Phân lập và khảo sát đặc tính của vi khuẩn nội sinh ở cây trinh nữ (Mimosa pudica L.) tại tỉnh Trà Vinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRẦN TRỌNG HIẾU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY TRINH NỮ Mimosa pudica L... Ngành Cô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRẦN TRỌNG HIẾU

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA

VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY TRINH NỮ

(Mimosa pudica L.) TẠI TỈNH TRÀ VINH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số ngành: 60 42 02 01

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP

2015

Footer Page 1 of 126

Ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

TÓM TẮT

Từ lâu thuốc kháng sinh được sử dụng điều trị các bệnh do vi khuẩn Sau một thời gian, các nhóm vi khuẩn đã kháng lại thuốc Tuy nhiên, nhiều cây dược liệu lại không gặp phải bất lợi này Vì vậy, phân lập và khảo sát đặc tính của vi khuẩn nội sinh ở cây Trinh nữ tại tỉnh Trà Vinh được thực hiện Tiến hành khảo sát khả năng cố định đạm theo phương pháp Indophenol blue, tổng hợp IAA theo phương pháp Salkowski, hòa tan lân khó tan và hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giấy thấm Kết quả nghiên cứu có 44 dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ cây Trinh nữ tại tỉnh Trà Vinh Đa

số các dòng vi khuẩn này có dạng hình que, gram âm và có khả năng chuyển động Ngoài ra, chúng còn có các đặc tính cố định đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân khó tan Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của

vi khuẩn cho thấy các dòng vi khuẩn này có thể tổng hợp được một lượng đạm

và IAA nhất định vào ngày 2 sau khi chủng Lượng đạm và IAA này tăng cao nhất vào ngày 4 và giảm dần vào ngày 6 sau khi chủng Trong đó, dòng TH4

có khả năng cố định lượng đạm cao nhất (0,68 µg/mL) Nồng độ IAA cao nhất

là 51,8 µg/mL (do dòng RH5 tổng hợp) Hai mươi chín dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn trên 3 loài vi khuẩn là Aeromonas hydrophila, Escherichia coli và Staphylococcus aureus cho thấy có 16 dòng có tính kháng với Aeromonas hydrophila, có 12 dòng có tính kháng với Escherichia coli, có 7 dòng có tính kháng với Staphylococcus aureus, có 8 dòng có tính kháng với cả Aeromonas hydrophila và Escherichia coli, có 4 dòng có tính kháng với cả Aeromonas hydrophila và Staphylococcus aureus, có 1 dòng có tính kháng với cả 3 loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Escherichia coli và Staphylococcus aureus Hai dòng vi khuẩn được nhận diện

ở cấp độ loài bằng phương pháp giải trình tự vùng gene 16S-rRNA Dòng NH11 được nhận diện là Klebsiella pneumoniae (độ đồng hình 98%) Dòng TH10 có độ đồng hình 99% với Bacillus megaterium

Từ khóa: Bacillus megaterium, cây Trinh nữ, kháng khuẩn, Klebsiella pneumoniae, vi khuẩn nội sinh

Footer Page 2 of 126

Ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

ABSTRACT

Synthetic antibiotics have been used for a long time to treat bacterial pathogen After sometime bacteria could resist to antibiotics However, several medicinal plants have been used instead of synthetic antibiotics but they did not have this problem Therefore, isolation and examine characteristics of endophytic bacteria from Mimosa pudica L cultivated in Tra Vinh province was carried out Conduct examine nitrogen fixation ability

of endophytic bacterial strains followed by Indolphenol blue method, Indole-3-Acetic acid (IAA) synthesis followed by Salkowski method, solubilize insoluble phosphate to soluble and antibacterial activity by blotter diffusion method Forty-four endophytic bacterial strains were isolated from samples of Mimosa pudica L cultivated of Tra Vinh province Almost bacterial cells had rod shape, Gram negative, motile All strains were able to fix nitrogen, synthesized IAA and could solubilize insoluble phosphate to soluble The results showed that these endophytes could produce ammonium and IAA in the medium after

2 nd days The highest amount of ammonium and IAA were produced at day fourth and considerably decreased at 6 th days The strain TH4 had the highest ability of N-fixing with 0,68 µg/mL, while strain RH5 gave highest amount of IAA at 51,8 µg/mL Twenty-nine strains could solubilize insoluble phosphate The results showed that these endophytes could against Aeromonas hydrophila, Escherichia coli and Staphylococcus aureus Sixteen strains showed antibacterial activity against Aeromonas hydrophila, twelve strains could against Escherichia coli and seven strains showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus, eight strains showed antibacterial activity against Aeromonas hydrophila and Escherichia coli, four strains showed antibacterial activity against Aeromonas hydrophila and Staphylococcus aureus and one strains showed antibacterial activity against Aeromonas hydrophila, Escherichia coli and Staphylococcus aureus Comparing the nucleotide sequences in 16S ribosomal RNA with the gene bank database, three isolates were indentified to the species level The strain NH11 was determined as Klebsiella pneumoniae (with 98% homogeneous level) and the strain TH10 had 99% homogeneous level, similarity to Bacillus megaterium Key words: antibacterial activity, Bacillus megaterium, endophytes, Klebsiella pneumoniae, Mimosa pudica L

Footer Page 3 of 126

Ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

MỤC LỤC

Trang

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH BẢNG x

DANH SÁCH HÌNH xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về tỉnh Trà Vinh 3

2.1.1 Vị trí địa lý 3

2.1.2 Điều kiện đất đai 4

2.1.3 Điều kiện sông ngòi 4

2.1.4 Điều kiện thời tiết, khí hậu 5

2.2 Sơ lược về cây Trinh nữ 5

2.2.1 Nguồn gốc, phân bố và phân loại 5

2.2.2 Mô tả thực vật 6

2.2.3 Một số công dụng theo kinh nghiệm dân gian 7

2.2.4 Một số nghiên cứu khoa học trong nước 8

2.2.5 Một số nghiên cứu khoa học ngoài nước 8

2.2.6 Thành phần hóa học của cây Trinh nữ 10

2.2.7 Tính kháng khuẩn của cây Trinh nữ 14

2.2.8 Một số vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ chi Trinh nữ 14

2.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh trong thực vật 16

2.3.1 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 16

2.3.2 Một số giống vi khuẩn nội sinh thường gặp 21

2.4 Sơ lược về vi khuẩn gây bệnh sử dụng trong nghiên cứu 25

Footer Page 4 of 126

Ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

2.4.1 Vi khuẩn Escherichia coli 25

2.4.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 25

2.4.3 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 26

2.5 Sơ lược về kỹ thuật Polymerase Chain Reaction 27

2.6 Sơ lược về kỹ thuật điện di 27

2.7 Giải mã trình tự gene của vi khuẩn nội sinh 28

2.8 Phần mềm phân tích trình tự gene được giải mã 28

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

3.2 Phương tiện nghiên cứu 29

3.2.1 Vật liệu 29

3.2.2 Dụng cụ 30

3.2.3 Trang thiết bị 30

3.2.4 Hóa chất 31

3.3 Phương pháp nghiên cứu 33

3.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh 33

3.3.2 Quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn nội sinh 36

3.3.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh 37

3.4 Khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 38

3.4.1 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Trinh nữ 38

3.4.2 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Trinh nữ 41

3.4.3 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Trinh nữ 43

3.4.4 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Trinh nữ 44

3.5 Tuyển chọn, định danh những dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng 45

3.5.1 Chiết tách DNA của những dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng 45

3.5.2 Định danh các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật Sinh học Phân tử 46 3.6 Phương pháp xử lý số liệu 47

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh 48

4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội sinh 50

Footer Page 5 of 126

Ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

4.1.2 Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn nội sinh 52 4.2 Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn nội sinh 54 4.2.1 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn nội sinh ở nốt rễ (nhóm 1) 54 4.2.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn nội sinh ở rễ (nhóm 2) 56 4.2.3 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn nội sinh ở thân (nhóm 3) 57 4.2.4 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn nội sinh ở lá (nhóm 4) 58 4.2.5 So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng 59 4.3 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh 61 4.3.1 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh ở nốt rễ (nhóm 1) 61 4.3.2 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh ở rễ (nhóm 2) 62 4.3.3 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh ở thân (nhóm 3) 64 4.3.4 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh ở lá (nhóm 4) 65 4.3.5 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng 67 4.4 Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh 68 4.4.1 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh ở nốt rễ (nhóm 1) 68 4.4.2 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh ở rễ (nhóm 2) 69 4.4.3 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh ở thân (nhóm 3) 70 4.4.4 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh ở lá (nhóm 4) 71 4.4.5 So sánh khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng 72 4.5 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh 73

4.5.1 Khả năng kháng với vi khuẩn Aeromonas hydrophila 74 4.5.2 Khả năng kháng với vi khuẩn Escherichia coli 75 4.5.3 Khả năng kháng với vi khuẩn Staphylococcus aureus 77

4.6 Kết quả định danh các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật Sinh học Phân

tử 80

Footer Page 6 of 126

Ngành Công nghệ Sinh học ix Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

4.6.1 Trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của dòng NH11 81

4.6.2 Trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của dòng TH10 83

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 85

5.1 Kết luận 85

5.2 Đề xuất 85

TÀI LIỆU THAM KHẢO 86

PHỤ LỤC 100

Footer Page 7 of 126

Ngành Công nghệ Sinh học x Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Độ ẩm và hàm lượng tro xác định của cây Trinh nữ 11

Bảng 2.2: Kết quả phân tích quang phổ trên các bộ phận của cây Trinh nữ 11

Bảng 2.3: Thành phần chất béo trong lá cây Trinh nữ 13

Bảng 3.1: Thành phần môi trường Nfb 32

Bảng 3.2: Thành phần môi trường PDA 32

Bảng 3.3: Thành phần môi trường NBRIP 33

Bảng 3.4: Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR 46

Bảng 3.5: Quy trình nhiệt độ của phản ứng PCR 46

Bảng 4.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA 49

Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường PDA sau 24 giờ 51

Bảng 4.3: Đặc điểm tế bào vi khuẩn được phân lập trên môi trường PDA 53

Bảng 4.4: Hàm lượng ammonium (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở nốt rễ 55

Bảng 4.5: Hàm lượng ammonium (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở thân 58

Bảng 4.6: Hàm lượng ammonium (µg/mL) của các dòng vi khuẩn triển vọng 60

Bảng 4.7: Hàm lượng IAA (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở nốt rễ 62

Bảng 4.8: Hàm lượng IAA (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở thân 64

Bảng 4.9: Hàm lượng IAA (µg/mL) của các dòng vi khuẩn triển vọng 67

Bảng 4.10: Hiệu quả hòa tan lân (E%) của các dòng vi khuẩn ở nốt rễ 69

Bảng 4.11: Hiệu quả hòa tan lân (E%) của các dòng vi khuẩn ở thân 71

Bảng 4.12: Hiệu quả hòa tan lân (E%) của các dòng vi khuẩn triển vọng 72

Bảng 4.13: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) các dòng VKNS kháng A.hydrophila 74

Bảng 4.14: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các dòng VKNS kháng S.aureus 77

Footer Page 8 of 126

Ngành Công nghệ Sinh học xi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Bản đồ địa lý tỉnh Trà Vinh 3

Hình 2.2: Cây Trinh nữ Mimosa pudica L 6

Hình 3.1: Các bộ phận của cây Trinh nữ được thu và xử lý 29

Hình 3.2: Các bộ phận của cây Trinh nữ được xử lý trước khi phân lập 34

Hình 3.3: Phương pháp pha loãng dịch mẫu 35

Hình 3.4: Dung dịch xây dựng đường chuẩn đạm 39

Hình 3.5: Dung dịch xây dựng đường chuẩn IAA 42

Hình 3.6: Sơ đồ khảo sát khả năng kháng khuẩn 44

Hình 3.7: Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR 47

Hình 4.1: Vòng pellicle xuất hiện sau 2 ngày chủng dịch vi khuẩn 48

Hình 4.2: Khuẩn lạc của dòng NH5 và LH9 phân lập trên môi trường PDA 50 Hình 4.3: Vi khuẩn Gram âm (TH11) và Gram dương (TH8) ở vật kính X100 bằng kính hiển vi điện tử 52

Hình 4.4: Hàm lượng ammonium (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở rễ 56

Hình 4.5: Hàm lượng ammonium (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở lá 59

Hình 4.6: Hàm lượng IAA (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở rễ 63

Hình 4.7: Hàm lượng IAA (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở lá 66

Hình 4.8: Hiệu quả hòa tan lân (E%) của các dòng vi khuẩn ở rễ 70

Hình 4.9: Hiệu quả hòa tan lân (E%) của các dòng vi khuẩn ở lá 72

Hình 4.10: Vòng sáng halo của dòng LH7 và RH5 sau 4 ngày 73

Hình 4.11: Vòng vô khuẩn của dòng TH3, TH10 và LH10 kháng với A.hydrophila 75

Hình 4.12: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) các dòng VKNS kháng E.coli 76 Hình 4.13: Vòng vô khuẩn của dòng TH13 và LH10 kháng với E.coli 76

Hình 4.14: Vòng vô khuẩn của dòng TH2 và TH3 kháng với S.aureus 78

Hình 4.15: Trình tự gen mã hóa 16S-rRNA của dòng NH11 81

Hình 4.16: Trình tự gen mã hóa 16S-rRNA của dòng TH10 83

Footer Page 9 of 126

Ngành Công nghệ Sinh học xii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

- 16S-rRNA 16S ribosomal Ribonucleic acid

(Vùng gen mã hóa 16S-rRNA)

(Vi khuẩn Aeromonas hydrophila)

- BLAST Basic Local Alignment Search Tool

(Công cụ dùng để so sánh trình tự chuỗi nucleotides)

(Cặp bazơ nitơ)

- ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

- ĐHCT Đại học Cần Thơ

- DMSO Dimethyl sulfoxide

(Hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh)

- DNA Deoxyribonucleic acid

(Vật liệu di truyền ở cấp độ phân tử)

- dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates

(Hỗn hợp chứa 4 loại nucleotides)

(Vi khuẩn Escherichia coli)

- IAA Indole-3-Acetic acid

(Kích thích tố tăng trưởng thực vật, Auxin tự nhiên)

- kb Kilo base pairs

(1.000 cặp bazơ nitơ)

- NBRIP National Botanical Research Institute’s Phosphate

(Môi trường chứa lân khó tan NBRIP)

- NCBI National Center for Biotechnology Information

(Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học của Mỹ)

- Nfb Nitrogen fixing bacteria

(Môi trường không đạm Nfb)

(Độ hấp thu quang phổ)

- PCR Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng khuếch đại gen, phản ứng chuỗi trùng hợp)

Footer Page 10 of 126