Tiến hành pha lỗng: hút 100 ?l mẫu cho vào eppendorf chứa 900 ?l dung dịch n??c mu?i sinh lý NaCl 0,85% (w/v) ta được nồng độ 10-1, hút 100 ?l mẫu nồng độ 10-1cho vào eppendorf chứa 900 ?l dung dịch n??c mu?i sinh lý NaCl
0,85% (w/v) ta được nồng độ 10-2, tương tự ta cĩ mẫu với nồng độ 10-3, 10-4 [4]. Hút 100 ?l dịch pha lỗng cho vào các đĩa mơi trường, dùng que trải thủy tinh vơ trùng trải đều cho đến khi mặt thạch khơ ráo.
Quấn các đĩa petri bằng một lớp màng parafin 3M, đặt các đĩa petri trong một bình thủy tinh kín cĩ nắp đệm cao su, chứa túi kỵ khí Anaerocult®C để tạo điều kiện kỵ khí, ủ 37oC trong 4–5 ngày sau đĩ cấy chuyền và làm thuần chủng.
Tiếp tục cấy chuyền lên các đĩa mơi trường RCM tương ứng đến khi chủng thuần, sau đĩ cấy các khuẩn lạc đơn của các chủng phân lập được vào ống nghiệm cĩ chứa 6ml mơi trường RCM lỏng như vậy ta phân lập các chủng thuần được giữ trong dịch lỏng RCM.
Sau đĩ hút 100 ?l dịch ủ trải lên đĩa agar RCM, bọc bằng màng parafin cho vào hộp thủy tinh và loại oxy bằng túi kỵ khí Anaerocult®C, sau thời gian 48 giờ, kiểm tra hoạt tính catalase các khuẩn lạc đã mọc trên mơi trường agar RCM bằng H2O2 3%, khuẩn lạc nào mọc được trên mơi trường agar RCM và âm tính catalase (-) sẽ được chọn, sau đĩ tiến hành nhuộm gram, quan sát gram, hình dạng, kích thước tế bào sinh dưỡng, nhuộm bào tử để xem hình dạng, kích thước của bào tử và kiểm tra khả năng sinh dung mơi của các chủng phân lập được.
3.3.2.3. Kiểm tra hoạt tính catalase:
Nguyên tắc: thử nghiệm catalase dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí với vi sinh vật kỵ khí. Enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật hiếu khí, thơng thường những vi sinh vật khơng cĩ hệ thống cytochrom thì cũng khơng cĩ enzym catalase, vì thế chúng khơng cĩ khả năng phân huỷ hydropeoxide. Catalase xúc tác phản ứng phân hủy hợp chất hydroperoxide, trong phản ứng này một phân tử hydroperoxide đĩng vai trị là một chất cho điện tử và một phân tử hydroperoxide khác đĩng vai trị là một chất nhận điện tử. Cơ chất bị khử bởi nhạân hydrogen cung cấp từ phân tử cho điện tử, quá trình diễn ra giải phĩng oxy
phân tử.
2H2O2 2H2O + O2
Cách tiến hành: dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiến kính sạch, nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính.ghi nhận hiện tượng, Bacillus subtillis được sử dụng làm mẫu đối chứng cho phản ứng Catalase dương tính, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Kết quả:
Catalase dương tính (+) cĩ hiện tượng sủi bọt khí do O2 tạo ra. Catalase dương tính (-) khơng cĩ sủi bọt khí.