b? sung 1ml dung dịch sodium thioglycolate 0,2% (w/v). Kiểm tra thường xuyên sự phát triển dựa vào độ đục của mơi trường và sinh hơi.
Sau 4 ngày ủ, những ống nghiệm cĩ sự sinh hơi và phát triển của vi sinh vật được chọn và pha lỗng ở nồng độ thích hợp, trải lên đĩa mơi trường RCM agar. Trước khi trải đĩa, ta ủ ống nghiệm ở 70oC trong vịng 10 phút để bất hoạt tế bào sinh dưỡng.
3.3.2.2. Làm thuần chủng Clostridium sp.
Tiến hành pha lỗng: hút 100 ?l mẫu cho vào eppendorf chứa 900 ?l dung dịch n??c mu?i sinh lý NaCl 0,85% (w/v) ta được nồng độ 10-1, hút 100 ?l mẫu nồng độ 10-1cho vào eppendorf chứa 900 ?l dung dịch n??c mu?i sinh lý NaCl
0,85% (w/v) ta được nồng độ 10-2, tương tự ta cĩ mẫu với nồng độ 10-3, 10-4 [4]. Hút 100 ?l dịch pha lỗng cho vào các đĩa mơi trường, dùng que trải thủy tinh vơ trùng trải đều cho đến khi mặt thạch khơ ráo.
Quấn các đĩa petri bằng một lớp màng parafin 3M, đặt các đĩa petri trong một bình thủy tinh kín cĩ nắp đệm cao su, chứa túi kỵ khí Anaerocult®C để tạo điều kiện kỵ khí, ủ 37oC trong 4–5 ngày sau đĩ cấy chuyền và làm thuần chủng.
Tiếp tục cấy chuyền lên các đĩa mơi trường RCM tương ứng đến khi chủng thuần, sau đĩ cấy các khuẩn lạc đơn của các chủng phân lập được vào ống nghiệm cĩ chứa 6ml mơi trường RCM lỏng như vậy ta phân lập các chủng thuần được giữ trong dịch lỏng RCM.
Sau đĩ hút 100 ?l dịch ủ trải lên đĩa agar RCM, bọc bằng màng parafin cho vào hộp thủy tinh và loại oxy bằng túi kỵ khí Anaerocult®C, sau thời gian 48 giờ, kiểm tra hoạt tính catalase các khuẩn lạc đã mọc trên mơi trường agar RCM bằng H2O2 3%, khuẩn lạc nào mọc được trên mơi trường agar RCM và âm tính catalase (-) sẽ được chọn, sau đĩ tiến hành nhuộm gram, quan sát gram, hình dạng, kích thước tế bào sinh dưỡng, nhuộm bào tử để xem hình dạng, kích thước của bào tử và kiểm tra khả năng sinh dung mơi của các chủng phân lập được.
3.3.2.3. Kiểm tra hoạt tính catalase:
Nguyên tắc: thử nghiệm catalase dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí với vi sinh vật kỵ khí. Enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật hiếu khí, thơng thường những vi sinh vật khơng cĩ hệ thống cytochrom thì cũng khơng cĩ enzym catalase, vì thế chúng khơng cĩ khả năng phân huỷ hydropeoxide. Catalase xúc tác phản ứng phân hủy hợp chất hydroperoxide, trong phản ứng này một phân tử hydroperoxide đĩng vai trị là một chất cho điện tử và một phân tử hydroperoxide khác đĩng vai trị là một chất nhận điện tử. Cơ chất bị khử bởi nhạân hydrogen cung cấp từ phân tử cho điện tử, quá trình diễn ra giải phĩng oxy
phân tử.
2H2O2 2H2O + O2
Cách tiến hành: dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiến kính sạch, nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính.ghi nhận hiện tượng, Bacillus subtillis được sử dụng làm mẫu đối chứng cho phản ứng Catalase dương tính, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Kết quả:
Catalase dương tính (+) cĩ hiện tượng sủi bọt khí do O2 tạo ra. Catalase dương tính (-) khơng cĩ sủi bọt khí.
3.3.2.4. Nhuộm gram
Nguyên tắc: nhuộm gram hay cịn gọi là phản ứng gram cĩ vai trị quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn. Crystal violet là thuốc nhuộm cơ bản, dựa vào khả năng bắt màu với thuốc nhuộm tím kết tinh (crystal violet) và lugol, tất cả vi khuẩn chia thành 2 nhĩm lớn: vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm Cách tiến hành: ? Dùng que cấy vơ trùng lấy một khuẩn lạc vi khuẩn từ thạch hịa vào 1 giọt nước
cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí. Cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bơi trên ngọn lửa đèn cồn.
? Nhuộm bằng dung dịch tím tinh thể (crystal violet) trong 20 giây, rửa nước 2 giây, thấm khơ.
? Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol (dung dịch cồn Iod 1%) trong 1 phút. Rửa mẫu bằng dung dịch tẩy màu cồn 960, giữ khoảng 10 - 20 giây (để nghiêng tiêu bản, nhỏ từng giọt cồn cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước 2 giây, thấm khơ. ? Nhuộm bằng dung dịch đỏ tía Fuchsin ziehl, 20 giây, rửa nước 2 giây, thấm khơ
nước và để ráo trong khơng khí.
? Quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi, dùng vật kính 100X nhúng dầu.
tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod, kết quả sẽ bắt màu tím. Nhĩm vi
khuẩn Gram âm bị dung mơi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod, do đĩ sẽ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung, kết quả bắt màu đỏ hồng.
3.3.2.5. Nhuộm bào tử
Nguyên tắc: các lồi vi khuẩn thuộc nhĩm Clostridium cĩ khả năng tạo ra cấu trúc gọi là nội bào tử rất bền nhiệt, chúng giúp vi khuẩn kháng lại nhiều hĩa chất vì thế chúng rất dày và dai. Bào tử rất khĩ nhuộm do màng bào tử dày, khĩ bắt màu và chứa nhiều lipid do đĩ phải xử lý bằng nhiệt độ để làm tế bào chất dễ bắt màu. Sau đĩ nhuộm cả tế bào chất và bào tử với thuốc nhuộm cĩ hoạt tính mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi và nhuộm nĩ với thuốc nhuộm phân biệt khác.
Cách tiến hành:
? Dùng que cấy vơ trùng lấy một khuẩn lạc vi khuẩn từ thạch hồ vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí. Cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bơi trên ngọn lửa đèn cồn.
? Đặt lên chỗ vết bơi một mẫu giấy lọc, nhuộm lục malachite 5%, đặt phiến kính lên cốc chứa nước cất đang sơi trong 5 phút. Nếu thuốc nhuộm cạn phải bổ sung ngay. Sau đĩ để phiến kính nguội, bỏ miếng giấy lọc ở trên và rửa nhẹ với nước cất trong 30 giây.
? Nhuộm safranin 0,5% trong khoảng 20 giây, rửa nước để loại bỏ safranin, thấm khơ bằng giấy lọc
? Quan sát bào tử của vi khuẩn dưới kính hiển vi, dùng vật kính 100X nhúng dầu. Kết quả: bào tử màu xanh lục, tế bào sinh dưỡng bắt màu hồng.
3.3.2.6. Kiểm tra khả năng tổng hợp dung mơi
Thu nhận 100?l dịch vi khuẩn đã được làm thuần trải lên mơi trường agar T6, ủ ở nhiệt độ 370C trong 72 giờ trong điều kiện kỵ khí, các khuẩn lạc mọc lên
trên mơi trường agar T6 được kiểm tra khả năng tổng hợp acetone bằng cách nhỏ lên một giọt nhỏ sodium nitroprusiate 5% (w/v) và một giọt amonium hydroxide 2% (w/v), nếu cĩ sự hiện diện của acetone sẽ xuất hiện một vịng hồng bao quanh khuẩn lạc. Các khuẩn lạc dương tính với phản ứng nitroprusiate được ủ ở điều kiện kỵ khí tiếp thêm 96 giờ nữa ở nhiệt độ 370C và nhuộm bào tử để kiểm tra việc tạo bào tử, hình dạng và kích thước của bào tử [39].
Bước tiếp theo là chuyển các chủng thuần phân lập được sang mơi trường bảo quản giống. Sau khi phân lập được các chủng thuần vi khuẩn kỵ khí, ưa nhiệt trung, cĩ khả năng tạo bào tử, cĩ hình que giống Clostridium sẽ tiếp tục được kiểm tra để chọn được các chủng cĩ khả năng sinh tổng hợp butanol, các chủng sau khi kiểm tra