Tuyển chọn và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp protease của ba chủng bacillus phân lập từ mắm cá

Từ mẫu mắm cá đang lên men chúng tôi đã phân lập được 104 chủng vi khuẩn. Trong số đó có 51 chủng thể hiện hoạt tính protease khi nuôi trên môi trường MPA1 có bổ sung 1% gelatin. Ba chủng vi khuẩn (Tp91, Tp97, Tp98) có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease trên các môi trường chứa các nồng độ NaCl khác nhau từ 0 - 21% đã được lựa chọn để nghiên cứu.

JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE Natural Sci 2015, Vol 60, No 4, pp 106-113 This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn DOI: 10.18173/2354-1059.2015-00015 TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA BA CHỦNG Bacillus PHÂN LẬP TỪ MẮM CÁ Đoàn Văn Thược Vũ Thị Thu Hiền Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tóm tắt Từ mẫu mắm cá lên men phân lập 104 chủng vi khuẩn Trong số có 51 chủng thể hoạt tính protease ni mơi trường MPA1 có bổ sung 1% gelatin Ba chủng vi khuẩn (Tp91, Tp97, Tp98) có khả sinh trưởng sinh tổng hợp protease môi trường chứa nồng độ NaCl khác từ - 21% lựa chọn để nghiên cứu Bằng kĩ thuật di truyền phân tử định tên chủng vi khuẩn tuyển chọn Bacillus sp Tp91, Bacillus sp Tp97 Bacillus sp Tp98 Ba chủng sinh trưởng sinh tổng hợp protease tốt sau 24 h nuôi cấy 37 oC tốc độ 200 vịng/phút Hoạt tính protease cực đại chủng Bacillus sp Tp91, Bacillus sp Tp97 Bacillus sp Tp98 1045, 860 630 U/mL Ngoài khả sinh tổng hợp protease cao, ba chủng Bacillus cịn có khả ức chế số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp Vibrio parahaemolyticus, V furnissii, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis B a chủng Bacillus có tiêu chuẩn cần thiết để ứng dụng quy trình sản xuất nước mắm Từ khóa: Nước mắm, Bacillus, protease Mở đầu Ở Việt Nam, nước mắm sản phẩm truyền thống, sản xuất từ lâu đời Ngày nay, nước mắm không sản xuất để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng nước mà xuất sang nhiều nước giới Nước mắm sản xuất theo phương pháp lên men truyền thống thường nhiều thời gian nên lợi nhuận thấp khó đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày lớn thị trường [1, 2] Vì vậy, để tăng lợi nhuận cho người sản xuất đồng thời để đáp ứng nhu cầu sử dụng nước mắm ngày tăng cần có biện pháp rút ngắn thời gian sản xuất Q trình làm mắm rút ngắn cách điều chỉnh pH, nồng độ muối nhiệt độ trình lên men Sự điều chỉnh với mục đích tối ưu hố hoạt động protease vi khuẩn ruột cá sinh [3] Một cách khác để rút ngắn trình sản xuất nước mắm bổ sung protease vi khuẩn sinh tổng hợp protease để làm tăng tốc độ thủy phân protein [1, 2, 4, 5] Kết nghiên cứu gần Yongsawatdigul cộng cho thấy, bổ sung vi khuẩn sinh protease chịu mặn rút ngắn trình sản xuất nước mắm mà giữ chất lượng nước mắm [5] Ngày nhận bài: 13/4/2015 Ngày nhận đăng: 2/5/2015 Tác giả liên lạc: Đoàn Văn Thược, địa e-mail: doanvanthuoc@yahoo.com 106 Tuyển chọn nghiên cứu khả sinh tổng hợp protease ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá Trong nghiên cứu tiến hành phân lập vi khuẩn từ mắm cá lên men, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh protease mạnh nồng độ muối khác để định hướng ứng dụng trình làm mắm nhằm rút ngắn thời gian sản xuất Nội dung nghiên cứu 2.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu * Vật liệu nghiên cứu Các mẫu mắm cá lên men lấy từ làng sản xuất nước mắm Sa Châu thuộc xã Giao Châu, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định * Môi trường dinh dưỡng sử dụng nghiên cứu Môi trường phân lập vi khuẩn giữ giống vi khuẩn môi trường MPA cải tiến (viết tắt MPA1) Thành phần môi trường gồm: cao thịt, 5g; pepton, 5g; NaCl, 50g; agar, 20g; nước cất, 1000 mL; pH 7,0 * Phương pháp phân lập vi sinh vật Pha loãng 1g mắm cá vào nước vơ trùng có chứa 5% NaCl để đạt đến độ pha loãng x 10-3, x 10-4, x 10-5, x 10-6 Hút 100µl dịch nồng độ pha lỗng nhỏ vào đĩa môi trường dùng để phân lập, dùng que trang gạt Sau 48 h ủ 37 oC dùng tăm cấy chuyển khuẩn lạc vào môi trường giữ giống để sử dụng cho nghiên cứu * Phương pháp lên men vi sinh vật Cấy chủng vi khuẩn hoạt hóa vào bình tam giác 100 mL có chứa 25 mL mơi trường lỏng, ni 37 oC với tốc độ lắc 200 vịng/phút 24 (giống cấp 1) Hút bổ sung 2.5% giống cấp vào bình tam giác 100 mL chứa 25 mL mơi trường thí nghiệm dạng lỏng Tiến hành nuôi lắc điều kiện 37 o C với tốc độ lắc 200 vòng/phút Dịch lên men thu lại thời điểm khác để xác định hoạt tính enzyme mật độ tế bào * Phương pháp tách chiết DNA tổng số giải trình tự gen 16S rRNA Nuôi cấy chủng tuyển trọn môi trường MPA1 lỏng 37 oC 13 h Tách DNA tổng số kit ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM (Mỹ) Khuếch đại trình tự gen 16S rRNA phản ứng PCR sử dụng cặp mồi gồm: - Mồi xuôi: 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) - Mồi ngược 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) Chu trình nhiệt cho phản ứng: biến tính 95 oC phút; lặp lại 30 chu kì (95 oC 30 giây, 55 oC 30 giây 72 oC 1.5 phút); 72 oC 10 phút oC cho để bảo quản Sản phẩm PCR sau gửi sang cơng ty Bioneer (Hàn Quốc) để giải trình tự Trình tự nucleotide thu so sánh với trình nucleotide có ngân hàng gen để định tên chủng vi khuẩn * Phương pháp thử khả đối kháng vi sinh vật Khả đối kháng ba chủng tuyển chọn với vi sinh vật kiểm định (Vibrio sp., Escherichia coli hay Salmonella sp.) thu nhận từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương xác định theo phương pháp đột thạch nhỏ dịch [6] * Phương pháp xác định hoạt tính Hoạt tính protease xác định sơ phương pháp cấy chấm điểm kiểm tra vòng phân giải dung dịch (NH4 )2SO4 bão hịa [6] Hoạt tính enzyme xác định phương pháp định lượng theo Nguyễn Văn Mùi (2007) [7] 107 Đoàn Văn Thược Vũ Thị Thu Hiền 2.2 Kết thảo luận 2.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp protease ngoại bào Từ mẫu mắm lên men lấy từ xã Giao Châu, huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định, tiến hành pha loãng phân lập chủng vi khuẩn môi trường MPA1 Sau 48 h ủ 37 oC thu 104 khuẩn lạc vi khuẩn kí hiệu Tp1 - Tp104 Những khuẩn lạc cấy tách sang môi trường MPA1 sau thử nghiệm khả sinh protease ngoại bào phương pháp cấy chấm điểm mơi trường MPA1 có bổ sung 1% gelatin Kết cho thấy có 51 chủng (49%) có khả sinh protease ngoại bào có chủng có đường kính vịng phân giải gelatin lớn cm, 25 chủng có vịng phân giải từ 1,5 đến cm, 22 chủng có vịng phân giải nhỏ 1,5 cm Chúng tơi chọn 29 chủng có vịng phân giải gelatin lớn 1,5 cm để tiến hành nghiên cứu tuyển chọn lần hai 2.2.2 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến sinh trưởng sinh tổng hợp protease Một tiêu chí quan trọng lựa chọn chủng vi khuẩn để ứng dụng công nghiệp sản xuất nước mắm có khả sinh trưởng sinh tổng hợp protease điều kiện mặn cao [2, 3, 5] Vì chúng tơi cấy chấm điểm 29 chủng lựa chọn vào môi trường MPA1 có chứa 1% gelatin nồng độ NaCl khác (từ đến 21%) Kết nghiên cứu cho thấy tất chủng vi khuẩn nghiên cứu sinh trưởng sinh tổng hợp protease mạnh môi trường không bổ sung NaCl bổ sung NaCl nồng độ thấp, nồng độ NaCl môi trường tăng cao khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme giảm Trong số 29 chủng thử nghiệm có 16 chủng có vịng phân giải protein mơi trường có bổ sung NaCl từ 0% tới 21%; chủng có vịng phân giải mơi trường bổ sung NaCl từ 0% tới 18%; chủng có vịng phân giải mơi trường bổ sung NaCl từ 0% tới 15%; chủng cịn lại có vịng phân giải môi trường bổ sung NaCl từ 0% tới 12% Ba chủng vi khuẩn (ký hiệu Tp91, Tp97 Tp98) có khả sinh tổng hợp protease mạnh nồng độ muối khác lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu (Hình Bảng 1) Hình Vịng phân giải gelatin chủng vi khuẩn (Tp95, Tp96, Tp97, Tp98) nồng độ muối 18% 108 Tuyển chọn nghiên cứu khả sinh tổng hợp protease ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá Tên chủng Tp91 Tp97 Tp98 Bảng Khả sinh trưởng sinh tổng hợp protease ba chủng vi khuẩn tuyển chọn mơi trường có nồng độ muối khác Đường Nồng độ NaCl kính 0% 3% 6% 9% 12% 15% 18% 21% (cm) d 1,25 0,4 0,4 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 D 3,45 2,7 2,45 2,0 1,3 0,6 0,55 0,6 d 1,9 0,45 0,48 0,4 0,1 0,1 0,1 0,1 D 3,55 2,65 2,45 2,05 1,4 1,1 1,15 0,95 d 1,35 0,4 0,4 0,4 0,1 0,1 0,1 0,1 D 3,45 3,2 3,15 2,9 1,75 1,7 1,35 1,4 (d) đường kính khuẩn lạc, (D) đường kính vịng phân giải 2.2.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào, định danh chủng tuyển chọn kĩ thuật di truyền phân tử Khuẩn lạc chủng tuyển chọn có màu trắng ngà, bề mặt trơn bóng nhăn khuẩn lạc Tế bào ba chủng có dạng trực khuẩn, gram dương, có bào tử tế bào, tế bào đứng rời hay đôi (Hình 2A, B, C) Hình Hình dạng tế bào chủng (A) Tp91, (B) Tp97 (C) Tp98 kính hiển vi quang học (100X) Sau tách chiết DNA tổng số chủng tuyển chọn chạy PCR thu đoạn gen có kích thước 1400 bp, đoạn gen gửi sang Hàn Quốc giải trình tự So sánh trình tự gen 16S rRNA ba chủng tuyển chọn (phụ lục) với trình tự gen ngân hàng gen giới chúng tơi nhận thấy: trình tự gen 16S rRNA chủng Tp91 chủng Tp97 giống 100% so với trình tự gen nhiều chủng Bacillus subtilis số chủng B tequilensis, trình tự gen 16S rRNA chủng Tp98 giống 100% so với trình tự gen nhiều chủng B subtilis giống 99% so với chủng B tequilensis Dựa vào kết đặt tên cho chủng tuyển chọn Bacillus sp Tp91, Bacillus sp Tp97 Bacillus sp Tp98 Nhiều nghiên cứu trước nhận thấy Bacillus sp nhóm chịu ưa mặn phổ biến sản phẩm lên men từ thủy sản đặc biệt giai đoạn đầu q trình lên men [3, 5] Bacillus đóng vai trị quan trọng q trình lên men truyền thống có khả phát triển dải pH rộng, sản xuất nhiều enzyme ngoại bào quan trọng Rất nhiều lồi Bacillus có khả sinh nhiều loại kháng sinh subtilin, eumycin, bacilin, bacillomin nên có khả chống lại nhiều loại vi khuẩn có hại [8] 109 Đoàn Văn Thược Vũ Thị Thu Hiền 2.2.4 Sự sinh trưởng sinh tổng hợp protease thời điểm lấy mẫu khác Hình Mật độ tế bào hoạt tính protease chủng (A) Bacillus sp Tp91, (B) Bacillus sp Tp97 (C) Bacillus sp Tp98 thời gian nuôi cấy khác 110 Tuyển chọn nghiên cứu khả sinh tổng hợp protease ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá Chúng tiến hành lên men ba chủng Bacillus môi trường MPA1 lỏng 37oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút Lấy mẫu thời điểm khác nhằm xác định ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng sinh tổng hợp protease chủng nghiên cứu Kết cho thấy ba chủng nghiên cứu mật độ tế bào đạt cực đại sau 24 h ni cấy, sau mật độ tế bào vi sinh vật giảm dần theo thời gian ni cấy (Hình 3A, 3B, 3C) Tương ứng với sinh trưởng vi sinh vật, hoạt tính emzyme tăng theo thời gian nuôi cấy đạt giá trị cực đại sau 24 h ni cấy Hoạt tính protease cực đại ba chủng Bacillus sp Tp91, Bacillus sp Tp97 Bacillus sp Tp98 1045, 860 630 U/mL Sau 24h hoạt tính enzyme giảm mật độ tế bào giảm, lại tăng lên 36h Hoạt tính enzyme tăng lúc 36 h tế bào chết bị ly giải, protease nội bào giải phóng mơi trường Kết nghiên cứu tương tự kết nghiên cứu trước Sehar Hameed (2011) chủng vi khuẩn Bacillus sp HS-4 phân lập từ vùng đất mặn Các kết nghiên cứu thời điểm mật độ tế bào Bacillus sp HS-4 đạt giá trị cực đại thời điểm hoạt tính protease đạt cực đại [9] Tuy nhiên hoạt tính protease ba chủng Bacillus phân lập nghiên cứu cao nhiều so với hoạt tính protease chủng Bacillus sp HS-4 (295 U/mL) 2.2.5 Khả đối kháng chủng tuyển chọn với số vi sinh vật có hại thường gặp Hầu hết vi khuẩn có hại bị ức chế nồng độ muối cao trình làm mắm Tuy nhiên nồng độ muối cao mắm làm tăng thời gian sản xuất làm giảm giá trị cảm quan nước mắm, muốn rút ngắn thời gian sản xuất tăng giá trị cảm quan nước mắm cần giảm nồng độ muối trình sản xuất Tuy nhiên giảm nồng độ muối vi sinh vật gây hại có điều kiện phát triển chất lượng mắm bị giảm [3] Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp protease mạnh lại đối kháng với số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa phổ biến Vibrio sp., Escherichia coli hay Salmonella sp mang lại nhiều ý nghĩa cho ngành công nghiệp sản xuất nước mắm Các chủng sử dụng làm giống khởi đầu cho trình làm mắm sinh tổng hợp protease để thủy phân protein cá, đồng thời kháng lại phát triển số vi sinh vật có hại Do giảm nồng độ muối rút ngắn thời gian làm mắm tạo mắm phù hợp với nhu cầu người tiêu dùng Vì lí khảo sát khả đối kháng chủng nghiên cứu số chủng vi sinh vật có hại thường gặp, kết thể Bảng minh họa Hình Chủng Bảng Khả đối kháng chủng tuyển chọn với số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa thường gặp Các chủng vi sinh vật kiểm định V parahaemolyticus V furnissii V cholerae E coli Sal choleraesuis Tp91 + + - + + Tp97 + + - + + Tp98 + + - + + Ghi chú: + đối kháng, - không đối kháng 111 Đoàn Văn Thược Vũ Thị Thu Hiền Kết cho thấy ba chủng tuyển chọn có khả ức chế V parahaemolyticus, V furnissii, E coli, Sal choleraesuis, nhiên ba chủng khơng có khả ức chế V cholerae Hình Vịng vơ khuẩn thể khả ức chế chủng tuyển chọn (A) E coli (B) V parahaemolyticus Kết luận Trong nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng sinh tổng hợp protease nồng độ NaCl khác từ đến 21% Ba chủng thuộc chi Bacillus đặt tên là: Bacillus sp Tp91, Bacillus sp Tp97 Bacillus sp Tp98 Ngoài khả sinh tổng hợp protease cao, ba chủng Bacillus cịn có khả ức chế sinh trưởng số vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa điển V parahaemolyticus, V furnissii, E coli Sal choleraesuis Với khả sinh trưởng sinh tổng hợp protease cao nhiều nồng độ NaCl khác nhau, đồng thời lại có khả ức chế số loại vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa, ba chủng tuyển chọn có tiềm ứng dụng quy trình sản xuất nước mắm TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] 112 Vũ Ngọc Bội, 2004 Nghiên cứu trình thủy phân cá enzyme protease từ B subtilis S5 Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Lâm, Nguyễn Phương Nhuệ, Trịnh Thị Ngọc, 2011 Phân lập nghiên cứu vi khuẩn ưa muối ưa kiềm sinh protease bước đầu thử nghiệm để sản xuất nước mắm ngắn ngày Tạp chí Khoa học Phát triển 9(3) 452 – 463 B J B.Wood, 1998 Fermented fish and fish products (Microbiology of fermented foods) Blackie academic & professional pp 416-434 N G Sanceda, T Kurata and N Hamano, 1996 Accelerated fermentation process of manufacture of fish sauce using histidine J Food Sci 61(1): 220-222 J Yongsawatdigul, S Rodtong, and N Raksakulthai, 2007 Acceleration of Thai fish sauce fermentation using proteinases and bacterial starter cultures J Food Sci 72(9): 382-390 Tuyển chọn nghiên cứu khả sinh tổng hợp protease ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá [6] [7] [8] [9] Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào, 2011 Thực hành Vi sinh vật học Nxb Đại học Sư phạm Hà Nội tr 95-105 Nguyễn Văn Mùi, 2007 Thực hánh Hóa sinh học Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội tr 74-76 M Schallmey, A Singh and O P Ward, 2004 Developments in the use of Bacillus species for industrial production Can J Microbiol 50(1): 1-17 S Sehar and A Hameed, 2011 Extracellular alkaline protease by a newly isolated halophilic Bacillus sp Global J Biotech Biochem 6(3): 142-148 ABSTRACT Isolation and characterization of three protease producing Bacillus strains from fermented fish One hundred and four bacterial strains were isolated from fermented fish Of these, 51 strains were found to produce extracellular protease Three bacterial strains named Tp91, Tp97 and Tp98 were able to grow and synthesize protease with high activity on mediums containing NaCl concentrations that ranged from to 21percent By using molecular genetic analysis, three bacterial strains were identified as Bacillus sp Tp91, Bacillus sp Tp97 and Bacillus sp Tp98 Optimum biomass and proteolytic activity of the three Bacillus strains were achieved after 24 h of cultivation at 37oC and 200 rpm agitation Maximum proteolytic activity of the three Bacillus strains were 1045 (Bacillus sp Tp91), 860 (Bacillus sp Tp97) and 630 U/mL (Bacillus sp Tp98) Three Bacillus strains showed inhibitory activity against common gastroenteric bacteria such as Vibrio parahaemolyticus, V furnissii, Escherichia coli and Salmonella choleraesuis Three Bacillus strains can be used in fish sauce production Key words: Fish sauce, Bacillus, peotease 113 .. .Tuyển chọn nghiên cứu khả sinh tổng hợp protease ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá Trong nghiên cứu tiến hành phân lập vi khuẩn từ mắm cá lên men, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh protease. .. 108 Tuyển chọn nghiên cứu khả sinh tổng hợp protease ba chủng Bacillus phân lập từ mắm cá Tên chủng Tp91 Tp97 Tp98 Bảng Khả sinh trưởng sinh tổng hợp protease ba chủng vi khuẩn tuyển chọn môi... luận Trong nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng sinh tổng hợp protease nồng độ NaCl khác từ đến 21% Ba chủng thuộc chi Bacillus đặt tên là: Bacillus sp Tp91, Bacillus