Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt làtrong công nghiệp thực phẩm và một số ngành chế biến khác vì chúng cókhả năng sinh axit, tạo hương và kháng một số vi

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bacteriocin là một loại protein được tổng hợp bởi vi khuẩn Nó có khảnăng ức chế sự phát triển của những loại vi khuẩn có cấu trúc tương tự.Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 Ông thực hiện côngtrình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này tácđộng mạnh đến sự phát triển của chất kháng sinh và chất kháng khuẩn đượcsinh ra từ vi khuẩn [45]

Bacteriocin đa dạng về cấu trúc, chức năng, sinh thái Bacteriocin cókhả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổitính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giảiADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Vìvậy bacteriocin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm, xử lý môitrường, chế biến thức ăn chăn nuôi [16]

Vi khuẩn lactic hiện nay được quan tâm nhiều do chúng có khả năngsinh tổng hợp nên bacteriocin Vì thế việc nghiên cứu về vi khuẩn lactic vàbacteriocin là một vấn đề hết sức thiết thực và có ý nghĩa to lớn trong cuộcsống con người[40]

Vi khuẩn lactic được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt làtrong công nghiệp thực phẩm và một số ngành chế biến khác vì chúng cókhả năng sinh axit, tạo hương và kháng một số vi khuẩn nhờ khả năng sinhtổng hợp bacteriocin[3]

Trong công nghiệp thực phẩm, việc nghiên cứu tuyển chọn cũng nhưtạo ra những chủng vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp bacteriocin cao để

sử dụng trong quá trình lên men lactic không chỉ nhằm mục đích bảo quản

mà còn nhằm đưa ra thị trường các loại sản phẩm có tính chất và hương vịmong muốn[41] Các hướng ứng dụng của bacteriocin chủ yếu gồm:

- Bảo quản thực phẩm

- Bảo quản các sản phẩm sữa

- Bổ sung vào thức ăn gia súc

- Muối chua rau quả

Bên cạnh đó vi khuẩn lactic còn được sử dụng để sản xuất chế phẩmProbiotic - là sản phẩm chứa một hay nhiều loại vi sinh vật sống có lợi cho

hệ tiêu hoá Chúng có khả năng cải thiện hệ thống vi sinh trong đường ruột,tác dụng tốt đến sức khoẻ con người hay động vật Các chủng vi khuẩn được

sử dụng tạo chế phẩm như Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei [47].

Trong ngành mỹ phẩm bacteriocin được sử dụng trong thành phần củamột số loại mỹ phẩm chăm sóc da vì có tính diệt khuẩn và giữ ẩm[17]

Những năm gần đây những nghiên cứu trên thế giới đã xác định đượcbản chất của bacteriocin đồng thời xác định được một số loại bacteriocin do

vi khuẩn lactic sinh ra và khả năng ứng dụng của nó Những công trình này đã

có những đóng góp tích cực , nâng cao chất lượng cuộc sống con người

Đã có những nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm dến việc sửdụng bacteriocin do vi khuẩn lactic tổng hợp để bảo quản thực phẩm, thay thếcác loại hoá chất bảo quản độc hại đồng thời tạo ra các sản phẩm có chấtlượng cao Tuy nhiên để có thể thu nhận bacteriocin, cần thiết phải chọn lựanhững củng vi khuẩn có khả năng tổng hợp cao tiến tới có thể tạo dựng bằng

kỹ thuật sinh học những chủng mới thích hợp phục vụ cho sản xuất côngnghiệp

Từ những vấn đề cấp thiết trên việc nghiên cứu khả năng sinh tổng hợpbacteriocin (chất kháng khuẩn) của một số chủng vi khuẩn lactic là một trong

những vấn đề quan trọng trong việc nghiên cứu về vi khuẩn lactic Chính vì

vậy, tôi mạnh dạn chọn đề tài: ‘Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic’ Vi khuẩn lactic có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như dưa chua, nem chua, sữa chua trong đó tôi chọn nem chua làm nguồn để phân lập vi khuẩn lactic cho việc nghiên cứu

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

- Phân lập được vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

- Xác định tính chất đối kháng của bacteriocin với một số loại vi sinhvật gây bệnh

-Xác định được điều kiện nuôi cấy tốt nhất để vi khuẩn lactic sinh tổnghợp bacteriocin cao

- Bước đầu tìm hiểu về bản chất của bacteriocin

4 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Đẩy mạnh hướng nghiên cứu ứng dụng bacteriocin trong việc sảnxuất các chất bảo quản dùng cho thực phẩm

5 CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN

Luận văn bao gồm các chương mục sau:

Mục lụcDanh mục các chữ viết tắtDanh mục các bảng và hình vẽ

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứuChương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

Chương 1 TỔNG QUAN1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC

1.1.1.Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Hầu hết các vi sinh vật sinh axit lactic đều thuộc về họ

Lactobacillaceae và được xếp vào bốn chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc

Vi khuẩn lactic có thể lên men dễ dàng các loại đường đơn nhưglucose, galactose, mannose và đường kép như saccharose, maltose,lactose được đồng hóa một cách chọn lọc hơn Còn polysacarit (dextrin, tinhbột, inulin ) thì chỉ được lên men lactic bởi một vài loài vi khuẩn [4]

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Đểsinh trưởng bình thường, ngoài nguồn cacbon chúng cần nitơ, axit amin, một

số vitamin, các chất sinh trưởng và các chất khoáng Trong quá trình lên men,axit lactic tự do được sinh ra sẽ kìm hãm quá trình sinh trưởng cho nên sự cómặt của một chất đệm là cần thiết để duy trì quá trình lên men [4]

Vi khuẩn lactic thường đòi hỏi đạm hữu cơ (protein, peptit, axit amin).Chỉ có một số ít loài có khả năng sinh trưởng trên môi trường có đạm vô cơ lànguồn đạm duy nhất Muốn phát triển bình thường vi khuẩn lactic thường đòi

hỏi một số chất sinh trưởng Có những loại vi khuẩn lactic (Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus casei, Lactobacillus arabinosus ) có tính mẫn

cảm cao đối với một loại chất sinh trưởng nào đó Người ta thường sử dụngchúng để tiến hành định lượng các chất sinh trưởng này

Về mặt hình thái vi khuẩn lactic có dạng lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầuhoặc thành chuỗi [4]

Streptococcus lactic là loại vi khuẩn có hình bầu dục thường đứng

thành đôi hay thành từng chuỗi ngắn Chúng phát triển thích hợp nhất ở

30-35oC Khi phát triển trong sữa chúng có thể làm tích lũy khoản 0.8-1.0% axitlactic tức là khoảng 110-120ot (1ot là lượng axit chứa trong 100ml sữa đượctrung hòa bởi 1ml NaOH 0.1N).

Streptococcus cremoris là loại cầu khuẩn xếp thành hình chuỗi, phát

triển tốt nhất ở 25-30oC, không có khả năng lên men maltose và dextrin, khả

năng tích lũy axit lactic tương tự như Streptococcus lactic, gram dương và

không sinh bào tử

Lactobacillus bulgariccus là loại trực khuẩn hình que dài, phát triển tốt

ở 40-48oC, có khả năng tích lũy đến 3-3.5% axit lactic, gram dương và khôngsinh bào tử

Lactobacillus acidophillus có hình dạng tương tự như Lactobacillus bulgariccus Chúng cũng phát triển tốt ở 40oC, không sinh bào tử

Vi khuẩn Lactobacillus delbruckii là loại trực khuẩn hình que ưa nhiệt,

chúng thích hợp phát triển ở 48-52oC và có khả năng tích lũy axit lactic, gramdương và không sinh bào tử

S citrovorus, S paracitrovorus, S diaxeli lactic và S thermophilus có

tế bào thường xếp thành hình chuỗi, gram dương và không sinh bào tử

L lactic, L thermophilus là những trực khuẩn không tạo bào tử, gram

dương không di động

L casei và L plantarium là những trực khuẩn xếp thành từng chuỗi,

gram dương và không sinh bào tử

1.1.2.Quá trình lên men lactic [5]

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axit lactic và cácsản phẩm khác được thực hiện nhờ vi khuẩn lactic Tùy thuộc vào các sảnphẩm tạo thành mà các quá trình lên men lactic được chia làm hai loại: lênmen đồng hình và lên men dị hình Trong quá trình lên men đồng hình, sản

phẩm chính là axit lactic Ngoài ra còn có một lượng nhỏ axit bay hơi, rượuethanol và các sản phẩm khác.

Quá trình lên men lactic đồng hình được biểu diễn như sau:

C6H12O6 CH3COCOOH CH3CHOHCOOH + Q

Glucose axit piruvic axit lactic

Ở quá trình lên men dị hình, axit lactic không phải là sản phẩm chủ yếu

mà còn có nhiều sản phẩm khác như axit acetic, ethanol, CO2, H2 cũng đượctạo thành với lượng đáng kể

Quá trình lên men lactic dị hình được biểu diễn như sau:

C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH +

Glucose axit lactic rượu etylic

COOHCH2CH2COOH + CH3COOH+ CO2 +H2

axit sucxinic axit acetic

Số lượng các sản phẩm phụ hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật,vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, thông thường axit lacticchiếm 40%, axit sucxinic chiếm khoảng 20%, rượu etylic chiếm khoảng10%, axit acetic chiếm khoảng 10% và các loại khí chiếm khoảng 20%

Trong số các loại vi khuẩn lên men lactic điển hình cần phải kể đến

các loài: Streptococcus lactic, Streptococcus cremoris, Lactobacillus bulgariccus, Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus delbruckii (thermobacterium cereale), Lactobacillus plantarum, Lactobacillus cucumeris fermentatic Còn thuộc loại vi khuẩn lên men lactic không điển hình có các loài trong giống Leuconostoc (Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextraniccus) và giống phụ beta bacterium

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic[4][8]

1.1.3.1 Nguồn cacbon

Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đường, còn các polisacarit thì thựcchất không thể lên men Tốc độ lên men các loại đường monosacharit,

disacharit và oligosacharit là khác nhau Nếu khi nhân giống người ta dùngmột loại đường thông thường thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại đường đó

và về sau chúng phát triển có hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này

mà không làm ảnh hưởng đến khả năng lên men đối với các nguồn cacbonkhác

1.1.3.2 Vitamin

Hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trongsinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Vitamin B6 một vitamin rấtquan trọng trong sự sinh tổng hợp các axit amin ở các vi khuẩn lactic cũng cóthể được thay thế bởi một số axit amin khác Tuy nhiên tuỳ thuộc vào từngloại vi khuẩn lactic, nhiều loại axit amin được coi là các axit amin không thaythế, tức là buộc phải có mặt trong môi trường Sự phụ thuộc của tốc độ sinhtrưởng của vi khuẩn lactic vào nồng độ các vitamin có thể được định lượngbởi các phép thử Vì vậy việc xác định loại vitamin cần thiết cho sự sinhtrưởng của từng loại vi khuẩn lactic khác nhau là rất quan trọng trong nghiêncứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và phát triểncủa vi khuẩn lactic

1.1.3.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tớisinh trưởng của vi khuẩn lactic Tuỳ thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men vàcho sinh trưởng, vi khuẩn lactic được chia làm 2 loại: loại ưa nhiệt và loại ưa

ấm Loại ưa nhiệt gồm có: L bulgaricus, L thermophilus, L delbrueckii phát

triển tốt ở 45-62oC Loại ưa ấm gồm có L causasicus, L lactis, L helveticus,

L acidophilus, L bifidus phát triển tốt ở 37-45oC L casei, L plantarum, L.leichmanii, L brevis, L buchneri, L pastorianus phát triển tốt ở 28-32oC

1.1.3.4 Muối khoáng

Photphat là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu.Các muối amôn không thể được dùng làm nguồn nitơ duy nhất song chúnggây một ảnh hưởng nhất định lên sự chuyển hoá một số axit amin Sự có mặtcủa một số loại muối khoáng không phải là bắt buộc và hàm lượng có sẵn củachúng trong các môi trường phức hợp đã là đầy đủ

1.2.TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN

1.2.1.Giới thiệu chung về Bacteriocin [34], [45]

Bacteriocin là một loại protein được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Nó cókhả năng ức chế sự phát triển của những loại vi khuẩn có cấu trúc tương tự.Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trìnhnghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúcđẩy sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩnsinh ra từ vi khuẩn Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin vì nó có khả

năng tiêu diệt E.coli.

Những năm gần đây, những nghiên cứu về bacteriocin chủ yếu tậptrung vào vi khuẩn gram âm, trong đó điển hình là colicins Tuy nhiên nhữngnghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram dương cũng

đã được tiến hành và đã có nhiều báo cáo đã cung cấp những thông tin về vấn

đề này

Những sản phẩm do vi khuẩn sinh ra có khả năng gây ức chế những vikhuẩn khác có rất nhiều như enzyme, antibiotic, bacteriocin Người ta đãđưa ra nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, những tiêu chí này được dùngtrong nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau để định nghĩanhững loại bacteriocin khác nhau Những tiêu chí như sau:

- Phạm vi ức chế đối với những loại khác

- Sự có mặt của loại protein hoạt động

- Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn

- Loại tế bào mà nó tác dụng

- Những yếu tố di truyền

- Do quá trình tổng hợp sinh học có tính ức chế

1.2.2 Tính đối kháng và phương pháp xác định tính đối kháng [34]

Tính đối kháng là khả năng ức chế sự phát triển của một vi sinh vật nào

đó Hiện nay người ta đã xác đinh được nhiều chất có khả năng ức chế sự pháttriển của vi sinh vật như bacteriocin, chất kháng sinh, virus xâm nhiễm vikhuẩn Vì vậy trong nghiên cứu bacteriocin thì vấn đề quan trọng là phải xácđịnh xem loại vi khuẩn mà mình nghiên cứu có tính đối kháng đối với mộtloài vi sinh vật nào đó hay không Hiện nay người ta đã xác định được một sốloại bacteriocin có thể kháng đồng thời nhiều loại vi sinh vật

1.2.2.1.Phương pháp xác định tính đối kháng

Để xác định tính đối kháng, việc thử nghiệm được tiến hành trên môitrường rắn có chủng chỉ thị Tính đối kháng thể hiện khi chủng chỉ thị bị ứcchế trên môi trường đó Hai phương pháp xác định tính đối kháng thườngđược sử dụng là phương pháp đối kháng đồng thời và phương pháp đốikháng dần dần

Phương pháp đối kháng đồng thời đơn giản nhất do A.Gratia đưa ra.Trong phương pháp này chủng thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được nuôicấy trên một môi trường, và tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế củachủng thử nghiệm khuếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị Sửdụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo giếng trên đĩa thạch vàcho chủng thử nghiệm đã được nuôi ủ vào giếng Phương pháp này thích hợpđối với kiểm tra những khuẩn lạc riêng lẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiêncứu về mặt di truyền

Phương pháp đối kháng dần dần do Fredericq đưa ra sau đó được cải tiến

thêm Trong phương pháp này, chủng thử nghiệm được nuôi ủ trên đĩa thạchtrong một khoảng thời gian Tiếp đó chủng chỉ thị được trải lên bề mặt của đĩathạch có chủng thử nghiệm Phương pháp này có độ nhạy hơn so với phươngpháp đối kháng đồng thời và phương pháp này không phụ thuộc vào thời gian

và điều kiện nuôi ủ của chủng chỉ thị và chủng thử nghiệm Một điểm hạn chếcủa phương pháp này là yếu tố gây ức chế có thể bị bất hoạt do chất gây mê

Cần kiểm tra cả hai phương pháp này để nhận biết một chủng có hoạttính kháng khuẩn hay không Điều kiện tối thích cho chủng thử nghiệm pháttriển không cần thiết bằng điều kiện để chủng đó sinh tổng hợp chất khángkhuẩn nhiều nhất

Việc áp dụng những phương pháp này có thể xác định được loại vikhuẩn nào có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Hạn chế của những phươngpháp này là không xác định cụ thể hoạt tính của bacteriocin Cần loại bỏnhững yếu tố gây ức chế mà không có bản chất là bacteriocin

1.2.2.2.Quan hệ giữa tính đối kháng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

Khi nghiên cứu bacteriocin cần loại bỏ những hiện tượng giốngbacteriocin Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh ra kháng chất giốngbacteriocin Một yếu tố quan trọng để phân biệt giữa bacteriophages vàbacteriocin là bacteriocin không mang yếu tố di truyền để tự nhân bản.Hamon và Peron đã dùng những phương pháp khác nhau để phân biệtbacteriophages và bacteriocin Trong đó bacteriophages kháng trysin hơnbacteriocin còn bacteriocin không bị ảnh hưởng bởi tia cực tím và nhiều loạibacteriocin chịu nhiệt rất tốt

Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzim bacteriolytic cótrọng lượng phân tử thấp có những đặc tính giống bacteriocin và rất khó đểphân biệt Tóm lại có nhiều yếu tố có tính đối kháng không có bản chấtbacteriocin Như bacteriophages là một loại vi rút cũng có khả năng diệt vi

khuẩn hay antibiotic là một loại kháng sinh cũng có khả năng diệt vi khuẩn.

Vì vậy tính đối kháng do nhiều nguyên nhân gây nên và một trong nhữngnguyên nhân tạo nên tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn là khả năng sinhtổng hợp bacteriocin

1.2.3 Sinh tổng hợp bacteriocin [34]

Điều kiện nuôi ủ đối với những loại sinh tổng hợp nên bacteriocin cóảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn Đối với nhiều chủng vi sinh vật điềukiện nuôi cấy để khả năng sinh tổng hợp bacteriocin là cao nhất đã được xácđịnh

1.2.3.1.Thành phần môi trường nuôi cấy

Đối với vi khuẩn gram dương có khả năng tạo bacteriocin thì rất thíchhợp với môi trường rắn Tăng độ nhớt của môi trường bằng cách thêm agar,dextran, glycerol hoặc tinh bột sẽ làm tăng khả năng sinh tổng hợp

bacteriocin của vi khuẩn streptococci Nhiều loại môi trường khác nhau có tác

dụng khác nhau trong việc làm tăng hay giảm khả năng sinh tổng hợpbacteriocin Một số thành phần môi trưòng làm tăng khả năng sinh tổng hợpbacteriocin phải kể đến là: cao men, mannitol, glucose, ion mangan

1.2.3.2 Điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy bao gồm nhiệt độ, thời gian, sự sục khí và pH ảnhhưởng đến hoạt tính của bacteriocin

Nhiệt độ thích hợp cho loại vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin pháttriển cũng là nhiệt độ thích hợp cho việc sinh tổng hợp bacteriocin Mỗi loại

vi khuẩn thích hợp với một khoảng nhiệt độ khác nhau

Số lượng bacteriocin trong một môi trường có thể sinh ra khác nhau ởcác pha khác nhau của một chu kỳ phát triển Việc sinh tổng hợp bacteriocintốt nhất ở pha phát triển và giảm dần ở những pha tiếp theo Nhiều nghiên cứu

cho thấy bacteriocin được sinh ra sau 8 giờ, đạt tối đa sau 18 giờ đến 24 giờ

và sau đó không sinh bacteriocin nữa [23]

Việc kiểm soát pH là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến khả năngsinh tổng hợp bacteriocin.Tuỳ từng loại vi sinh vật mà việc điều chỉnh pH làkhác nhau

1.2.4 Phương pháp chiết tách bacteriocin [2]

Bacteriocin có bản chất là protein nên việc chiết tách bacteriocin chính

là chiết tách protein Các phương pháp chiết tách và tính sạch protein đều dựatrên những tính chất hoá lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử,

độ hoà tan của protein cần chiết rút Nhiều protein còn liên kết với các phân

tử sinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bản chấtcủa các liên kết Muốn thu nhận protein nguyên thể tức là protein có tất cảtính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau

1.2.4.1 Phương pháp nhiệt độ:

Để tách các protein khác nhau dựa trên khả năng kết tủa của chúngngười ta có thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng củanhiệt Phương pháp này chỉ nên dùng với các protein bền với nhiệt Dịchprotein được giữ ở 50-70oC trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bịbiến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm Như vậy, dịch chiết proteinthô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không thuậnnghịch

Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịchbằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu

cơ cần tiến hành ở nhiệt độ dưới 0oC để tránh biến tính

1.2.4.2.Phương pháp nồng độ proton

Protein là các chất lưỡng tính vì vậy trong dung dịch axit và kiềmchúng sẽ bị phân ly như sau:

kiềmProtein-COOH Protein-COO- + H +

axit

Protein-NH2 Protein-NH3+

kiềm

Do các axit amin trong chuỗi polypeptide còn tồn tại nhiều nhóm chức

tự do dưới dạng các ion hoá là nguyên nhân tạo ra tính đa diện của protein.Phân tử protein rất dài nên nhóm ion tự do tận cùng của chuỗi polypeptidekhông đáng kể chủ yếu các nhóm chức tự do khác của chuỗi bên quyết địnhtính chất tích điện của phân tử protein Mức độ ion hoá của các nhóm này phụthuộc vào giá trị pH Các nhóm axit ở dạng anion trong môi trường kiềm, cácnhóm kiềm tồn tại ở dạng cation trong môi trường axit

Như vậy ở một giá trị pH xác định mỗi protein có một điện tích tổng sốnào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương

và tích điện âm Kết quả là ở giá trị nồng độ ion hydro cố định, các proteinkhác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau Nhiều phương phápdùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặc tính này Các phân tửprotein mang điện tích tổng số cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dungdịch Mỗi một protein có một giá trị pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích

âm và điện tích dương trong phân tử bằng không Giá trị đó gọi là điểm đẳngđiện của protein Điểm đẳng điện của các axit amin trung tính có giá trị pH tử5.6-7.0, đối với các axit amin có tính axit là từ 3.0-3.2, đối với các axit amin

có tính kiềm là từ 9.7-10.8 Ở điểm đẳng điện độ hoà tan của protein là thấpnhất, protein dễ bị kết tủa Dựa vào tính chất này người ta có thể tách từngphần protein trong hỗn hợp Cũng giống như trường hợp tác dụng của nhiệt

độ trong việc tách chiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc

nhờ tác dụng của pH môi trường Dịch protein được giữ ở pH<5 trong thờigian xác định Protein tạp cũng được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm.

1.2.4.3.Phương pháp dùng tác nhân hoá học

Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để tách chiếtcác protein Phương pháp này tiến hành dựa trên cơ sở: độ hoà tan của proteinphụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein vớicác phân tử nước Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrat hoá) sẽ bị giảm xuốngkhi thêm vào dung dịch protein các dung môi hữu cơ hoặc các muối trungtính Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗnhợp các loại rượu

Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp(từ 5oC trở xuống) Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạndưới 0oC và có thể đến -20oC như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định củaprotein Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cáchdùng máy ly tâm lạnh

Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4… Tuynhiên người ta nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại vàlàm ổn định hầu hết các loại protein Loại muối này lại rẻ tiền và phổ biến

Độ hòa tan của nó rất lớn ngoài ra nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủaprotein khác nhau thì khác nhau rất nhiều

Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bãohoà Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein Cách chocũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein Khi cho muối vàodịch chiết cần có máy khuấy từ để đảm bảo sự hoà tan của muối Khi dùngdung dịch bão hoà người ta đưa ra bảng tính số lượng muối cần thiết để phacác dung dịch có độ bão hoà khác nhau ở những nhiệt độ nhất định

Khái niệm về số phần trăm của độ bão hoà hoàn toàn đã được đề cậpđến Protein có thể bị kết tủa ở 50% hoặc 70% của độ bão hoà hoàn toàn của(NH4)2SO4 Khi cho dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà vào dịch chiết protein thìnồng độ (NH4)2SO4 không tăng đột ngột, sau khi kết tủa xong người ta thường

để lắng 2 giờ hoặc qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phươngpháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu Kết tủa được lấy ra bằngcách ly tâm lạnh hoặc lọc qua phễu Buchner Khi hoà tan kết tủa lại người tathường thêm ion Ca++ để làm bền protein

1.2.5 Đặc tính của bacteriocin [34]

1.2.5.1.Thành phần hoá học

Một vài loại enzim cụ thể như proteinases, lipases được sử dụng đểxác định thành phần hoá học của bacteriocin Một trong những bacteriocin đãđược xác định thành phần hoá học là Streptosin STH1 Thành phần của nógồm protein, lipid và nhóm photphat

Phân tích hoá học cho thấy bacteriocin là loại protein đơn giản, có

trọng lượng phân tử thấp Tuy nhiên với nhiều chủng khác như Clostridia, Staphylococci, Lactobacillus thành phần hoá học của bacteriocin bao gồm

protein, lipid và carbohydrate[49]

1.2.5.2 Đặc tính lí học

Đặc tính lí học của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩngram dương được cho ở bảng sau:

Bảng 1.1 Đặc tính lí học của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi

vi khuẩn gram dương

Bacteriocin Nhiệt độ cho

ChymotrypsinPronase P

RnaseDNase

Clostosin B 80oC/10 phút 4-9 Trypsin

ChymotrypsinPronase P

RnaseDNase

Clostosin C 80oC/10 phút 4-9 Trypsin

ChymotrypsinPronase P

RnaseDNase

Clostosin D 100oC/30 phút 4-9 Trypsin

ChymotrypsinPronase P

RnaseDNase

Boticin E-S5 100oC/10 phút

1.1-9.5

TrypsinChymotrypsinPepsin

Perfringocin

11105

100oC/30 phút 2-12 Trypsin

1.2.6.Phổ hoạt động của bacteriocin[34]

Hầu hết các bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram âm cóhoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng Đối với bacteriocin được sinh tổnghợp bởi vi khuẩn gram dương có hoạt tính ức chế các loại vi khuẩn gramdương Tuy nhiên một vài loại vi khuẩn gram âm bị ức chế bởi bacteriocinhay chất giống bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn gram dương Những vi

khuẩn gram dương có khả năng ức chế vi khuẩn gram âm như Lactobacillus acidophilus, Bacillus cereus, Streptococci, Staphylococci, Corynebacteria.

1.2.7.Phương thức hoạt động của bacteriocin[34]

Cơ chế kháng khuẩn được thực hiện trên các plasmids Có 2 lớpplasmid, lớp lớn là những plasmid có số lượng sao chép thấp và lớp nhỏ lànhững plasmid có số lượng sao chép cao Những plasmid lớn mang nhữnggen khác như colicin operon Colicin operon thường được cấu tạo bởi một sốgen chính Những gen này bao gồm một gen miễn dịch, môt gen cấu trúccolicin và một Brp (bacteriocin release protein) Nghiên cứu cho thấy việcduy trì plasmid colicin rất quan trọng đối với tế bào có họ hàng với chúng bởi

vì nếu một tế bào mất gen miễn dịch nó nhanh chóng bị phá hủy bởi colicin.Cùng lúc colicin được phóng ra từ tế bào phân chia bằng việc sử dụng lysisprotein làm chết tế bào

Bản thân colicin bao gồm 3 phần hình cầu phần thứ nhất quy định mụctiêu và gắn với cơ quan cảm nhận của tế bào nhạy cảm Phần thứ 2 liên quanđến chuyển mã hợp tác với tế bào mục tiêu Phần thứ 3 là có chức năng tiêudiệt và tạo ra một lổ trong màng tế bào mục tiêu hoặc hoạt động như một hạtnhân dể phân giải DNA hoặc RNA của tế bào mục tiêu Bởi vì chúng nhằmvào cơ quan cảm nhận nhất định và sử dụng cơ chế chuyển mã nhất định nêncác tế bào có thể tự thân kháng lại colicin bằng cách ức chế hoặc xóa bỏ gen

cho những protein này Tế bào có tính kháng như vậy có thể bị mất một thànhphần chủ chốt (ion sắt hoặc vitamin B) nhưng có lợi là không bị tiêu diệt.Trong bài báo cáo Nobel Laureate, Salvador e Luria, 1969, nhấn mạnhcolicin là độc tố phá vỡ sự ổn định của màng tế bào Ông ta không hoàn toànđúng nhưng colicin làm mất nguồn năng lượng của tế bào

1.2.8 Ứng dụng của bacteriocin [27], [ 36]

Bacteriocin đượic ứng dụng nhiêù trong thực phẩm Bacteriocin đượcứng dụng trong giai đoạn đầu của việc ủ bột làm bánh mì, trong lên men súc

xích (kháng Listeria) và trong sản xuất phomat (kháng Listeria và Clostridia).

Những ứng dụng cuả bacterin được nghiên cứu trong suốt quá trình lên mentrong ống nghiệm ở phòng thí nghiệm Những chủng vi khuẩn sinh tổng hợpbacteriocin đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm như nuôi ủban đầu, nuôi ủ lên men , nâng cao chất lượng và tính an toàn thực phẩm Hơnnữa chất kháng khuẩn được sản sinh bởi vi khuẩn lactic đóng vai trò quantrọng trong cơ thể sống diễn ra trong hệ tiêu hoá của con người vì vậy gây ảnhhưởng đến sức khoẻ con người

1.3.CÁC LOẠI VI SINH VẬT GÂY BỆNH DÙNG THỬ NGHIỆM TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI BACTERIOCIN[1]

E.coli là dạng trực khuẩn Gram âm kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử,

khá phổ biến trong tự nhiên và đặt biệt trong đường tiêu hóa của người vàđộng vật Chúng lên men đường lactose và glucose, cho phản ứng dương tínhvới indol và methyl red song có phản ứng âm tính với Voges Proskauer và

citrate Cách hữu hiệu nhất để định danh loài là xác định kiểu huyết thanh,

dùng kháng thể tương hợp với kháng nguyên O, H và K của các chủng E.coli

khác nhau

Phần lớn E.coli phân lập từ môi trường là loại không gây bệnh Nhóm E.coli gây bệnh đường ruột EPEC (enteropathogenic E.coli diarrheagenic E.coli) thuộc nhóm huyết thanh đã được xác định về mặt dịch tễ là những tác

nhân gây bệnh tuy vẫn chưa chứng minh được cơ chế gây bệnh của chúngthuộc dạng nội độc tố không chịu nhiệt hay nội độc tố chịu nhiệt hay thuộc

nhóm xâm nhiễm dạng Shigella Một nhóm E.coli gây bệnh khác là EIEC (enteroinvasive E.coli) rất giống với Shigella bởi khả năng gây bệnh lỵ do xâm nhiễm và chứng tiêu chảy ở người Nhóm E.coli gây bệnh cuối cùng là ETEC (enterotoxigenic E.coli) có khả năng sinh một hoặc cả hai loại độc tố

ruột từng được biết rõ là loại không chịu nhiệt và loại bền nhiệt không có tínhkháng nguyên

Một trong những đặc tính quan trọng của E.coli liên quan đến khả năng

chỉ thị sự nhiễm phân trong nước là do thời hạn sống sót của chúng Chúngthường chết đi sau cùng một khoảng thời gian như các vi sinh vật gây bệnhkhác có ở ruột Ở thực phẩm qua các biện pháp xử lý như ướp lạnh, cấp đông,

chiếu xạ E.coli bị tiêu diệt trong khi một số vi sinh vật gây bệnh khác vẫn

chống chịu được và sống sót Tương tự như vậy nước qua xử lý vẫn chứa một

số vi sinh vật gây bệnh trong khi E.coli đã bị tiêu diệt Chỉ đối với những thực phẩm có tính axit E.coli mới thực sự có giá trị như một chỉ thị về vệ sinh do

tính chống chịu cao của chúng đối với pH thấp [1]

3 ngày Phần lớn bệnh nhân hồi phục song cũng có những trường hợp tửvong, đặt biệt ở người già, trẻ sơ sinh, người suy yếu hệ miễn dịch.

Hầu hết các tiêu chuẩn vi sinh thực phẩm đều không cho phép có

Salmonella trong thành phẩm, sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao

bởi các cơ quan chức năng Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện

Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh, tăng sinh chọn

lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử nghiệm huyết thanh mất thờigian khoảng 7 ngày Hiện nay đã có nhiều nỗ lực để rút ngắn thời gian phát

hiện Salmonella bằng những phương pháp như thử nghiệm ELISA và thử

ADN, mất thời gian khoảng 48 giờ Tuy nhiên khi một mẫu có khả năngdương tính cần tiến hành các thao tác truyền thống để khẳng định sự có mặt

của Salmonella.

Do kém chịu nhiệt, Salmonella dễ dàng bị tiêu diệt khi thức ăn được

đun nấu phù hợp Việc làm lạnh, cấp đông, bảo đảm vệ sinh có tác dụng quan

trọng làm giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh Hiện nay Salmonella vẫn là một

trong những vi sinh vật gây bệnh quan trọng nhất từ thực phẩm [1]

1.3.3.Listeria monocytogenes

Những năm gần đây Listeria monocytogenes nổi lên như một tác nhân

gây bệnh từ thực phẩm quan trọng Đây là một loại trực khuẩn Gram dươngngắn, nhỏ, không sinh bào tử, thường có kiểu chuyển động xoay tròn quanhtrục thân thành từng đợt rất đặc trưng trong tiêu bản giọt treo Chúng có thểphát triển trên môi trường nuôi cấy đơn giản ở vùng pH giữa 5 và 9 Trên môitrường thạch rắn khuẩn lạc của chúng trông như những giọt sương trong suốt,hơi nhuốm màu lam nhạt khi nhìn qua ánh sáng phản chiếu dưới góc 45oC

Listeria thuộc loại ưa lạnh, có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến 2.5oC

và cao đến 44oC Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý đến việc làm vệ

sinh ống dẫn lạnh trên trần vì đó là nới có điều kiện thuận lợi cho Listeria

phát triển và tích tụ Bởi sản phẩm sữa từng dính dáng đến các cơn dịch bệnh

so Listeria, nhiều nghiên cứu được tập trung vào loại sản phẩm này Câu hởi liệu Listeria monocytogenes có sống sót qua được chế độ thanh trùng kiểu

Pasteur (63oC trong 30 phút hoặc 72 oC trong 15 giây) hay không hiện vẫncòn bỏ ngỏ bởi chưa ai có được câu trả lời khẳng định Điều đáng lưu ý là chế

độ thanh trùng sữa hiện nay vẫn chưa tính đến khả năng chịu nhiệt của

Listeria monocytogenes.

Liều lượng gây bệnh của Listeria monocytogenes hiện vẫn chưa được

biết Bệnh bắt đầu từ đường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốtnhẹ Trường hợp nặng chủng gây bệnh có thể sản sinh trong các đại thực bào

và gây nhiễm trùng máu Vi khuẩn tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim,mắt và có thể thâm nhập bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai, đẻ non hoặcnhiễm trùng thai nhi

Listeria monocytogenes được phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác

nhau như thịt, cá, rau, sữa và cả nước bề mặt Cần chú ý kiểm tra sự hiện diệncủa vi sinh vật ở mọi công đoạn trong quá trình chế biến thực phẩm, từ môi

trường, nguyên liệu, điều kiện sản xuất, vận chuyển đến sản phẩm cuối cùng.Nấu chín thực phẩm là một biện pháp hữu hiệu để giảm nguy cơ nhiễm bệnh[1].

1.3.4 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là cầu khuẩn hiếu khí tùy nghi Gram dương

thường kết dạng chùm, có mặt phổ biến mọi nơi, thường thấy trên da, xoangmũi, tóc ở người (đây chính là nguồn nhiễm quan trọng nhất vào thực

phẩm) Khi phát triển trong thực phẩm Staphylococcus aureus có khả năng

sinh một loại độc tố protein có phân tử lượng thấp (khoảng 30 kDa) gọi là độc

tố đường ruột của Staphylococcus (A, B, C1, C2, C3, D và E) Các độc tố trên

có thể gây nôn mửa, đau thắt bụng, tiêu chảy, kiệt sức ở mức nghiêm trọngsau 4-6 giờ từ lúc ăn Sự hồi phục xảy ra sau 24-72 giờ Nạn nhân không chếtnhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội Các loại độc tố này thuộcloại chịu nhiệt Một khi đã hình thành trong thực phẩm việc đun sôi không

phá hủy được chúng S.aureus không có khả năng cạnh tranh cao so với các

vi sinh vật gây hỏng thực phẩm khác (như Pseudomonas ) nhưng khi không

có đối thủ cạnh tranh, chẳng hạn trong thực phẩm muối hoặc chế biến, chúng

có thể sinh sôi và tạo ra các độc tố bền nhiệt

Biện pháp cần thiết để ngăn Staphylococcus aureus phát triển trong

thực phẩm là trữ lạnh các sản phẩm chín hoặc giữ nóng các thực phẩm ăn

nóng Chỉ cần 4 giờ ở nhiệt độ phòng Staphylococcus aureus cũng tạo ra một

lượng độc tố đủ để gây tai họa

Staphylococcus aureus có khả năng chống chịu cao đối với những

chất như tellurite, neomycin, polymycin, sodium azide Những chất trên đượcdùng làm tác nhân ức chế trong các môi trường nuôi cấy chọn lọc Tuy có khảnăng phát triển tốt trên các môi trường không chứa NaCl, có thể phát triển tốt

ở nồng độ 7-10% một số chủng có thể phát triển ở nồng độ 20% Nồng độ

NaCl tối đa ở đó Staphylococcus aureus có thể phát triển còn phụ thuộc vào

những thông số khác như nhiệt độ, pH, hoạt tính nước [1]

1.4.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG BACTERIOCIN TRONG

VÀ NGOÀI NƯỚC

1.4.1 Trên thế giới:

Hiện nay việc nghiên cứu, ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinhtổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quantâm Và cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công ,góp phần vào việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại Bacteriocin

là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờkhả năng này mà việc ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phúhơn

Năm 1970, nhóm tác giả D.A Kekessy và J.D.Piguet thuộc viện Vệsinh và An toàn thực phẩm - Thuỵ Sĩ đã nghiên cứu một phương pháp mớitrong việc phát hiện bacteriocin Chủng vi sinh vật đối kháng được nuôi ủ trênđĩa môi trường thạch dinh dưỡng, sau đó tạo giếng có đường kính 0.5mmbằng cách khoét bỏ agar trên đĩa Cho một lượng vi khuẩn có khả năng sinhtổng hợp bacteriocin vào giếng, sau thời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽxuất hiện, thể hiển bởi một vòng sáng rõ quanh giếng [23]

Năm 1976, nhóm tác giả John R Tagg, Adnan S Dajani và Lewis W.Wannamaker thuộc khoa vi sinh- trường đại học Otago, New Zealand, trườngđại học Dược Minnesota, Minnesota đã nghiên cứu về những loại bacteriocincủa vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết quả có giá trị Nghiên cứu đãcho biết được tính đối kháng của bacteriocin, cách đặt tên và phân loạibacteriocin, chiết tách và tinh sạch bacteriocin, phân tích hoạt tínhbacteriocin, các loại hoạt động của bacteriocin và ứng dụng của bacteriocin[25]

Năm 1992, nhóm tác giả R.Yang, M.C Joshnon và B Ray thuộc Đạihọc Wyoming, Laramie đã nghiên cứu một phương pháp mới để chiết tách

một lượng lớn bacteriocin từ vi khuẩn lactic với tên đề tài : ‘Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria’.Phương pháp

này dùng môi trường pediocin AcH, nisin, sakacin A, leuconocin Lcm1 làmtăng hiệu quả chiết tách và thu được một lượng bacteriocin nhiều hơn quátrình phân lập [35]

Năm 1999, các tác giả Raf Callewaert và Luc De Vuyst thuộc Khoacông nghệ sinh học ứng dụng -Đại học Brussel, Bỉ đã nghiên cứu việc sinh

tổng hợp bacteriocin của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng dụng

cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men Việc sinh tổng hợp thu nhậnbacteriocin bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen [36]

Cũng trong năm 1999, nhóm tác giả Farida Khalid, Roquya Siddiqi vàNaheed Mojgani thuộc khoa vi sinh -Trường đại học Karachi-Pakistan đãnghiên cứu tìm ra một loại bacteriocin mới có tên lactocin LC-09 Lactocin

LC-09 được phân lập từ chủng vi khuẩn lactobacillus có trong một mẫu bệnh Loại này ức chế được một số loại lactobacillus và vi khuẩn Gram dương khác như Listeria ivanovii, Streptococcus agalactii và S peyogenes Đặc tính của

Lactocin LC-09 là chịu nhiệt (4 giờ ở 100oC) và thích hợp với môi trường có

pH axit Loại bacteriocin này bị khử hoạt tính bằng cách sử dụng enzimprotease Có thể dùng acridine orange, ethidium bromide để gây đột biếntrong việc sản sinh ra loại bacteriocin này [24]

Năm 2002 Soore cùng cộng sự đã nghiên cứu việc tạo ra một chấtkháng khuẩn đặc biệt của vi khuẩn lactic gọi là bacteriocin Bacteriocin được

sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế cácloại hoá chất bảo quản khác Bacteriocin có bản chất là protein nên rất antoàn đối với sức khoẻ con người [41]

Năm 2004, nhóm tác giả Todorov SD, Van Reenen CA và Dicks KMthuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng

sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus Plantarum ST13BR , một

chủng được phân lập từ bia Barley Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi

khuẩn Lactobacillus plantarum được phân lập từ bia barley (kích thước phân

tử 10kDa) ức chế sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus casein, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường có ảnh

hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và hỗn hợp các loại môi trường

mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất [43]

Năm 2005, phòng kiểm nghiệm chất lượng và an toàn vệ sinh thựcphẩm thuộc đại học Athens-Hy Lạp đã làm sạch và xác định đặc tính của một

loại bacteriocin được sinh tổng hợp từ Lactobacillus curvatus L442, chủng

này được phân lập từ một loại xúc xích lên men truyền thống ở Hy Lạp, có

khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes[31].

Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lênmen truyền thống suan-tsai của Đài Loan Với các chủng sau khi phân lập tiếptục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổnghợp bacteriocin[44]

Năm 2006, Stefan Marcinowski, giám đốc điều hành nghiên cứu tạiBASF cho biết kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn có lợi lactobacillus docông ty hoá chất BASF của Đức phát triển Đây là sản phẩm giúp người dùng

loại trừ các bệnh về răng miệng Chủng lactobacillus mới có tên là L

anti-caries có khả năng sinh bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng kết thànhkhối không thẻ dính trên bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc miệng[47]

Tháng 3/2007 nhóm tác giả S.D Todorov và Leon M.T Dicks KMthuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng

sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được

phân lập từ ngũ cốc lên men Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14kDa) ức

chế sự phát triển của Lactobacillus casei, E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiella pneumoniae and Lactobacillus curvatus Sự

phát triển của chủng ST712BZ trên môi trường BHI, M17, sữa đậu nành vàmật đường tương tự như trên môi trường MRS với việc sinh tổng hợpbacteriocin cực đại (12800AU/ml) được ghi nhận trên môi trường MRS sau24h Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường, nhiệt độ và pH có ảnhhưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp cácloại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất [37][38]

1.4.2 Ở Việt Nam:

Hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn lacticsinh tổng hợp nên đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Tuy nhiêncác nghiên cứu về ứng dụng của bacteriocin còn ít và chưa thu được nhữngkết quả khả quan

Năm 2002, các tác giả Nguyễn thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn thịKim Quy thuộc trung tâm Công nghệ sinh học , Đại học quốc gia Hà Nội đã

nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của loài Lactobacillus plantarum L24 Bacteriocin L24 được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum được phân lập từ nước dưa Chủng vi khuẩn L24 có

khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu trắng sữa, tế bào có dạng hình que, bắt màu Gramdương, không có khả năng di động, không sinh bào tử, phản ứng catalaza âmtính Chủng L24 có khả năng đồng hóa cacbohydrat đặt biệt là xyloza ChủngL24 vừa có khả năng sinh axit lactic vừa có khả năng sinh bacteriocin II,protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10-30kDa Nguồn Nitơ vô cơ có

ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Trên môi trường MRS có

bổ sung 0.5% giống và 0.1% NH4H2PO4 lượng bacteriocin sinh nhiều hơn(50microgam/ml) khi bổ sung 0.1% NH4Cl (30.2microgam/ml) [16]

Năm 2002 , tác giả Lê Thanh Mai đã thành công trong việc nghiên cứuquy trình muối chua cây nha đam Các thí nghiệm tiến hành dựa trên 2

phương pháp: lên men có bổ sung giống Lactobacillus plantarum và lên men

không bổ sung giống Kết quả cho thấy muối chua có bổ sung giống chothành phẩm có chất lượng tốt hơn và đồng đều hơn [20]

Năm 2004, các tác giả Tăng Thị Chính, Đặng Đình Kim thuộc Việncông nghệ môi trường -Viện KH&CN Việt Nam đã nghiên cứu ứng dụng visinh vật làm chế phẩm trong nuôi tôm cao sản Một trong những loại vi sinh

vật được dung là Lactobacillus Chế phẩm có tác dụng làm tăng tính ngon

miệng, giúp tiêu hoá các chất dinh dưỡng có trong thức ăn, tăng cường sức đềkháng, phòng ngừa các bệnh đường ruột như nhiễm E.coli, ức chế sự pháttriển của các vi khuẩn có hại Do đó nâng cao năng suất nuôi tôm [18]

Ngoài ra, khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn

lactobacillus còn ứng dụng trong ngành phi thực phẩm như sản xuất kem

đánh răng với mục đích diệt khuẩn, điều này mở ra một hướng mới cho việcứng dụng bacteriocin trong nhiều lĩnh vực khác[21]

Tóm lại còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vàocác sản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảmquan có nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên Cóđược ưu điểm này là do ngoài những tính chất ưu việt vi khuẩn lactic còn cókhả năng sinh tổng hợp bacteriocin , một chất bảo quản thực phẩm

Nhận xét:

Qua quá trình tìm hiểu và tổng hợp tài liệu, tổng hợp các công trìnhnghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic trong vàngoài nước, chúng tôi nhận thấy cần quan tâm một số vấn đề sau:

Khả năng sinh tổng hợp bacteriocin ở mỗi loài vi khuẩn lactic khácnhau là khác nhau và rất phong phú và đa dạng Tuy nhiên, ở Việt Nam cácnghiên cứu về lĩnh vực này còn hạn chế

Hiện nay các loại hoá chất dùng để bảo quản thực phẩm ít nhiều có ảnhhưởng đến sức khoẻ con người, thế nhưng các công trình nghiên cứu ứngdụng bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic trong bảo quản thựcphẩm ở nước ta rất ít Xuất phát từ những nhận xét trên, chúng tôi đưa ra kếhoạch nghiên cứu như sau:

Phân lập vi khuẩn lactic và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổnghợp bacteriocin cao

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn đó.Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và thành phần môitrường dinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Từ đó nuôi ủ vikhuẩn lactic trong điều kiện tối ưu để thu nhận bacteriocin

Nghiên cứu bản chất protein của bacteriocin và xác định trọng lượngphân tử của bacteriocin

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nem chua

Các mẫu nem chua -chợ Hàn -TP Đà Nẵng

Thành phần của nem chua bao gồm: thịt nạc heo sống xay nhuyễn, daheo chín thái sợi và một số gia vị Hỗn hợp để lên men tự nhiên 2-3 ngày

2.1.2.Chủng vi sinh vật chỉ thị

Các chủng vi sinh vật bao gồm Escherichia coli, Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogens được cung cấp bởi Trung tâm

chất lượng –An toàn vệ sinh và thú y thủy sản vùng 2

Các chủng trên có nguồn gốc từ mẫu liên phòng do AgriQuality-NewZealand cung cấp

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý ta được dịch có nồng độ 10

-2, tiếp tục pha loãng ta có được các nồng độ cao hơn Từ các ống nghiệm ởmỗi nồng độ trên hút 0.1ml cho vào các đĩa petri có chứa sẵn môi trườngnuôi cấy chọn lọc (ở đây ta dùng MRS agar) Mỗi nồng độ được thực hiệntrên 2 đĩa petri Dùng que cấy trang dàn đều vi sinh vật trên đĩa môi trường.Nuôi các đĩa ở 30oC trong 48 giờ

Sau thời gian nuôi ủ chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 CFU/g đểđếm đồng thời chọn các đĩa có khuẩn lạc tách biệt nhau để đếm Số lượngkhuẩn lạc là trung bình cộng của 2 đĩa ở cùng nồng độ

Từ các khuẩn lạc được phân lập ta chọn ra một số khuẩn lạc điển hình

để phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo

2.2.1.2.Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp bacteriocin bằng phương pháp đối kháng đồng thời [23][33]

Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn được quan sát bằng việc khuếchtán vào môi trường chứa thạch Chủng có khả năng sinh tổng hợp bacteriocinđược nuôi ủ ở 30oC trong 48 giờ Tế bào được loại bỏ bằng cách ly tâm ở

10000 vòng trong 15 phút ở 4oC Dịch nổi bên trên được thu nhận và điềuchỉnh đến pH 7 bằng NaOH 4M Chuẩn bị các đĩa chứa môi trường thạchdinh dưỡng (Nutrient agar), các đĩa được dàn đều bởi 5ml thạch mềm chứachủng chỉ thị (các chủng vi sinh vật dùng thử nghiệm tính đối kháng với vikhuẩn sinh bacteriocin) Để đông môi trường sau đó dùng khoan vô trùngtạo những giếng có đường kính 5mm trên đĩa thạch (có chủng chỉ thị) bằngcách bỏ agar đi Cho 100 dịch nổi sau khi ly tâm và chỉnh pH vào các giếng.Nuôi ủ các đĩa ở 37oC trong 24 giờ

Bacteriocin được sinh tổng hợp nên sẽ khuếch tán vào môi trường và

ức chế sự phát triển của các chủng chỉ thị Điều này được thể hiện bởi vòngkháng khuẩn quanh giếng

2.2.1.3 Phương pháp tính lượng bacteriocin sinh tổng hợp [ 23][30]

Bacteriocin được tính bằng đơn vị AU/ml (arbitrary units ) là đơn vịtuỳ ý Cách tính như sau: Pha loãng dịch đã ly tâm (nồng độ thứ nhất) lên dãycác nồng độ gấp đôi bằng cách hút 1ml dịch nổi pha loãng với 1ml nước cất

vô trùng ta được độ pha loãng thứ hai, hút 1ml dịch ở độ pha loãng thứ 2 phavới 1ml nước cất vô trùng ta được độ pha loãng thứ 3 Một AU/ml được ghinhận khi ở độ pha loãng cuối cùng mà bacteriocin không thể hiện việc khángkhuẩn hay nói cách khác là không xuất hiện vòng kháng khuẩn trên đĩa thạch

2.2.1.4 Phương pháp thử catalase [1]

Nguyên tắc: nhằm xác định sự có mặt của enzym catalase

Cơ sở sinh hoá: Bởi oxy có thể tạo ra hàng loạt những dẫn xuất mang độc

tính đối với vi sinh vật, vi sinh vật cũng có thể tự giải độc bằng cách tạo ranhững enzym có khả năng phá huỷ một số sản phẩm chứa oxy như vậy Điểnhình của loại enzym này là catalase Enzym catalase có ở hầu hết các vi sinh

vật hiếu khí và kỵ khí tuỳ nghi chứa cytochrome ngoại trừ Streptococcus spp.

Cả catalase và peroxidases đều được gọi dưới một tên chung làhydroperoxidase Peroxidases là enzym thực vật, catalase có ở thực vật vàđộng vật Catalase là một hemeprotein, coenzyme của nó là hemin chứa bốnnguyên tử sắt III có khả năng chuyển hoá thuận nghịch giữa hai trạng thái oxyhoá và khử trong thời gian hoạt động Có bằng chứng cho thấy một vài vi sinhvật có thể có enzym catalase không chứa sắt và hoạt tính catalase có thể yếuhoặc mạnh ở các lactobacillus khác nhau

Hydrogen peroxide được hình thành như một sản phẩm cuối dạng oxyhoá của sự phân giải đường kiểu hiếu khí Flavoprotein dạng khử phản ứngtrực tiếp với khí oxy bằng cách khử điện tử tạo nên hydrogen peroxide :

FPH2 + O2 = FP + H2O2

Trong đó:

Phương pháp thử:

Hydrogen peroxide 30%

Dùng khoen cấy lấy khuẩn lạc đã được làm thuần trên môi trườngkhông chọn lọc (TSA) đã nuôi ủ 18-24 giờ đặt lên lam kính sạch Nhỏ mộtgiọt H2O2 30% lên vi sinh trên lam

2.2.1.5.Phương pháp thử khả năng lên men đường [1] [19]

Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng của một số vi sinh vật lên men một

carbohydrate đặc hiệu có trong môi trường cơ bản tạo nên axit

Cơ sở sinh hoá: Việc sinh axit làm giảm pH thể hiện qua sự đổi màu của chất

chỉ thị pH có trong môi trường Các sản phẩm cuối đặc trưng trong lên men là: axit lactic, axit formic, axit acetic, ethanol, axit butyric

Phương pháp thử :

Môi trường : Phenol red broth base pH 7.4 Chỉ thị pH: Phenol red Trong môi trường axit chỉ thị phenol red từ màu đỏ chuyển sang vàng (pH6.8) Trong môi trường kiềm chỉ thị phenol red giữ nguyên màu đỏ (pH 8.4)

Cấy khuẩn lạc đã được làm thuần trên môi trường Nutrient agar vào các ốngphenol red có pha đường Nồng độ đường sử dụng là 1% Nuôi ủ các ống ở

37oC trong 18-24 giờ

Đđọc kết quả:

- Dương tính (axit) :môi trường chuyển sang màu vàng

- Âm tính: môi trường giữ nguyên màu đỏ

2.2.1.6.Thử nghiệm Gram cải tiến [1]

Test KOH dùng để kiểm tra Gram âm và Gram dương của vi sinh vật.Đây là một phương pháp thay thế phương pháp nhuộm truyền thống trướcđây

Phương pháp thử: Nhỏ 1-2 giọt dung dịch KOH 3% lên lam kính Dùng

khuyên cấy lấy một phần khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc cho lênlam kính Sau 5-10 lần nâng khuyên cấy lên xuống, theo dõi dây nhầy xuấthiện và đọc kết quả:

Gram âm (KOH dương tính): nếu có dây nhầy xuất hiện

Gram dương (KOH âm tính): không có dây nhầy xuất hiện

2.2.1.7 Thử nghiệm khả năng di động [1]

Nguyên tắc: Xác định xem một vi sinh vật có khả năng di động không

Phương pháp thử: Dùng kim lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA đã ủ 18-24

giờ ở 37oC cấy đâm xuyên vào tâm môi trường thạch mềm chứa trong ốngnghiệm tới độ sâu khoảng 2cm Ủ môi trường ở 37oC trong 24-48 giờ

Độ hấp thu là số đo lượng sinh khối chứ không phải là số lượng tế bào.Kích thước tế bào thay đổi theo từng giai đoạn sinh trưởng vì thế xây dựngđường cong chuẩn cho máy đo mật độ quang với các tế bào ở giai đoạn tăngtrưởng là tốt nhất Kích thước tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vào các môitrường nuôi cấy khác nhau Kích thước tế bào càng nhỏ lại nếu môi trườngcàng nghèo dinh dưỡng vì vậy đường cong chuẩn phải được xây dựng theotừng môi trường nuôi cấy và từng chủng vi sinh vật riêng biệt.

Nếu mật độ tế bào quá cao, photon ánh sáng có thể bị một tế bào nào

đó làm lệch hướng khỏi bộ tụ quang và quay trở lại bởi một tế bào khác, làmmất độ chính xác của độ hấp thu, đặc biệt là khi các giá trị độ hấp thu ở bướcsóng 600nm lớn hơn 0.7 Vì vậy khi xác định mật độ tế bào bằng maý đo mật

độ quang, dịch huyền phù tế bào cần phải được pha loãng đến những nồng độthích hợp để có được độ hấp thu chính xác Lưu ý rằng giá trị đo được cầnnhân thêm với hệ số pha loãng

2.2.2.2.Phương pháp đo pH

Sử dụng pH kế để đo pH của dịch nuôi cấy vi khuẩn

2.2.2.3.Phương pháp chiết tách và tinh sạch protein [2][29]

Sử dụng tác nhân hoá học để chiết tách protein Dung dịch nuôi cấy visinh vật được ly tâm lạnh 4 oC ở 16000 vòng trong 15 phút Lấy dịch nổi bêntrên cho kết tủa với 50% (NH4)SO4 bão hoà Sau đó để qua đêm để kết tủahoàn toàn Ly tâm hỗn hợp 4 o C ở 16000 vòng trong 15 ph sau đó lọc lấy kếttủa, ta chiết tách được protein Hoà tan protein bằng dung dịch photphatbuffer Dùng phương pháp điện di để xác đinh trọng lượng phân tử proteinsau khi chiết tách

2.2.3 Phương pháp khác điện di[51]

Nguyên lý SDS-PAGE: Kỹ thuật điện di SDS trên polyacrylamide gel

dựa trên nguyên lý dưới tác dụng của điện trường, các phân tử protein sẽ liênkết với các phân tử SDS có trong gel và di chuyển từ cực âm sang cực dươngqua mạng lưới polyacrylamide gel Sự phân tách này xảy ra nhờ điện tích củaprotein ở pH cho trước, kích thước của protein và sự cản trở của chúng trongquá trình dịch chuyển trong điện trường Vì vậy, nếu các đặc điểm này bù trừlẫn nhau thì protein khác điện tích và kích thước nhưng cũng có thể di chuyểncùng tốc độ như nhau trong gel Để đơn giản hóa sự phân tách hỗn hợpprotein mà chỉ phụ thuộc vào kích thước của chuỗi polypeptide, người ta tiếnhành biến tính protein bằng thuốc tẩy sodium dodecyl sulfate (SDS) SDS liênkết rất chặt với protein làm cấu trúc ba chiều của protein bị biến tính trở thànhcác chuỗi polypeptide gắn đầy SDS trên đó Trung bình, một amino acid sẽliên kết với hai phân tử SDS Phân tử SDS lại tích điện âm nên điện tích củachuỗi polypeptide có gắn SDS âm nhiều hơn so với chuỗi không gắn SDS.Hơn nữa, tỷ lệ điện tích trên khối lượng của các phân tử protein được xem là

như nhau vì điện tích của protein chủ yếu do SDS quyết định Do đó, sự phântách các chuỗi polypeptide được biến tính bởi SDS sẽ hoàn toàn do kíchthước của chuỗi quyết định.

Nhờ vào cấu trúc dạng mạng lưới của polyacrylamide gel mà các phân tửprotein có khối lượng phân tử khác nhau (hay cấu trúc không gian phức tạpkhác nhau) lần lượt di chuyển qua lớp gel với tốc độ khác nhau và cuối cùngphân tách thành những băng protein có phân tử lượng khác nhau Sau khi tiếnhành nhuộm các băng protein trên polyacrylamide gel và rửa sạch thuốcnhuộm trên gel, dựa vào vị trí và độ đậm nhạt của các băng này (cùng với cácbăng protein marker chuẩn), ta có thể xác định một cách định tính thành phầncác loại protein cùng với sự thay đổi hàm lượng của chúng Kỹ thuật này chủyếu để kiểm tra sự xuất hiện các protein mới trong giống nghiên cứu

Ngoài tác dụng phân tách các băng protein có khối lượng phân tử khác nhau.polyacrylamide gel còn được ứng dụng để phân tách các đoạn DNA có kíchthước bé (< 200 bp)

2.3 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

Các thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu bao gồm những thiết bịthông dụng của phòng thí nghiệm như: nồi hấp, tủ ấm, cân phân tích, máy đopH và một số dụng cụ thuỷ tinh thông thường khác của phòng thí nghiệm

2.4 HOÁ CHẤT THÍ NGHIỆM

Hoá chất và môi trường nghiên cứu được sử dụng của hãng Đức Hạn sử dụng đến 2010 Một số hoá chất và môi trường chính được sửdụng như sau (thành phần cụ thể của các loại môi trường được chú thích ởphụ lục 2):

Merck Tryptone soya agar (TSA)

- Nutrient agar (NU)

- MRS agar