Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu, khả năng phân hủy sinh học hydrocacbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại quảng ninh

Header Page of 166 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái nguyên - 2008 Footer Page of 166 Header Page of 166 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS NGHIÊM NGỌC MINH Thái nguyên - 2008 Footer Page of 166 Header Page of 166 Lêi c¶m ¬n! Trước hết xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS Nghiêm Ngọc Minh tận tình hướng dẫn dìu dắt trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Trong trình nghiên cứu vừa qua, nhận giúp đỡ bảo tận tình PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà anh chị Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt KS Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn Bá Hữu người giúp đỡ trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, thầy cô bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN tạo điều kiện, giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Đại học Sư Phạm - Đại Học Thái Nguyên Bên cạnh đó, xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để hoàn thành luận văn Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Hà nội, tháng năm 2008 Học viên Lê Tiến Mạnh Footer Page Trung of 166 Số hóa tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có công bố công trình khác Tác giả Lê Tiến Mạnh Footer Page Trung of 166 Số hóa tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 MỤC LỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG .2 DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .8 1.1 Đặc điểm hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .8 1.1.1 Tính chất hóa lý 1.1.2 Tính độc PAH ảnh hƣởng tới môi trƣờng sống .10 1.2 Nguồn gốc phát sinh PAH 13 1.2.1 Hiện trạng ô nhiễm PAH giới Việt Nam 13 1.2.2 Nguồn gốc phát sinh 14 1.3 Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH 15 1.3.1 Phƣơng pháp hóa lý 16 1.3.2 Phƣơng pháp phân hủy sinh học 16 1.4 Phân hủy sinh học PAH vi sinh vật 19 1.4.1 Vi sinh vật phân hủy PAH 19 1.4.2 Cơ chế phân hủy PAH VSV 21 1.5 Các yếu tố ảnh hƣởng tới trình phân hủy hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 25 1.6 Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật 29 1.6.1 Phƣơng pháp phân loại truyền thống 29 1.6.2 Phƣơng pháp phân loại sinh học phân tử .30 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Nguyên liệu hóa chất 33 Footer Page ofTrung 166 Số hóa5bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 2.1.1 Nguyên liệu .33 2.1.2 Hóa chất .33 2.2 Môi trƣờng nuôi cấy 33 2.3 Máy móc thiết bị nghiên cứu 34 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .34 2.4.1 Phân lập vi sinh vật mẫu nƣớc nhiễm dầu 34 2.4.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn .35 2.4.3 Đánh giá khả sử dụng PAH vi khuẩn 36 2.4.4 Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA catechol 2,3-dioxygenase 36 2.4.4.1 Tách chiết DNA tổng số vi khuẩn theo phƣơng pháp Sambrook, Russell 36 2.4.4.2 Nhân đoạn gen phƣơng pháp PCR 37 2.4.4.3 Quy trình biến nạp chọn dòng 38 2.4.4.4 Phƣơng pháp xác định trình tự gen máy tự động 40 2.4.4.5 Phƣơng pháp xây dựng phát sinh chủng loại 41 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả phát triển môi trƣờng chứa PAH 42 3.2 Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn BQN31 .44 3.3 Khả sử dụng loại PAH chủng vi khuẩn BQN31 .45 3.4 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA chủng BQN31 .49 Footer Page ofTrung 166 Số hóa6bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 3.4.1 Tách chiết DNA tổng số nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA kỹ thuật PCR .49 3.4.2 Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 50 3.4.3 Tách DNA plasmid kiểm tra dòng khuẩn lạc thích hợp 52 3.4.4 Trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn BQN31 .54 3.5 Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng BQN31 .57 IV KẾT LUẬN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Footer Page ofTrung 166 Số hóa7bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận8văn nghiệp Header Page of tốt 166 Khoa Sinh - KTNN BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (cặp bazơ) USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ) LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) POP Persistent Organic Pollutant DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid VSV Vi sinh vật X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside μl Microlit μm Micromet PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa nhân) ppm đơn vị phần triệu (mg/l) Footer Page ofTrung 166 Số hóa8bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận9văn nghiệp Header Page of tốt 166 Khoa Sinh - KTNN DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Tính chất vật lý số loại PAH Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả phân hủy PAH 20 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 30 Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập mô i trường khoáng có bổ sung hợp chất PAH 42 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn 44 Bảng 3.3: phổ UV đo khả phân hủy PAH chủng BQN31 46 Bảng 3.4: Khả sử dụng PAH khác chủng BQN31 46 Bảng 3.5: Độ tương đồng chủng BQN31 so với số đại diện công bố ngân hàng gen quốc tế 56 Bảng 3.6: Độ tương đồng đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3 dioxygenase chủng BQN31 so với số đại diện công bố ngân hàng gen quốc tế 60 Footer Page ofTrung 166 Số hóa9bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận10 vănof tốt166 nghiệp Header Page Khoa Sinh - KTNN DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc hóa học số hydrocacbon thơm đa nhân (PAH) Hình 1.2: Các đường phân hủy PAH vi sinh vật 21 Hình 1.3: Ba đường phân hủy hiếu khí PAH vi khuẩn nấm 22 Hình 3.1: Khả phân hủy phenanthrene chủng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 43 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31 45 Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 45 Hình 3.4: DNA tổng số chủng BQN31 50 Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA chủng BQN31 50 Hình 3.6: Kết biến nạp chủng BQN31 51 Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid dòng lựa chọn 52 Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng số 13 53 Hình 3.9: Sản phẩm làm DNA plasmid dòng số 13 chủng vi khuẩn BQN31 53 Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA chủng BQN31 54 Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa so sánh trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA chủng BQN31 số chủng vi khuẩn đại diện Thước đo thể hai nucleotide khác 1.000 nucleotide so sánh 55 Footer Page of 166 Số hóa10 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận64 vănof tốt166 nghiệp Header Page 57 Khoa Sinh - KTNN (B[a]A), chrysene, benzo[a]pyrene (B[a]P), benzo[b]fluoranthene (B[b]F), and dibenz[a,h]anthracene (DB[a,h]A) [24] Như vậy, dựa số đặc điểm hình thái so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA, chủng vi khuẩn BQN31 xếp vào chi Sphingomonas đặt tên Sphingomonas sp BQN31 Chủng vi khuẩn Sphingomonas sp BQN31 thuộc số vi khuẩn sử dụng PAH thường gặp giới Việt Nam 3.5 Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng BQN31 Phân hủy sinh học hydrocarbon thơm điều kiện hiếu khí thường xảy qua bước cắt vòng thơm tạo thành catechol, sản phẩm trung gian phổ biến trình phân hủy hợp chất hydrocarbon thơm Quá trình cắt vòng catechol enzyme dioxygenase xảy hai vị trí meta ortho Tuy nhiên, cắt vòng vị trí meta thực enzyme C23O coi trình phổ biến giai đoạn phân hủy sinh học PAH Xuất phát từ vị trí quan trọng gen mã hóa enzyme C23O việc phân hủy sinh học PAH, gen mã hóa C23O nhiều tác giả nghiên cứu quan trắc Việc nghiên cứu tồn gen tự nhiên chủng vi khuẩn sử dụng PAH cần thiết Trong nghiên cứu này, trình tự đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase chủng BQN31 xác định nhằm mục đích tìm hiểu đa dạng gen chức chất trình làm dầu PAH ô nhiễm mức độ phân tử Các kết thu giúp hiểu rõ trình làm ô nhiễm dầu đa dạng gen chức nước nhiễm dầu khu vực Quảng Ninh Sản phẩm DNA tách phần 3.3.1 dùng làm khuôn để tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi C23OF C23OR Sản phẩm Footer Page of 166 Số hóa64 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 Luận65 vănof tốt166 nghiệp Header Page Khoa Sinh - KTNN PCR thu có kích thước khoảng 750 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (Hình 3.12) kb M Hình 3.12 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase từ DNA tổng số chủng BQN31 cặp mồi C23OF C23OR M- 0,75 0,50 thang DNA chuẩn 1kb atggatgttatgggtttcaaggtcgccaaggacgcggacttggaccattttaccgagcgc M D V M G F K V A K D A D L D H F T E R ttgctcgatatcggtgtccatgtcgacgtgatcccggcgggggaagatcccggtgtaggc L L D I G V H V D V I P A G E D P G V G cgcaagattcggtttaacacgccgacacagcacgtcttcgaactttacgccgagatggcg R K I R F N T P T Q H V F E L Y A E M A ctgtcggccaccggtccggccgtcaagaaccccgatgtctgggtcgtggagccacgtggc L S A T G P A V K N P D V W V V E P R G atgcgtgccacccgctttgatcactgtgcgctcaacggcgtggatatagccagttcggcc M R A T R F D H C A L N G V D I A S S A aagatttttgtcgatgcgcttgatttctcagtcgccgaggaactggtcgatgaaacca gc K I F V D A L D F S V A E E L V D E T S ggcgcccggctcggcatctttcttagctgcagcaacaaagcacacgatgtcgccttctta G A R L G I F L S C S N K A H D V A F L ggctatcccgaagacggtaagatccaccatacctcgttcaacctggaatcctggcacgat G Y P E D G K I H H T S F N L E S W H D gttggccatgccgccgacatcatcagccgctacgatatttcgctggatatcgggccgacc V G H A A D I I S R Y D I S L D I G P T cgtcatgggatcacccgcgggcagacgatctacttcttcgatccctcgggcaaccgcaac Hình 19 phát sinh chủng vi khuẩn đại diện R H G I T R G Q T I Y F F D P S G N R N gaaaccttcagcggcggttacatttattatccggacaatccgcagcgcctgtggcaggca E T F S G G Y I Y Y P D N P Q R L W Q A gagaacgccggcaaggccatcttctactacgaaaaggcgctcaacgaccgcttcctgaca E N A G K A I F Y Y E K A L N D R F L T gt Hình 3.13 Trình tự nucleotide trình tự axít amin suy diễn đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase chủng Sphingomonas sp BQN31 Footer Page of 166 Số hóa65 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận66 vănof tốt166 nghiệp Header Page 59 Khoa Sinh - KTNN Sản phẩm PCR gắn vào vector pCR® 2.1 nhờ enzyme T4 ligase 14oC, biến nạp vào tế bào E coli INV F’, tách chiết kiểm tra DNA plasmid theo Sambook cộng Xác định trình tự đoạn gen mã hóa C23O máy xác định trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, xử lý phần mềm Bioedit 6.0.7 (5/17/04), suy diễn trình tự axít amin, so sánh mức độ tương đồng chương trình Blast (Hình 3.13) Trình tự nucleotide axit amin suy diễn đoạn gen mã hóa C23O chủng BQN31 đăng ký trình tự đoạn gen GenBank với mã số EU814954 ACF24468.1 C23O-Sphi A8AN3 (U73127) C23O-Sphi B2-7 (EU596533) C23O-Rhiz- ZJF08 (DQ534019) xylE-Sphi- KMG425 (AF494100) xylE-Sphi- B1 (U23375) cmpE-Sphi- HV3 (Z84817) catE-Sphi agrestis - HV3 (L10655) phnE-Pseu- DJ77 (U83882) C23O-Pseu- ZP2 (EU082778) C23O-Sphi BQN31 C23O-Sphi- C230 (DQ873681) Hình 3.14 Cây phát sinh chủng loại đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase chủng Sphingomonas sp BQN31 số chủng vi khuẩn đại diện (Thước đo thể nucleotide khác 100 nucleotide so sánh) Footer Page of 166 Số hóa66 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 Luận67 vănof tốt166 nghiệp Header Page Khoa Sinh - KTNN So sánh mức độ tương đồng trình tự đoạn gen mã hóa enzyme catechol-2,3 dioxygenase chủng BQN31 chủng khác GenBank EMBL cho thấy, đoạn gen chủng BQN31 có độ tương đồng cao đoạn gen mã hóa enzyme catechol-2,3 dioxygenase tương tự chủng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas, Pseudomonas (Hình 3.14, Bảng 3.6) Đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase chủng BQN31 có mức tương đồng 99 % với đoạn gen phnE chủng vi khuẩn Pseudomonas sp DJ77, cmpE chủng Sphingomonas sp HV3, catE chủng Sphingomonas agrestis HV3 C23O chủng Pseudomonas sp ZP2 (Bảng 3.6) Bảng 3.6: Độ tương đồng đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3 dioxygenase chủng BQN31 so với số đại diện công bố ngân hàng gen quốc tế STT Chủng vi khuẩn Số nucleotide Mức độ tương tương đồng đồng (%) Sphingomonas sp strain HV3 716*/719# 99,58 Pseudomonas sp DJ77 716*/719# 99,58 Pseudomonas sp ZP2 714*/719# 99,30 Chú thích: *- số nucleotide đoạn gen 16S rRNA chủng BQN31 #- số nucleotide đoạn gen 16S rRNA chủng đại diện Các trình tự nucleotide công bố gen mã hóa C23O đại diện thuộc chi Pseudomonas (P aeruginosa JI104, P putida CF600, P putida P 35X, P putida pDK1, P putida H, P putida pW0, P putida NAH, Pseudomonas sp IC) cho thấy mức tương đồng từ 75% đến 95% [45] Trong đó, mức tương đồng trình tự nucleotide gen vi Footer Page of 166 Số hóa67 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận68 vănof tốt166 nghiệp Header Page 61 Khoa Sinh - KTNN khuẩn thuộc nhóm Sphingomonas (Sphingomonas sp HV3 S yanoikuyae B1) 76,5% Sự giống trình tự nucleotide gen mã hóa C23O chủng vi khuẩn hai chi vào khoảng 50% [45] Trình tự C23O chi khác Ralstonia (R pickettii U20258, R eutropha JMP 52415, R rhodochous X69504, R rhodochous NCIB 13064 Bacillus (B stearothermophilus FDTP-3) không đồng Các trình tự không hoàn toàn giống thành viên, với nhóm Sphingomonas nhóm Pseudomonas Kết thu nghiên cứu lần khẳng định phân bố rộng rãi vi khuẩn sử dụng PAH thuộc nhóm Sphingomonas Chủng vi khuẩn BQN31 vi sinh vật hữu ích trình tự làm xử lý nước thải nhiễm dầu phương pháp phân hủy sinh học sử dụng để xây dựng tập đoàn giống phục vụ cho mục đích xử lý ô nhiễm PAH điểm kiểm soát Footer Page of 166 Số hóa68 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận69 vănof tốt166 nghiệp Header Page 62 Khoa Sinh - KTNN KẾT LUẬN Trong số 15 chủng vi khuẩn có khả sử dụng nguồn PAH phân lập, chủng BQN31 có khả phân hủy mạnh Chủng BQN31 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, khuẩn lạc hình tròn, trơn, lồi nhẹ, trắng đục có ánh xanh, kích thước khoảng 1-2 mm Tế bào vi khuẩn BQN31 có hình que, bề mặt tương đối nhẵn, kích thước khoảng 0,29 – 0,5 m x 0,95 - 1,1 m Sau ngày nuôi lắc nhiệt độ 30oC 200 vòng/phút, môi trường có nồng độ ban đầu 100ppm cho loại PAH, chủng BQN31 có khả sử dụng 69,38% naphthalene, 60,24% phenanthrene, 18,52% fluorene, 25,9% anthracene 18,75% pyrene Dựa số đặc điểm hình thái so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA, chủng BQN31 xếp vào chi Sphingomonas đặt tên Sphingomonas sp BQN31 Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA chủng BQN31 đăng ký GenBank với mã số EU814953 Đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase chủng BQN31 có độ tương đồng cao so với đoạn gen tương tự chủng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas, Pseudomonas Nó có mức tương đồng 99 % với đoạn gen phnE chủng vi khuẩn Pseudomonas sp DJ77, cmpE chủng Sphingomonas sp HV3, catE chủng S agrestis HV3 C23O chủng Pseudomonas sp ZP2 Trình tự nucleotide trình tự axít amin suy diễn đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase chủng Sphingomonas sp BQN31 đăng ký GenBank với mã số EU814954 ACF24468.1 Footer Page of 166 Số hóa69 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63 Luận70 vănof tốt166 nghiệp Header Page Khoa Sinh - KTNN TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Đương Nhã, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Thành Đức (2003) ”Phân loại xạ khuẩn XKDN11 sử dụng dibenzofuran, hyđrocarbon thơm đa nhân phân lập từ đất nhiễm chất độc hóa học”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 3(1), tr 377-386 Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Đương Nhã, Đặng Thị Cẩm Hà (2003), ”Nấm sợi phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân phân lập từ cặn dầu thô giếng khai thác dầu, Vũng Tàu”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(1), tr 255-264 Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thanh Thủy, Ngô Xuân Quý, Nghiêm Xuân Trường, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004), “Khả phân hủy 2,4-D dibenzofuran chủng nấm sợi FDN20”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(4), tr 517-528 Nguyễn Bá Hữu (2002), Nghiên cứu nhóm vi sinh vật khả phân hủy hydrocacbon thơm đa nhân số chủng vi khuẩn trình xử lý ô nhiễm dầu Khe Chè, Quảng Ninh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Hà Nội Nguyễn Bá Hữu, Trần Thị Tường Vi, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007), ”Phân huỷ sinh học dầu diesel hydrocarbon thơm đa nhân số chủng vi khuẩn phân lập từ nước thảI nhiễm dầu kho cảng B12, Quảng Ninh”, Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại Học Thái Nguyên Số (42) Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Thành Đức, (2004), ”Phân loại chủng vi khuẩn HDG1 phân lập từ mẫu nước thải nhà máy giấy Hải Dương”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(2), tr 245-252 Footer Page of 166 Số hóa70 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 Luận71 vănof tốt166 nghiệp Header Page Khoa Sinh - KTNN Nguyễn Đương Nhã (2004) Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả phân huỷ dibenzofuran, hydrocarbonthơm đa nhân hai chủng xạ khuẩn phân lập từ đất ô nhiễm chất độc hoá học Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học công nghệ Việt Nam năm La Thị Thanh Phương, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2003), “Phân hủy sinh học hydrocarbon thơm đa nhân (PAHs) chủng vi khuẩn MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ Vũng Tàu”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1(1), tr 109-117 Mai Anh Tuấn, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004), “Nghiên cứu phân loại khả sử dụng hydrocarbon thơm đa nhân chủng xạ khuẩn XKDN19 phân lập từ đất nhiễm chất độc hóa học”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(3), tr 389-396 Tiếng Anh 10 Ahn Y, Sanseverino J, Sayler GS (1999), “Analyses of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria isolated from contaminated soil”, Biodegradation, 10, pp 149-157 11 Albert L., Juhasz, Ravendra Naidu (2000), “Bioremediation of High molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation Biodeterioration of Benzo[a]Pyren”, International Biodegradation 45, pp 57-88 12 Allison D Gelsenbrecht, Brian P.Hedlund, Mary A.Tichi J T Staley (1998), “Isolation of Marine Polycyclyc Aromatic Hydrocarbon Degrading Cycloclasticus Strain from Gulf of Mexico and Comparison of Their PAH Degradation Ability with That of Puget Sound Cycloclasticus Strains”, Applied and Environmental Mycrobiology, pp.4703-4710 Footer Page of 166 Số hóa71 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận72 vănof tốt166 nghiệp Header Page 65 Khoa Sinh - KTNN 13 A Dhenain , G Mercier , J F Blais , M Bergeron (2006), “PAH removal from black sludge from aluminium industry by flotation using nonionic surfactants”, Environ Technol Sep ;27 (9), pp 1019-30 17067128 Bioinfobank Library 14 BAQAR R ZAIDI†* and SYED H IMAM‡ (1999), “Factors A€ecting Microbial Degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Phenanthrene in the Caribbean Coastal Water”, Marine Pollution Bulletin, Vol 38, No 8, pp 737±742 15 Bidleman T., Walla M., Roura R., et al., (1993), « Organochlorine pesticides in the atmosphere of the southern ocean and Antarctica, January- March, 1990” Mar Pollut Bull 26(5), pp 258- 262 16 Cerniglia C E (1993), “Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons”, Current Opinion in Biotechnology, vol 4, pp 331-338 17 Christian Hamann, Jorg Hegemann, Armin Hildebrandt* (1999), “detection of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation genes in different soil bacteria by polymerase chain reaction and ADN hydridization”, FEMS Microbiology Letters 173, pp 255-263 18 Coates, J.D., R.T Anderson, and D.R Lovley (1996), “Oxidation of Polycyclic Aromatic Hydro- carbons Under Sulfate-Reducing Conditions”, Applied and Environmental Microbiology, 62, pp 10991101 19 C.Lors 1, A.Ryngaert2, F Perie3, L.Diels 2, Evolution of the bacterial diversity during a biological treatment of PAHs contaminated soils Centre National de Recherche sur les Sites et Sols Pollues (CNRSSP), 930, Boulervad Lahure, B.P.537, 59505 Douai Cedex, France 20 Creosote-impregnated waste materials (1993), Canadian Environmental Protection Act, Beauregard Printer Limited, pp 1-32 Footer Page of 166 Số hóa72 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận73 vănof tốt166 nghiệp Header Page 66 Khoa Sinh - KTNN 21 Deborah D, Moody J, Cerniglia CE (2002), “Utilization of mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbon by bacteria isolated from contaminated sediment” FEMS Microbial Ecol 41, pp 1-7 22 Des Rosier P.E., (1983) Method detoxication of dioxins and related compound Am Occup.Hyg., vol.27, No1, pp 57-72 23 Diane Farrelly, Jeremy R Mason, Steve Smith (2000), “The Bioavailability of Polycyclic aromatic hydrocarbons in Soil”, Journal of Conference Abstracts, Vol.5(2), pp 394 24 Dingyi Ye; Akmal siddiqi m.; Maccubbin a e.; Subodh kumar; Sikka h c (1996), “Degradation of polynuclear aromatic hydrocarbons by Sphingomonas paucimobilis”, Environmental science & technology Issn 0013-936x coden esthag, vol 30, no1, pp 136-142 (34 ref.) 25 Draper W M., Stepens R D., Ruzo L O (1987), “Solving hazardous waste problem: learning from dioxin”, Amer Chem Soc., pp 350-366 26 Eliska Komarkova, Jan Paca, Eva Klapkova, Marie Stiborova, Carlos R Socco, Miroslav Sobotka (2003), Brazilian Archives of Biology and Technology, vol 46, no 4, pp 375-421 27 Giraud, Guiraud P., Kadri M., Blake G., Steiman S., (2001) “Biodegradation of phenanthrene and fluoranthene by fungi isolated from an experimental constructed wetland for wastewater treatment”, Wat Res., Vol 35, No.17, pp 4126-4136 28 Gred Deleersnyder, Anita Mirabelli, Amy Boate, Jillian Howarth, Leanne Peck, “Protosal for Soil Bioremediation of PAH and PCP as Proposed by G G Bio Inc” 29 Habe Hiroshi and Omori Toshio, (2003), “Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria”, Biosci, Biotechnol Biochem., 67 (2), pp 225-243 Footer Page of 166 Số hóa73 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận74 vănof tốt166 nghiệp Header Page 67 Khoa Sinh - KTNN 30 Haugland R A., Schelemm D J., Lyons R P III, Sferra P R., Chakrabarty A M (1990), “Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5trichlorophenoxyacetic acid by pure and mixed bacterial cultures”, Appl Environ Microbiol, 56, pp 1357-1362 31 Hiroshi Awata, Stephanie Bates, David Knaub, Rob Popenka (1998), “Polyluclear Aromatic Hydrocacbons: Properties and Environmental Fate”, Environmental Organic Chemistry, Environmental Engineering Science 32 Hughes JB., Ward CH., Denise M (1998), “Effect of polycyclic aromatic hydrocarbon and sediment on fluoranthen biodegradation patterns”, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol 17(7), pp 1246-1251 33 Jander H., Tanke D., Bohm H., “The growth of Polycyclic aromatic hydrocarbons in Benzene pyrolysis and Benzen/Oxygen Mixtures at High Pressures and Temperatures” 34 Jang Yun, Yang Xianglong, Liu Bin, Zhoa Huabing, Cheng Qiuxiang and Cai Baoli (2004), “Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas sp Stain ND6: Gene sequence and Enzyme characterization”, Biosci Biocechnol Biochem, 68 (8), pp 1798 – 1800 35 Jesus G.M Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V., (1999), “Use of 16S23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity”, Journal Microbiol Methods, vol 36, pp 55-64 36 Johnsen AR, Wick LY, Harms H (2005), “Principles of microbial PAH degradation in soil”, Environ Poll 133, 71-84 37 Josep Guarro, * Josepa Gene, and Alberto M Stchigel (1999), “Developments in Fungal Taxonomy” Unitat de Microbiologia, Departament de Cie`ncies Me`diques Ba`siques, Facultat de Medicina Footer Page of 166 Số hóa74 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận75 vănof tốt166 nghiệp Header Page 68 Khoa Sinh - KTNN iCie`ncies de la Salut, Universitat Rovira i Virgili, 43201 Reus, Spain, 12 (3).pp 454-500 38 Juhasz A L., Naidu R (2000), “Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromtic hydrocacbons: a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene”, International Biodeterioration Biodegradation, 45, pp 57-88 39 Kanaly R A., Harayama S (2000), “Biodegradation of high- molecularweight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria”, Jounal of Biotechnology, vol 182 ,pp 2059-2067 40 Laha, S and Luthy, R.G., (1992), "Effects of Nonionic Surfactants on the Solubilization and Mineralization of Phenanthrene in Soil-Water Systems", Biotechnol Bioeng., 40, pp, 1367-1380 41 Leen Bastiaens,1,2 Dirk Springael,1,* Pierre Wattiau,3 Hauke Harms,4 Rupert deWachter,5 Hubert Verachtert,2 and Ludo Diels (2000), “Isolation of Adherent Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH)Degrading Bacteria Using PAH-Sorbing Carriers” Applied and Environmental Microbiology, Vol 66, No 5, pp 1834-1843 42 Matthias Kastner, Maren Breuer- Jam mali and Bernd Mahro (1998), “Impact of Innoculation Protocols, Salinity anh pH on the Degradation of Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) and survival of PAH – degrading Bacteria Introduced into Soil”, Appl Enviro Microbial, vol 64(1), pp 359 - 362 43 Meckenstock Rainer U., Safinowski Michael, Griebler Christian (2004), “Anaerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons“, Microbiology Ecology, 49, pp 27-36 44 Mesarch M B., C H Nakatsu, L Nies (2000), “Development of catechol 2,3-dioxygenase-specific primers for monitoring bioremediation by Footer Page of 166 Số hóa75 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 69 Luận76 vănof tốt166 nghiệp Header Page competitive quantitative Khoa Sinh - KTNN PCR” Applied and Environmental Microbiology, 66, pp 678-683 45 Meyer S., Moser R., Neef A., Stahl U., Kampfer P (1999), “Differential detection of key enzymes of polyaromatic hydrocarbon- degrading bacteria using PCR and gene probes”, Microbiol, 145, pp 1731- 1741 46 Okuta A., Ohnishi K., Harayama S., (1998), “PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase fragments from environments samples and their assembly into funtional genes”, Gene, 212, pp 221-228 47 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular clonning A laboratory manual, 3rd ed Cold spring harbor laboratory press, Cold spring habor, NewYork 48 Sims, R.C., Overcash, M.R., (1983), “Fate of polynuclear aromaticcompounds (PNAs) in soil - plant systems” Residue Reviews 88, pp 1-68 49 Sinkkonen S., Paasivirta J (2000), “Degradation half-life times of PCDDs, PCDFs and PCBs for environmental fate modeling”, Chemosphere 40, pp 943-949 50 Sudip K Samanta, Om V Singh and Rakesh K Jain (2002), “Polycyclic aromatic hydrocarbons: environmental pollution and bioremediation” TRENDS in Biotechnology (20) 6, pp 243-247 51 Sutherland J B., F Rafii, A A Khan, C E Cerniglia (1995), Mechanics of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation In (Microbial transformation and degradation of toxic organic chemicals), Lily Y Young & Carl E Cerniglia (eds.) Willey-Liss, New York 52 S.Y Yuan a, S.H Wei b, B.V Chang b,* (1999), ”Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a mixed culture “ A National Institute of Environmental Analysis, Environmental Protection Footer Page of 166 Số hóa76 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 70 Luận77 vănof tốt166 nghiệp Header Page Khoa Sinh - KTNN Administration, Chungli, Taiwan, ROC Department of Microbiology, Soochow University, Taipei, Taiwan, ROC Received 18 August ; accepted 28 October 1999 53 Weissenfels WD, Beyer M, Klein J (1991), “Degradation of phenanthrene, fluorene and fluoranthene by our bacteria cultures”, Appl Microbial Biotechnol 32, pp 479-484 54 Wilson, S.C., Jones, K.C., (1993), “Bioremediation of soils contami-nated with polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs): a review”, Environmental Pollution 88, pp 229-249 55 Wislocki, P G and A Y H Lu (1988), “Carcinogenicity and mutagenicity of proximate and ultimate carcinogens of polycyclic aromatic hydrocarbons”, Polycyclic aromatic hydrocarbon carcinogenesis: structure-activity relationships, vol.1, pp 1-30 56 Wikstrom P (1996), “DNA recovery and PCR quatification of catechol 2,3-dioxygenase genes from diffirenr soil types”, Journal of Biotechnology, 52, pp 107-120 57 Xue-Jing Zheng , Jean-Francois Blais , Guy Mercier , Mario Bergeron , Patrick Drogui (2007), “PAH removal from spiked municipal wastewater sewage sludge using biological, chemical and electrochemical treatments”, Chemosphere, Mar 2; : 17337031 Bioinfobank Library 58 Yuan S Y., Wei S H., Chang B V (2000), “Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by mixed culture”, Chemosphere 41, pp 14631468 59 Yuan S.Y., Chang J S., Yen J H., Chang Bea-Ven (2002), “Biodegradation of phenanthren in river sediments”, Chemosphere, Vol 43, pp 273-278 Footer Page of 166 Số hóa77 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận78 vănof tốt166 nghiệp Header Page 71 Khoa Sinh - KTNN 60 Yuan S.Y., Chang S W., Chang B V (2003), “Biodegradation of Polyclic Aromatic Hydrocacbon in sludge”, Bull Environ Contaim Toxical., Vol 71, pp 625-632 61 Zaidi R., Baquar and Imam H S (1999), “Factors affecting microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon phenanthrene in the Caribbean coastal water”, Marine Pollution Bulletin, vol 38, pp 737 742 62 Zhongtang Yu and William W Mohn* (2001), “Bacterial Diversity and Community Structure in an Aerated Lagoon Revealed by Ribosomal Intergenic Spacer Analyses and 16S Ribosomal ADN Sequencing”, Applied and Environmental Microbiology, pp 1565-1574, Vol 67, No Footer Page of 166 Số hóa78 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ... thực tiễn trên, lựa chọn nghiên cứu thực đề tài Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu khả phân hủy sinh học hydrocarbon thơm vài chủng vi khuẩn phân lập từ nước ô nhiễm dầu Quảng Ninh Footer Page of... chất hydrocacbon thơm Nội dung nghiên cứu luận văn bao gồm: Phân lập tuyển chọn số loại vi khuẩn có khả phân hủy PAH Nghiên cứu, đánh giá khả phân hủy sinh học PAH số chủng vi khuẩn phân lập Nghiên