2.2.7.1. Nhiên liệu sinh học
Một trong những thử thách lớn nhất cho sự phát triển của các quốc gia trên thế giới chính là sự phụ thuộc vào nguồn năng lượng mà hiện nay chủ yếu là được cung cấp nhờ vào nguồn dầu mỏ hĩa thạch và năng lượng hạt nhân. Vấn đề an ninh năng lượng được đặt ra ngày càng cấp bách do giá xăng, dầu tăng trong những năm vừa qua. Hơn thế nữa, nguồn năng lượng của tương lai phải đồng thời ngồi việc cung cấp năng lượng phải làm giảm lượng khí gây hiệu ứng nhà kính và an tồn khi sử dụng. Chính phủ của nhiều quốc gia đều nhìn nhận rằng nhiên liệu sinh học là nguồn nhiên liệu của tương lai, ethanol được sử dụng rộng rãi ở Brazil, ở Hoa Kỳ và một số nước Châu Âu, họ nhìn thấy được nĩ sẽ trở thành một trong những nhiên liệu tái sinh đĩng vai trị quan trọng trong 20 năm tới. Ethanol cĩ thể được phối trộn với xăng hoặc sử dụng một mình cho các loại động cơ được thiết kế đặc biệt với các ưu điểm là chỉ số octan cao và nhiệt hĩa hơi cao hơn. Ethanol là một sự lựa chọn tốt cho các loại phương tiện sử dụng nhiên liệu phối trộn trong tương lai [14], [39].
Trước trào lưu sử dụng nhiên liệu sinh học của thế giới, Việt Nam cũng bị lơi cuốn theo trào lưu này. Hơn một thập niên qua, báo chí trong nước cũng
thường đề cập đến việc phát triển nhiên liệu sinh học, nhất là khi giá cả xăng dầu tăng vọt, điển hình bắt đầu từ ngày 30/3/2011 giá xăng ở Việt Nam đã là 21.300 VNĐ/L. Tháng 7/2006 tại Sài Gịn, tháng 10/2007 tại Hà Nội, hàng trăm nhà khoa học và kinh doanh ở Việt Nam hội thảo chung quanh vấn đề nhiên liệu sinh học mà cụ thể là xăng sinh học. Qua các cuộc hội thảo này cho thấy chúng ta chưa chuẩn bị gì cho chiến lược, ngồi một số cá nhân chuyên gia và nhà kinh doanh cĩ tầm nhìn xa, chạy trước thời cuộc. Nhu cầu về nhiên liệu, đặc biệt là xăng động cơ, sẽ tăng mạnh trong thời gian tới nhằm đảm bảo cho sự phát triển kinh tế của Việt Nam, theo thống kê và dự báo của PetroVietnam, nhu cầu về nhiên liệu sẽ tăng 20% mỗi năm. Hiện tại khoảng 16 triệu tấn nhiên liệu các loại được nhập khẩu hàng năm vào Việt Nam. Trong đĩ khoảng hơn 40% (khoảng 7 triệu tấn) là xăng động cơ. Đảm bảo an ninh năng lượng (nhiên liệu) quốc gia – trong tình hình giá xăng dầu thế giới đang và cĩ xu hướng sẽ tăng mạnh - là một trong những ưu tiên hàng đầu của chính phủ. 2.2.7.2. Ứng dụng của butanol
Butanol xuất hiện trong tự nhiên dưới dạng một sản phẩm phụ của quá trình lên men đường và các hydrocarbon khác, cĩ mặt trong nhiều loại thực phẩm và đồ uống. Butanol được sử dụng làm hương liệu nhân tạo tại Mỹ, trong bơ, kem, trái cây, rượu Rum, bánh, kẹo…, nĩ cũng được sử dụng nhiều trong các sản phẩm tiêu dùng [6].
Butanol được sử dụng rộng rãi làm dung mơi và nguyên liệu trong các quá trình tổng hợp hữu cơ; trong dung mơi pha sơn hoặc các chất bao phủ bề mặt; hoặc làm lưu chất thủy lực hoặc lưu chất phanh. Một trong những ứng dụng vơ cùng quan trọng của butanol là làm chất thêm vào xăng hoặc thay thế hồn tồn xăng làm nhiên liệu động cơ. Butanol (C4H10O) cho nhiều năng lượng hơn ethanol và cĩ thể đổ thẳng vào bình xăng xe mà khơng cần biến chế gì thêm. Butanol cĩ thể phối trộn với xăng tốt hơn ethanol, hơn nữa butanol cĩ áp suất bốc hơi nước thấp hơn và chứa năng lượng cao, cĩ thể được trộn với nồng độ cao hơn ethanol. Butanol dễ vận chuyển, tồn trữ và bơm vào bình nguyên liệu của xe, butanol (1-butanol, n-butanol) sạch, độ nhớt thấp, cĩ thể trộn lẫn với nhiều loại dung mơi hữu cơ cơ bản, nhưng chỉ cĩ thể hịa tan trong nước khoảng 70g/lít. Vì vậy mà nĩ thuộc loại hĩa chất khơng thể ăn mịn [6].
Ứng dụng chủ yếu của Clostridium trong cơng nghệ sinh học là lên men acetone–butanol–ethanol bởi C. acetobutylicum thay thế xăng dầu khi nguồn dầu mỏ trở nên đắt đỏ và sẽ cạn dần cuối thế kỷ này đồng thời giảm khí NOx, CO2 cắt giảm khí nhà kính tạo “nhiên liệu sạch” khơng gây ơ nhiễm mơi trường [45]. Các nước đã cĩ thành cơng nghiên cứu và sử dụng nhiên liệu sinh học là Brazil, Mỹ, Canada, Mexico, Châu Âu cĩ Anh, Pháp, Đức, Tây Ban Nha, Bỉ, Áo… Châu Á cĩ Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Nhật Bản [31].
Bảng 2.2 Đặc tính của butanol so với xăng và các alcol khác [45] Nhiên liệu Mật độ năng
lượng Tỉ lệ khơng khí–nhiên liệu Năng lượng riêng Nhiệt hĩa
hơi RON MON
Xăng 32 MJ/L 14,6 2,9 MJ/kg khí 0,36 MJ/kg 91–99 81–89
Butanol 29,2 MJ/L 11,2 3,2 MJ/kg khí 0,43 MJ/kg 96 78
Ethanol 19,6 MJ/L 9,0 3,0 MJ/kg khí 0,92 MJ/kg 129 102
Qua bảng trên ta thấy:
Mật độ (hàm lượng) năng lượng của butanol cao hơn ethanol (29,2 MJ/l so với 19,6 MJ/l).
Chỉ số Octane (RON&MON): tương đương với xăng nhưng thấp hơn ethanol, một loại nhiên liệu cĩ chỉ số octane cao sẽ giảm khả năng kích nổ và các hệ thống điều khiển của các động cơ xe hơi cĩ thể tận dụng điều này bằng cách điều chỉnh thời gian kích nổ. Điều này làm tăng hiệu suất động cơ, dẫn tới hiệu quả kinh tế tốt hơn so với các loại nhiên liệu khác. Ngược lại, một nhiên liệu cĩ chỉ số octane thấp làm tăng khả năng cháy nổ và hiệu suất thấp hơn, sự cháy nổ cũng sẽ làm hư hỏng động cơ do động cơ mau nĩng hơn, máy cũng mau hao mịn hơn, nhất là các vịng đệm cao su.
Tỉ lệ khơng khí/nhiên liệu: rượu nhiên liệu, bao gồm butanol và ethanol, bị oxy hĩa từng phần trong quá trình cháy nên cần hỗn hợp nhiên liệu giàu hơn so với xăng. Động cơ xăng tiêu chuẩn trong xe hơi cĩ thể điều chỉnh tỷ lệ khơng khí–nhiên liệu cho phù hợp với sự thay đổi của nhiên liệu, nhưng chỉ trong một giới hạn nào đĩ tùy thuộc và loại động cơ, nếu vượt quá giới hạn cho phép trong động cơ chạy butanol nghèo hay xăng pha lượng lớn butanol, động cơ sẽ chạy yếu, và cĩ thể bị phá hủy nghiêm trọng. So với ethanol, butanol cĩ thể pha trộn với xăng với tỷ lệ cao hơn để sử dụng cho động cơ hiện tại mà khơng cần phải lắp đặt gì thêm vì tỷ lệ khơng khí–nhiên liệu và năng lượng của nĩ gần giống với xăng, ngồi ra butanol cĩ thể sử dụng hồn tồn như xăng (mức độ thay thế
100%) mà khơng cần phải thay đổi kết cấu động cơ, trong khi đĩ ethanol chỉ cĩ thể thay thế tối đa 85% xăng với thay đổi lớn trong kết cấu của động cơ. Với yêu cầu giới hạn hàm lượng oxy trong xăng, butanol cĩ thể được pha vào xăng nhiều hơn so với ethanol (khoảng 1,5 lần), bị nhiễm nước và ít bị phân tách hơn so với ethanol [45].
Năng lượng riêng (MJ/kg khí): Nhiên liệu rượu cĩ ít năng lượng hơn xăng xét trên một đơn vị khối lượng hay một đơn vị thể tích. Để cĩ thể so sánh năng lượng giải phĩng trong một chu trình, một tiêu chuẩn đánh giá gọi là năng lượng riêng của nhiên liệu đơi khi được sử dụng. Nĩ được định nghĩa là lượng năng lượng thải ra cho 1 đơn vị khơng khí sử dụng. Năng lượng thải ra trong một chu trình của butanol lớn hơn ethanol hay methanol và lớn hơn khoảng 10% so với xăng với các giá trị lần lượt là butanol 3,2; ethanol 3,0; xăng 2,9.
Nhiệt hĩa hơi: nhiên liệu trong động cơ phải được hĩa hơi trước khi bốc cháy. Vì ẩn nhiệt hĩa hơi của butanol nhỏ hơn một nửa so với ethanol (sử dụng tốt hơn ethanol khi pha với xăng), một động cơ chạy butanol cĩ thể dễ dàng khởi động trong thời tiết lạnh hơn so với ethanol hay methanol, khơng gây hao hụt trong quá trình tồn trữ và khơng như ethanol phải được vận chuyển bằng xe bồn– butanol cĩ thể được vận chuyển bằng đường ống sử dụng cho các sản phẩm xăng
dầu.
Bất lợi của ethanol là hút ẩm nên xăng ethanol cĩ chứa nhiều nước, làm máy khĩ “đề”, làm rỉ sét kim loại, hư mịn chất nhựa, nên địi hỏi phải thay đổi vật liệu làm động cơ, bảo trì xe thường xuyên. Butanol đang cĩ triển vọng sẽ thay thế nguyên liệu xăng dầu truyền thống trong tương lai, butanol là một sản phẩm của một số quá trình lên men, trong đĩ giống Clostridium cho ra butanol nhiều nhất, và các nghiên cứu hiện tại đang trên đường làm tăng tối đa lượng butanol từ sinh khối [46].
Hình 2.9: Xe 100% Butanol [45]
Từ 14/07 đến 15/08, 2005 lần đầu xe 100% Butanol chạy xuyên nước Mỹ, chứng minh với cơng chúng rằng một alcohol được sản xuất từ ngũ cốc cĩ thể thay thế gas và xăng tốt xe cĩ thể chạy tốt khi vượt qua những quả đồi hay băng qua sa mạc. Butanol giảm khoảng 95% Hydrocarbon; 0,01% Carbon monoxide,
37% Oxit nitơ thải ra mơi trường so với xăng [45].
2.3. Định danh Clostridium bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Một trong những mục tiêu tổng quát trong phân loại học vi khuẩn là xây dựng một hệ thống phát sinh lồi tự nhiên mà phản ánh đúng lịch sử con đường tiến hĩa của từng nhĩm vi khuẩn giúp cho chúng ta hiểu được mối quan hệ giữa các lồi trong quá trình tiến hĩa. Về mặt thực tế, những nỗ lực xây dựng hệ thống cây phát sinh lồi sẽ giúp cho chúng ta nhiều tiện ích trong việc sắp xếp các nhĩm một cách ổn định, nhờ đĩ sẽ giúp làm giảm mạnh việc tái sắp xếp lại các lồi dựa vào hệ thống phân loại dựa trên kiểu hình thường được sử dụng trong quá khứ [3].
Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào vật liệu di truyền là một phương pháp tin cậy, cĩ độ chính xác cao, tiến hành trong thời gian ngắn, khơng cần nuơi cấy, khắc phục được một nhược điểm lớn của phương pháp định danh truyền thống là phải nuơi cấy, tiến hành nhiều phản ứng sinh hĩa phức tạp, tuy nhiên địi hỏi phải cĩ trang thiết bị hiện đại, cơ sở dữ liệu, thơng tin về đặc điểm di truyền của đối tượng cần nghiên cứu đầy đủ [3].
Việc sử dụng các chỉ thị phân tử đáng tin cậy đã trở thành một chìa khĩa giúp tháo gỡ những điểm thắc mắc trong mối quan hệ tiến hĩa giữa các lồi và thành lập một hệ thống phát sinh lồi dành cho vi khuẩn. Trình tự rRNA với chiều dài khoảng 1500 ribonucleotide thể hiện sự tiến hĩa của hệ thống vi sinh và là một cơng cụ tuyệt vời để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh lồi. Lý do để người ta sử dụng những trình tự này làm chỉ thị phân tử đĩ là cấu trúc phân tử rRNA là yếu tố cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp protein ở tất cả các hệ thống tế bào. Chính vì tính bảo tồn cao của những phân tử này nên trình tự gen mã hĩa cho những phân tử này thay đổi một cách chậm hơn nhiều so với khối lượng gen khổng lồ cịn lại của cơ thể sinh vật và do đĩ sẽ cĩ những vùng tương đồng giữa các lồi và giữa các lồi cĩ mối quan hệ họ hàng thì độ tương đồng càng cao, và dựa vào những trình tự này chúng ta cĩ thể xác định được mối quan hệ giữa các lồi thậm chí đối với những lồi cĩ mối quan hệ tiến hĩa xa và chúng được sử dụng như là một thước đo sự tiến hĩa. Thêm vào đĩ, cĩ những đoạn của những phân tử rRNA cĩ tính biến động cao theo quá trình tiến hĩa và cho phép so sánh giữa các lồi cĩ mối quan hệ gần gũi điều này càng làm tăng thêm giá trị và tính hữu ích của phương pháp phân tích hệ thống phát sinh lồi
[1].
Dữ liệu về trình tự 16S rDNA ngày nay đã được xây dựng rất cơng phu và mang tính cập nhật rất cao, bất cứ trình tự của một lồi vi khuẩn nào được giải trình tự sẽ được đưa lên ngân hàng gen (Genbank) và tất cả các nhà khoa học từ khắp nơi trên thế giới dễ dàng tiếp cận được sử dụng chúng để thiết lập mối quan hệ giữa các lồi vi khuẩn từ đĩ tiếp tục phát triển hệ thống cây phát sinh lồi. Nỗ lực trong việc tạo ra cơ sở dữ liệu trình tự 16S rDNA giúp tạo ra những nguyên tắc cơ bản quan trọng cho việc phân loại các lồi Clostridium sp. [39].
Đến bây giờ giống Clostridium cĩ hơn 150 lồi và cĩ sự khác biệt về hình thái và vật liệu di truyền. Các trình tự 16S rRNA cho thấy rằng các thành viên của giống Clostridium thuộc vào 19 cụm (cluster I–cluster XIX), hơn một nửa các lồi Clostridium sp. đã được mơ tả thuộc về cluster I và đây là cụm Clostridium lớn nhất [13].
Chỉ sử dụng đặc tính khả năng sinh dung mơi khơng phải là cơng cụ hữu ích để phân loại Clostridium [18]. Phương pháp sinh học phân tử gần đây được sử dụng rộng rãi như một cơng cụ cơ bản để phân loại các lồi vi khuẩn, ví dụ như để phân chia các lồi vi khuẩn thành các nhĩm cĩ ý nghĩa sinh học.
Cây phát sinh lồi dựa vào giá trị tương ứng của vùng 23S và 16S rRNA của vi khuẩn là một phương pháp được nhiều nhà khoa học sử dụng ngồi ra người ta cịn sử dụng rất nhiều phương pháp nghiên cứu về sự thay đổi hình dạng và kích thước của nhiều loại marker phát sinh lồi như các nhân tố kéo dài và các tiểu đơn vị của ATPase [39]. Lawson và cs, (1993) đã xác định trịnh tự 16S rDNA của 17 chủng Clostridium sp. bằng cách giải trình tự trực tiếp đoạn gen này thơng qua phương pháp PCR.
Tất cả các chủng vi khuẩn Clostridium sinh dung mơi thuộc một nhĩm khơng đồng nhất, gồm các chủng sau: C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. madisonii, C. saccharoperbutylacetonicum, C. butyricum, C. saccharo-butyl- acetonicum- liquefaciens và một số lồi khác. Gần đây một nghiên cứu cĩ hệ thống 55 lồi vi khuẩn cĩ khả năng sinh dung mơi dựa vào việc sử dụng phân tích điện di PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis), kết quả nghiên cứu này chia nhĩm Clostridium cĩ khả năng sinh dung mơi thành 4 nhĩm, dựa vào trình tự của
Nhĩm I Clostridium acetobutylicum, bao gồm cả chủng Weizmann, chủng ATCC 824 và các chủng C. acetobutylicum được phân lập cĩ khả năng sử dụng tinh bột (bao gồm DSM 1731, 1732, 1733, 1737).
Nhĩm II Clostridium saccharo-butyl-acetonicum-liquefaciens, bao gồm C. NCP262, NRRL B643 và các chủng NCP.
Nhĩm III Clostridium saccharoperbutylacetonicum, bao gồm N1-4 (=ATCC 12564) và N1-504 (=ATCC 27022) .
Nhĩm IV Clostridium beijerinckii, bao gồm các chủng C. acetobutylicum (NCIMB 8052, 8049, 6444, 6445, 8653 và các chủng khác), C. beijerinckii, C.
madisonii và C. saccharoacetobutylicum [33].
2.4. Giới thiệu cây phát sinh lồi
Cây phát sinh lồi là sơ đồ hình cây thể hiện lịch sử tiến hĩa của một nhĩm các lồi cĩ mối quan hệ họ hàng với nhau và cĩ cùng một tổ tiên chung.
Cấu tạo của một cây phát sinh lồi gồm các nhánh, các node và các lồi sinh vật, mỗi node bao gồm những thành viên cĩ cùng tổ tiên chung gần nhất, mỗi node ứng với một đơn vị phân loại [43].
Cây phát sinh lồi gồm hai loại: cây cĩ gốc (rooted tree) và cây khơng gốc (unrooted tree), đặc điểm chung của cả hai loại này là đều chứa các nhánh, node trong và node ngồi. Chiều dài nhánh thể hiện thời gian tiến hĩa hoặc thể hiện khoảng cách về di truyền. Node trong được gọi là HTU (hypothetical taxanomic units) và node ngồi gọi là OUT (operation taxanomic units). Những cây cĩ gốc khơng những chỉ con đường tiến hĩa từ một tổ tiên chung mà cịn cho biết mối quan hệ giữa các OUT, cịn cây khơng gốc cho biết mối quan hệ giữa các OUT.
Một outgroup là một OUT chứa những thơng tin bên ngồi mà phân nhánh trước tiên trong cây phát sinh lồi, topology là trật tự của các node trên cây phát sinh lồi. Các yếu tố ảnh hưởng đến vị trí và trật tự của các node là phần mềm sử
,..,? ' A