Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men

1 MỤC LỤC 2.1.1 Phân loại vi khuẩn lactic 2.1.1.1 Theo Orla-Jensen (1919) [2] 2.1.1.2 Phân loại theo hình dạng tế bào [2] 2.1.1.3 Phân loại theo cách thức lên men [9] 2.1.1.4 Phân loại dựa vào nhiệt độ 2.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic 2.1.1.1 Đặc điểm sinh lý 2.1.3.1 Ảnh hưởng nồng độ đường .11 2.1.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 11 2.1.4 Một số ứng dụng vi khuẩn lactic .12 2.1.4.1 Trong công nghệ thực phẩm 12 2.1.4.2 Trong công nghiệp 12 2.1.4.3 Trong nông nghiệp môi trường 13 2.1.4.4 Trong y học 13 2.1.4.5 Trong mỹ phẩm .13 2.1.4.6 Trong chăn nuôi thú y 13 PHẦN 27 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 27 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .27 3.3 Hóa chất thiết bị sử dụng 27 3.3.1 Hóa chất 27 Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu .27 3.3.2 Thiết bị sử dụng 28 Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 28 3.6 Phương pháp sử lý số liệu 32 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin 34 4.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin 34 Hình 4.4 Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ NaCl tới sinh tổng hợp bacteriocin BL1 40 Kết bảng 4.5 biểu đồ 4.4 cho thấy NaCl ảnh hưởng tới khả sinh trưởng tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 Ở nồng độ 0,5%, vi khuẩn BL1 phát triển tốt OD610 = 1,8 nhiên khả ức chế vi khuẩn thị tốt kích thước vịng kháng khuẩn đạt – 16 mm , nồng độ 1% phát triển tốt OD610 = 1,5 khả ức chế vi khuẩn thị lại cao kích thước vịng kháng khuẩn đạt – 18 mm Khả kháng khuẩn sinh trưởng chủng BL1 giảm mạnh không bổ sung NaCl vào mơi trường, cịn tăng nồng độ NaCl lên 1,5% sinh tổng hợp bacteriocin sinh trưởng giảm OD610 = 0,9 kích thước vịng kháng khuẩn – 18 mm 40 Vì nồng độ NaCl thích hợp cho sinh tổng hợp bacteriocin 1% 40 PHẦN 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu .Error: Reference source not found Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng thí nghiệm .Error: Reference source not found Bảng 4.1 Hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn Lactic 29 Bảng 4.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 30 Bảng 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 .31 Bảng 4.4 Ảnh hưởng pH đến sinh tổng hợp bacteriocin .32 Bảng 4.5 Ảnh hưởng NaCl tới khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 .34 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc Nisin Z Error: Reference source not found Hình 2.2: Cấu trúc Sakacin P Error: Reference source not found Hình 3.1: Phương pháp cấy khảo sát khả kháng vi khuẩn thị Error: Reference source not found Hình 4.1 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới khả sinh bacteriocin vi khuẩn BL1 .30 Hình 4.2 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 .31 Hình 4.3 Biểu đồ ảnh hưởng pH tới khả sinh bacteriocin vi khuẩn BL1 33 Hình 4.4 Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ NaCl tới sinh tổng hợp bacteriocin BL1 34 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong sống ngày vi khuẩn lactic sử dụng nhiều thực phẩm lên men ngày dưa muối, cà muối, lên men rượu, sữa chua, nem chua, mai, bia [3] Nó có vai trị quan trọng đời sống tăng cường miễn dịch, ức chế vi sinh vật có hại, bổ sung vi sinh vật có lợi, tác dụng kháng khuẩn Và gần có nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp bacteriocin Bacteriocin chất kháng khuẩn có chất protein tổng hợp riboxom từ chuỗi peptit protein vi khuẩn Gram âm vi khuẩn Gram dương [20] Nó có khả tiêu diệt vi khuẩn tạo thành kênh làm thay đổi tính thấm màng tế bào, nhiều loại bacteriocin cịn có khả phân giải DNA, RNA công vào peptidoglycan làm suy yếu thành tế bào vi khuẩn gây hại [29] Vì bacteriocin có nhiều ứng dụng, mỹ phẩm, xử lí mơi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi, y học công nghệ thực phẩm [22] Trong y dược, bacteriocin ứng dụng chế phẩm sinh học để điều trị số bệnh viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hố cịn sử dụng điều trị kháng sinh đồ[30] Trong ngành mỹ phẩm, bacteriocin sử dụng thành phần số loại mỹ phẩm chăm sóc da có tính diệt khuẩn giữ ẩm.Trong công nghệ thực phẩm, bacteriocin nghiên cứu ứng dụng rộng rãi chế biến bảo quản số loại thực phẩm phomat, xúc xích, sữa chua, số loại sản phẩm thịt, rau đóng hộp [26] Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu sinh tổng hợp bacteriocin từ nem chua, sữa chua, dưa chua Trong “Nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men” 1.2 Mục đích đề tài Đánh giá khả kháng vi khuẩn thị vi khuẩn lactic phân lập từ đồ uống lên men Boza xác định ảnh hưởng điều kiện lên men đến tổng hợp bacteriocin vi khuẩn 1.3 Mục tiêu đề tài Khảo sát khả kháng vi khuẩn thị (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Bacillus cereus) vi khuẩn lactic phân lập từ Boza Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện lên men tới trình tổng hợp bacteriocin: thời gian lên men, pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Xác định khả kháng vi khuẩn độc hại ảnh hưởng điều kiện ni cấy tới khả hình thành bacteriocin vi khuẩn lactic từ Boza, làm sở để có nghiên cứu chủng loại bacteriocin ứng dụng thực tế Đề tài giúp sinh viên có thêm kinh nghiệm, kiến thức bổ ích tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu công tác sau 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Là sở để nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn phân lập sản xuất bacteriocin ứng dụng lĩnh vực bảo quản thực phẩm Khẳng định vai trị có lợi đồ uống lên men Boza người PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, khơng sinh bào tử, hình que hình cầu, có khả lên men đường thành acid lactic Khuẩn lạc vi khẩn lactic trịn nhỏ, bóng, màu trắng đục màu vàng kem đơi khuẩn lạc có kính thước to, trịn lồi trắng đục Đặc biệt khuẩn lạc tỏa mùi chua acid Nhóm vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacteriacae thuộc Eubacteriales [2] Chúng trao đổi chất phần lớn sản phẩm cuối trình lên men cacbonhydrat axit lactic [1] Theo Nguyễn Thành Đạt (2007) tất vi sinh vật lactic có đặc điểm sau: Đó vi khuẩn Gram dương, khơng di động, khơng sinh bào tử, có hoạt tính catalaza, oxydaza, nitratoreductaza âm tính Tổng hợp nhiều hợp chất cần thiết cho sống yếu, chúng vi sinh vật đa khuyết dưỡng nhiều axit amin, nhiều bazơ nucleic, nhiều vitamin… Khơng có khả tổng hợp nhân hem porphyrine, bình thường chúng khơng có cytochrome Chúng vi khuẩn kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, loại có khả lên men hiếu khí lên men kị khí Có khả chống chịu tốt mơi trường acid Vi khuẩn lactic phân bố tương đối rộng tự nhiên, đặc biệt sản phẩm lên men Vi khuẩn lactic tồn đất, nước, bề mặt thực vật, sản phẩm lên men (sữa chua, format,…), sản phẩm rau muối chua, đường tiêu hóa người động vật, sản phẩm thịt [2,8] 2.1.1 Phân loại vi khuẩn lactic Nhóm vi khuẩn lactic đa dạng gồm nhiều giống khác Để phân loại người ta dựa vào nhiều tiêu chí khác nhau, vào đặc điểm hình thái, phương thức lên men, khả phát triển nhiệt độ khác nhau, khả chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm 2.1.1.1 Theo Orla-Jensen (1919) [2] Chia làm lồi chính: Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus Streptococcus Ngày người ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic vi khuẩn Bifidobacterium (Kandler Welss, 1986) 2.1.1.2 Phân loại theo hình dạng tế bào [2] Hình que: Lactobacillus, Carnobacterium Hình cầu: Streptococcus, Leuconotoc, Pedicoccus Ngoại lệ: Weissella (có hình cầu que), Bifidobacterium Phân chia vng góc mặt phẳng tạo hình tứ cầu (Aerococcus, Tetragenococcus, Pediococcus) Hình dạng xếp tế bào thay đổi tùy thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, có mặt oxy 2.1.1.3 Phân loại theo cách thức lên men [9] Lên men đồng hình (homofermentative): Khi lượng axit lactic tạo chủ yếu 85 – 90% Vi khuẩn lên men lactic đồng hình có enzyme aldolaza khơng có enzyme phosphoketolaza Nhóm vi khuẩn gồm cầu khuẩn Streptococcus lactic Streptococcus cremoris, trực khuẩn Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium helveticum, Lactobacterium bulgaricus Lên men dị hình (heterofermentative): Khi lượng axit lactic lên men chiếm tỉ lệ thấp khoảng 50%, axit hữu khác axit acetic, axit formic… CO2 Nhóm vi khuẩn lactic khơng có enzyme aldolaza lại có enzyme phosphoketolaza Ví dụ: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, số Lactobacillus 2.1.1.4 Phân loại dựa vào nhiệt độ Chia làm loại [10,11]: Ưa lạnh: – 27oC Ưa ấm: – 45oC Ưa nhiệt: 20 – 60oC Ngoài cịn phân loại vi khuẩn lactic theo số đặc điểm sau [5]: Khả chịu muối Khả sinh tổng hợp đồng phân khác axit lactic Phân loại dựa vào tỷ lệ phần trăm bazơ Guamin (G) + Cytosin (C) (%GC) Các lồi thuộc giống Streptococcus có tỷ lệ %GC 34-46%, Leuconostoc 36-43%, Pediococuss 34-43%… [2] 2.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic 2.1.1.1 Đặc điểm sinh lý Vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc Eubacteriales Chúng khơng đồng mặt hình thái sinh lý tương đối đồng Đều vi khuẩn Gram dương (+), không tạo bào tử, hầu hết không di động, thu nhận lượng nhờ phân giải hydratcacbon sinh axit lactic Axit lactic sinh dạng D (-), L (+) DL [1,7] Tất vi khuẩn lactic lên men bắt buộc, không chứa enzyme catalaza, cytochrome, hô hấp tùy tiện Vi khuẩn lactic địi hỏi nhu cầu cao mơi trường dinh dưỡng, ngồi đường, muối khống, nitơ, đa số chúng cần hàng loạt loại vitamin 10 (thiamin, biototin, axit folic, lactoflavin, axit pentotenic, axit nicotinic…) axit amin Hình dạng kích thước tế bào vi khuẩn lactic thay đổi tùy lồi, hình thái cịn phụ thuộc vào điều kiện môi trường, thời gian lên men, có mặt oxi tác nhân khác 2.1.1.2 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn lactic Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Cacbon thành tố xây dựng nên thể sinh vật Vì chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu q trình dinh dưỡng tế bào vi sinh vật Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều loại hydratcacbon khác nhau, chúng dễ dàng lên men loại đường đơn (monosaccharide) glucose, fructose, mantose, galactose Với loại đường đôi (disaccharide) saccharose, mantose… đồng hóa cách chọn lọc Đối với loại polysaccharide dextrin, tinh bột… số lồi có khả đồng hóa Các lồi vi khuẩn lactic khác đỏi hỏi nguồn cacbon khác Sự phát triển vi khuẩn lactic với loại đường khác tạo tế bào có đặc điểm hình thái sinh lý khác nhau, có khả chống chịu khác trước áp lực trình xử lý sau Chẳng hạn khả sống sót L burgaticus sau sấy đông khô cao sử dụng đường fructose lactose so với mannose L.delbruceckii sử dụng đường glucose, galactose, mantose, saccharose không sử dụng lactose, rafinose [4,7] Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Nitơ nguyên tố cần thiết cho sống sinh vật Những vật chất tế bào protein, axit nucleic… chứa nitơ nitơ đóng vai trị quan trọng sinh trưởng phát triển vi khuẩn Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng nitơ phức tạp Phần lớn vi khuẩn lactic 33 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn thị chủng lactic từ Boza Kết khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus Salmonella thể bảng 4.1 Bảng 4.1 Hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn Lactic Chủng thị Chủng khảo sát BL1 BL2 BL3 BL4 BL5 E coli B cereus S aureus ++ ++ ++ + + +++ + + + + + + - Salmonell a ++ ++ + + - Ghi chú: Không đối kháng (-): 0mm; Đối kháng yếu (+): >0 -