Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm tỏi trong sản xuất thịt lên men ( nem chua – xúc xích lên men)

LỜI MỞ ĐẦUSản phẩm thịt lờn men được biết đến từ lâu nhờ việc bổ sung muối vàđường vào thịt để thu được một loại sản phẩm ăn ngon và giá trị dinh dưỡng cao.Thực tế việc bổ xung này tạo đ

LỜI MỞ ĐẦU

Sản phẩm thịt lờn men được biết đến từ lâu nhờ việc bổ sung muối vàđường vào thịt để thu được một loại sản phẩm ăn ngon và giá trị dinh dưỡng cao.Thực tế việc bổ xung này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển một vài loài visinh vật có sẵn trong sản phẩm để sinh ra một số chất làm cho sản phẩm có hương

vị đặc biệt và có tác dụng bảo quản sản phẩm lõu bị hỏng

Ngày nay người ta đã biết rằng các đặc tớnh quý bỏu đó của sản phẩm làkết quả của quá trình lên men đường thành axit lactic, thực hiện bởi nhóm vikhuẩn lactic có trong hệ vi sinh vật tự nhiên của thịt Các vi sinh vật này cũng cóthể được đưa thêm vào thịt trong quá trình sản xuất.(chủng khởi động – startercultures)

Nem chua là sản phẩm thịt lên men lactic cổ truyền của người Việt Namđược rất nhiều người ưa thớch.Nem chua chế biến theo phương pháp truyền thống,cho chất lượng sản phẩm không ổn định do nhiều yếu tố như: phụ thuộc vào hệ visinh vật tự nhiên và trong thịt, chất lượng nguyên liệu thịt, điều kiện và qui mô sảnxuất.Những yếu tố này rất khó kiểm soát trong điều kiện sản xuất thủ công, gây ra

sự mất ổn định cho chất lượng sản phẩm Đặc biệt thịt nguyên liệu do quá trìnhgiết mổ vận chuyển thủ công nên sự nhiễm tạp các vi sinh vật không mong muốn

là rất lớn vì vậy nguy cơ ô nhiễm các vi sinh vật gây bệnh là rất cao gây nguyhiểm cho sức khỏe con người

Xúc xích lên men là một trong những sản phẩm thịt lên men khá phổ biếntrên thế giới.Tựy từng vùng, địa phương mà mỗi nơi có những sản phẩm đặc trưngrất nổi tiếng như: Chorozi (Tây Ba Nha), Salami (í) hay Summer (Mỹ) Trong số

đó xúc xích lên men Summer là sản phẩm thịt lên men ở nhiệt độ cao, thời gian lênmen ngắn rất giống với sản phẩm nem chua Việt Nam

Từ thực tế trên và với mong muốn phát triển sản phẩm mới cũng như làm

ổn định, nâng cao chất lượng sản phẩm thịt lên men nên em đã chọn đề tài:

“Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm tỏi trong sản xuất thịt lên men ( nem chua – xúc xích lên men)”

Để thực hiện được những mục tiêu này, đề tài gồm nội dung nghiên cứu sau:

1 Nghiên cứu cơ chế kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic sinhbacteroxin và chế phẩm tỏi trong môi trường thịt lên men

2 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học vàchế phẩm tỏi trong công nghệ sản xuất nem chua và đánh giá chất lượngsản phẩm

3 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh họcvào công nghệ sản xuất xúc xích lên men Summer và đánh giá chấtlượng sản phẩm

NỘI DUNG

PHẦN I: TỔNG QUANA.THỊT LÊN MEN (XÚC XÍCH LÊN MEN - NEM CHUA)

I Giới thiệu về thịt lên men

Thịt lên men đã được chứng minh là tốt cho sức khoẻ vì chứa các thành phần dinh dưỡng có lợi như cung cấp hệ vi sinh vật có lợi probiotic và prebioic, tạo ra trạng thái cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột từ đó nâng cao khả năng chuyển hoá, tiêu hoá và ngăn ngừa bệnh tật của vật chủ.

Là sản phẩm thịt có giá trị dinh dưỡng cao bởi tạo ra các sản phẩm chuyển hóa sau lên men dễ tiêu hóa, dễ hấp thụ Là sản phẩm thịt có hương

vị thơm ngon đặc trưng, truyền thống, làm phong phú sản phẩm từ thịt.

a) Định nghĩa thịt lên men

Đó là sản phẩm thu được từ quá trình lên men lactic một số đường có mặt trong hỗn hợp thịt do hệ vi sinh vật sẵn có trong thịt và môi trường hoặc được bổ sung từ bên ngoài vào, với sự có mặt của muối, các tác nhân bảo quản, và gia vị

b) Phân loại sản phẩm thịt lên men

Các sản phẩm thịt lên men có ở rất nhiều nơi trên thế giới Tuy nhiên, Châu

Âu là nơi sản xuất và là thị trường tiêu thụ lớn nhất, theo ước tính có hơn mộtnghìn tấn xúc xích lên men được sản xuất ở châu Âu mỗi năm Những nước sảnxuất nhiều sản phẩm thịt lên men nhất là Đức, Italy, Tây Ban Nha và Pháp, ở đây

20 đến 40% những sản phẩm thịt chế biến có thể được xếp vào loại nhóm sản

phẩm thịt lên men Người Đức tiêu thụ nhiều xúc xích lên men nhất, trung bình cảnước là 5 kg/ người/ năm (Lucke) Riêng về xúc xích lên men bán khô thì lịch sử

ra đời của nó ở Châu Âu và ở Đông Nam Á, Trung Quốc đều lâu đời như nhau,khoảng 2000 năm trước đây

Các sản phẩm thịt lên men được phân loại theo nhiều hình thức, có thể theothành phần, cấu trúc như là xúc xích lên men, jăm bụng,… hay theo mức độ lênmen như chín nhanh, chín vừa, chín chậm

Dựa vào hàm lượng nước, có thể chia xúc xích lên men thành các nhóm:

- Nhóm có độ ẩm cao (moist) có độ ẩm lớn hơn 50%.

- Nhóm bán khô (semi-dried) có độ ẩm 35-50%.

- Nhóm sấy khô (dried) có độ ẩm 20-35%

Đại diện của nhóm thứ nhất là xúc xích Mettwurst và Teewurst ở Đức,

Merguez Bắc Phi, Lebanon bologna ở Mỹ, Mortadella ở Nam Mỹ, Italy, Pháp

Đại diện của nhóm thứ hai là Summer sausage, Longaniza ở Pháp và Bồ Đào Nha, Laap ch’eung, Xun chan của Trung Quốc, Nham, Sai-krok-pries của

Thái Lan

Đại diện của nhóm thứ ba là Chourisam của Ấn Độ, Bồ Đào Nha, Chorizo của Tây Ban Nha, Veneto salami của Úc, Pepperoni ở châu Âu, Bắc Mĩ, Úc,…

2.Nem chua Việt Nam

Theo phân loại thì nem chua Việt Nam được xếp vào loại xúc xích lên men

có độ ẩm cao, giống như nhóm sản phẩm ở vùng Đông Nam Á được bao gói trong

lá chuối, thường lên men tự nhiên ( không cấy chủng ) và có nhiệt độ lên men cao25-350C, thời gian lên men ngắn và không qua xử lý nhiệt nên thời hạn sử dụngngắn

Hiện nay vẫn chưa có thống kê cụ thể về sản lượng tiêu thụ nem chua ởViệt Nam, nhưng với sự phát triển rộng khắp của các cơ sở sản xuất nem chuatrong cả nước con số sẽ không phải là nhỏ Ở miền Bắc có làng nghề Ước Lễ sản

xuất nem chua nổi tiếng, miền Trung có nem Vinh, nem Thanh Hoá Miền Nam đãxuất hiện nem chua sản xuất trên quy mô lớn hơn như Nem chua Năm Sao, ThiênHương Gia vị đưa vào nem chua cũng rất đa dạng và phong phú tuỳ theo khẩu vịngười dân từng vùng Nem chua ở miền Bắc không thể thiếu lá ổi, vị ngọt nhẹ vàchua nhẹ, trong khi người dân miền Trung lại ưa thích nem chua có lá đinh lăng,miền Nam nem thường hơi ngọt và có vị rất cay Các gia vị hay được đưa thêmvào nem chua ở cả ba vùng thường là tiêu, tỏi, ớt…trong đó ngoài tạo hương vịcho sản phẩm còn có vai trò khá quan trọng trong việc ức chế các tác nhân vi sinhvật gây hại trong sản phẩm do đặc thù là sản phẩm lên men tự nhiên.

3.Xúc xích lên men Summer (Mỹ)

Là sản phẩm thịt lên men làm từ hỗn hợp thịt lợn, bò, mỡ và các loại gia vị.Loại xúc xích này có đặc điểm là lên men ở nhiệt độ cao và lên men nhanh gầngiống với nem chua, phù hợp với khí hậu Việt Nam Lên men có thể tự nhiên ở 35– 370C trong thời gian vài ngày hoặc có cấy chủng giống Các chủng cấy sử dụng

cho loại này thường là Pedicoccus do có khả năng sinh axit cao và lên men phù

hợp ở nhiệt độ cao Khi lên men đạt độ pH nhất định (4.5 – 4.7) thì dừng quá trìnhlên men bằng cách đưa sản phẩm đi sấy hay hun khói ở nhiệt độ 70 – 75 0C trongkhoảng 1h (tùy kích thước sản phẩm) để đạt 630C (trong vòng 20 – 30 phút) Sảnphẩm sau đó được bảo quản lạnh 0 – 40C và được tiêu thụ Sản phẩm có màu đỏhồng, chắc thơm ngon đặc trưng

II Tính an toàn và nguy cơ không an toàn của sản phẩm thịt lên men và nem chua

1.Tính an toàn của sản phẩm thịt lên men

Nem chua hay xúc xích lên men đều được xếp vào các loại sản phẩm ănliền ( Ready-to-eat foods ) không qua xử lí nhiệt chính vì vậy yêu cầu về vệ sinh

an toàn thực phẩm cần phải chú trọng

Do sản phẩm thịt lên men là một hệ thống gồm nhiều cấu tử rắn phức tạpvới một hệ vi sinh vật vô cùng phong phú nên sự an toàn của sản phẩm thịt lên

men chủ yếu phụ thuộc vào khả năng kháng khuẩn của chính sản phẩm đối với cácloại vi sinh vật gây thối hỏng và cả nhưng loài gây bệnh cho con người Những tácnhân chủ yếu có tính ngăn ngừa những mối nguy từ vi sinh vật của xúc xích làhàm lượng muối ăn, pH, và hàm lượng muối Nitrit trong sản phẩm Trong khimuối ăn có tác động giảm hoạt độ của nước aw thì pH thấp ( pH = 4,0 – 5,1 ) củasản phẩm lại có tác động ngăn ngừa hoạt động của các vi sinh vật gây thối và cảnhững vi sinh vật gây bệnh Muối nitrit dưới dạng NO2- có khả năng đi qua lớpmàng ion trong thành tế bào vi khuẩn, vô hoạt các enzyme của chúng và do đó làmgiảm sự phát triển của chúng ( Cook and Pierson, 1983; Pierson and Smooth,1987) Trong ngày đầu lên men sự phát triển của quần thể vi sinh vật đã sử dụnghết lượng oxy trong nguyên liệu và làm giảm quá trình oxy hoá khử xảy ra trongsản phẩm, điều này làm tác động của muối nitrit càng thêm hiệu quả và ngăn ngừa

sự phát triển của loài vi khuẩn hiếu khí gây thối hỏng ( Pseudomonas ) trong

nguyên liệu ban đầu Sau vài ngày lên men tiếp theo một lượng lớn vi khuẩn lacticsản xuất ra nhiều axit lactic làm pH sản phẩm giảm nhanh và pH giảm ngăn ngừa

sự phát triển của các loài gây bệnh như Salmonella, Clostridium…Sự phát triển của bào tử Bacillus và Clostridium có thể được kiểm soát bởi pH thấp và hoạt độ

nước thấp Tuy nhiên, những yếu tố trên vẫn không ngăn ngừa được sự phát triển

của Listeria monocytogenes ( Farber and Peterkin, 1991) và Escherichia coli

O157: H7 ( Reed, 1995 ) [10] [14] [23]

Sự hư hỏng của thịt lên men (xúc xích – nem chua)

Thịt lên men, được coi là một nhúm cú sự ổn định cao Điều này là do sựkết hợp của các yếu tố như: mức aw và hàm lượng ẩm thấp, gớa trị PH giảm, sựxuất hiện của các axit hữu cơ và nồng độ NaCl và NaNO2 cao Trong loại xúc xích

có đường kính lớn khả năng ụxi hóa- khử thấp gây nhiều ức chế hơn đối với sựphát triển của các sinh vật gây thối hỏng hiếu khí trong khi đó quá trình đóng góichân không hay trong điều kiện không khí thay đổi có tác động tương tự trong cácsản phẩm được thái nhỏ trước khi đóng gói Sự ổn định của các loại xúc xích lênmen khác nhau thì khác nhau, chỳng cú vai trò quan trọng tương ứng với của các

tác nhân ức chế khác nhau Xúc xích lên men khô là ổn định nhất và mức aw làmột trong những yếu tố quan trọng trước tiên Trái lại loại xúc xích bỏn khụ, cóthể nhân rộng có độ ổn định thấp nhất với hạn sử dụng ngắn và thường yêu cầubảo quản lạnh trong thời gian bảo quản Mức aw cao hơn có nghĩa là các yếu tố ứcchế khác như giá trị pH thấp và nồng độ NO2 thấp đó là nhân tố quan trọng hơntương ứng trong loại xúc xích này Trong các trường hợp, có tác động qua lại đáng

kể giữa các tác nhân ức chế, nó làm tăng một cách rõ rệt hiệu lực tổng thể của toàn

hệ thống Ví dụ như sự giảm giá trị pH làm tăng mức aw tới hạn trong khi nitritecũng ức chế mạnh hơn ở pH thấp Axit lactic và acetic được thừa nhận là đóng vaitrò quan trọng trong sự ổn định của xúc xích lên men nhưng ít nhất trong một sốtrường hợp hoạt tính ức chế vi sinh vật có hiệu quả của các loại axit này là có giớihạn

2 Nguy cơ không an toàn của sản phẩm thịt lên men

2.1 Sự phát triển của S aureus trong quá trình lên men

Sự tạo thành enterotoxin bởi Staphylococcus aureus (S aureus) là vấn đề

chủ yếu trong quá trình sản xuất thịt lên men mặc dù sự kiểm soát quá trình lênmen đã được cải tiến nhiều đã làm giảm rõ rệt phạm vi của các vấn đề đó trong

những năm gần đây S.aureus thường bị nhiễm từ thịt tươi mặc dù sự phát triển

thường bị hạn chế thậm chí ở nhiệt độ bảo quản cao do sức ép cạnh tranh trong

quần thể vi sinh vật có hại Tuy nhiên S aureus bị ức chế bởi hàm lượng NaCl và

nitrite cao và nó được thúc đẩy tuyển chọn trong sự xuất hiện của các thành phầnnày nếu sự bắt đầu quá trình lên men bị trì hoãn Sự phát triển và sự tạo thànhenterotoxin xảy ra nhanh dưới các điều kiện này và trong khi bản thân các sinh vật

bị chết, enterotoxin vẫn giữ lại trong các thời kỳ tiếp theo

Việc xác định chỉ tiêu vi sinh trong xúc xích lên men là phương phápnhằm đảm bảo sự an toàn của xúc xích lên men, có gợi ý rằng sản phẩm nờn cú ít

hơn cfu/g S.aureus ngay sau quá trình lên men.

2.2 Sự sống sót của các mầm bệnh vi khuẩn

4 10

Các loại thịt lên men là sản phẩm của thịt sống và sự vắng mặt của cácmầm bệnh vi khuẩn là không thể đảm bảo được Các điều kiện trong thịt thôngthường không cho phép sự sinh sôi nảy nở nhưng sự sống sót có thể kéo dài.

Salmonella góp phần gây độc cho thực phẩm đối với sự tiêu dùng salami ở Úc, Ý

và hầu hết hiện nay là ở Anh, tại đó sản phẩm salami-snack có dính dáng tới Sản

phẩm đú cú thời gian chế biến rất ngắn và có thể thúc đẩy sự sống của Salmonella.

Listeria monocytogens được phân lập từ thịt lên men và theo các lý lẽ của

dịch tễ học thì sự tiêu dùng của salami được thừa nhận là nhân tố nguy hiểm đốivới listeriosis ở Mỹ

Nói chung S aureus được coi là gây nguy hiểm chỉ trong giai đoạn phát

triển ở thời kỳ đầu của quá trình lên men, nhưng một sự bùng nổ về sự độc hại củathực phẩm được ghi lại mà trong đó sự phát triển và sự tạo thành enterotoxin xảy

ra trong sản phẩm cuối Thịt lên men có liên quan tới mức aw cao và có chứa nồng

độ NaCl thấp tương đối và thành phần các tác nhân bảo quản Kết quả là khả năng

ổn định phụ thuộc nhiều vào giá trị pH thấp Việc lạm dụng nhiệt độ trong quátrình bảo quản dẫn đến sự phát triển của nấm mốc và sự chuyển hóa lactate, màđiều này làm tăng giá trị pH tới một mức mà tại giá trị đó sự phát triển và sự sinhđộc tố có thể xảy ra

2.3 Sự tạo thành Mycotoxin ( độc tố nấm mốc)

Nấm mốc sinh mycotoxin được phân lập cả trong loại xúc xích lên menđược làm chín bởi mốc và cả trong loại bị nhiễm mốc Một số nghiên cứu cho thấyrằng sự tạo thành mycotoxin bị ức chế bởi nhiệt độ bảo quản thấp, mức aw giảm

và ở các sản phẩm có hun khói Trái lại một số loài thuộc chủng Aspergillus cho

thấy rằng nó sinh aflatoxin ở mức cao trong quá trình phát triển trên xúc xích lên

men Vai trò của các chủng khởi động cho thấy ở nhiệt độ thấp cả Lactobacillus và

Pediococcus đều cho thấy khả năng ức chế sự tạo thành aflatoxin [9].

Việc lạm dụng nhiệt độ trong quá trình bảo quản dẫn đến sự phát triển củanấm mốc và sự chuyển hóa lactat, mà điều này làm tăng giá trị pH tới một mức màtại giá trị đó sự phát triển và sự sinh độc tố có thể xảy ra

Các sản phẩm thịt nói chung và thịt lên men nói riêng là các cơ chất khôngthuận lợi đối với sự tạo thành mycotoxin thậm chí cả khi các sợi nấm phát triển ồ

ạt

Đối với một số sự đánh giá, các tranh luận về khả năng nấm mốc sinhmycototoxin trong thịt lên men làm sao lãng sự quan tâm đến vấn đề quan trọnghơn có liên quan tới việc lựa chọn loại nấm mốc làm chín Sự an toàn có thể đượcđảm bảo bằng việc cấy các chủng vào thịt lên men mà các chủng đó phải được biếtđến là không sinh độc tố và sau đó là sự quan tâm tới liệu các chủng có bắt nguồnngẫu nhiên có sinh mycotoxin hay không Tương tự như thế, với các loại xúc xíchđược làm chớn khụng do mốc nên chú ý đảm bảo rằng các điều kiện trong quátrình bảo quản và vận chuyển như là để ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc

2.4 Sự tạo thành các amin sinh học (biogenic amines)

Các loài thuộc chủng Lactobacillus góp phần sinh các amin sinh học như

histamine và tyramine Trong quá trình đề cacboxyl hóa cỏc aa, thành histidine vàtyrosine Sự xuất hiện của các amin sinh học với số lượng đáng kể có thể dẫn tới

sự tăng lên tới hạn huyết áp, kèm theo đau đầu, đỏ mặt và có thể là phát ban.Trong một số trường hợp, các triệu chứng thoạt tiên là thuộc dạ dày- ruột, bao gồmđột nhiên nôn mửa và tiêu chảy kèm theo đau bụng Sự bùng nổ được thừa nhận vềbệnh do sự xuất hiện của các amin sinh học diễn ra sau khi sử dụng các loại raumuối (lên men) và pho mát đặc biệt là ở các sản phẩm khác nhau như pho mátAnh(stilton) và Thụy sĩ Không có trường hợp xác thực nào kết hợp với việc tiêuthụ xúc xích lên men, nhưng sự phát triển về các triệu chứng như đau đầu và tiêuchảy thì có liên quan mật thiết với các amin sinh học Tuy nhiên sự sáng tỏ nàynên được xử lý cẩn thận vì hàm lượng nitrite cao có thể gây nên các tác độngtương tự đối với cảm nhận của người tiêu dùng để tránh nhầm lẫn

Các nhân tố ảnh hưởng tới sự tạo thành histamine trong sản phẩmMettwurst đã được nghiên cứu tỷ mỷ Sự tạo thành histidine xảy ra mạnh trong 2tuần đầu của giai đoạn chín,cần phải có mặt với số lượng lớn các vi khuẩn đềcacboxyl hóa tạo histidine và mức độ histidine cũng phải cao hơn đáng kể so với

chỉ tiêu Với mức độ như vậy được kết hợp với sự bảo quản thịt chưa được chếbiến ở nhiệt độ cao và/hoặc đối với thời kỳ vượt quá mức, việc bảo vệ chống lạiđáng kể sự tạo thành amin sinh học đạt được bởi việc sử dụng loại thịt có chấtlượng tốt làm nguyên liệu sống và bằng việc sử dụng các chủng khởi động màchúng không có hoạt tính decarboxyl hóa aa.

III Một số chỉ tiêu về vi sinh vật đối với sản phẩm thịt lên men ( nhóm sản phẩm ăn ngay ).[1]

Theo tiêu chuẩn của Food Safety Standard of Australia & New Zealand:

Bảng 1.1: Giới hạn cho phép chỉ tiêu vi sinh vật đối với sản phẩm

thịt lên men theo tiêu chuẩn Food Safety Standard of Australia & New Zealand

Các chủng gây

bệnh

Chất lượngtốt

Chấp nhậnđược

Không tốt Tiềm ẩn mối

Phát hiện ra

Listeria

monocytogenes

Không cótrong 25 g

> 102

Bảng 1.2 Giới hạn cho phép chỉ tiêu vi sinh vật đối với sản phẩm ăn liền (Salami

và xúc xích lên men) của Ireland

Tiêu chuẩn Chất lượng vi sinh vật ( CFU/g) (a)

Đạt tiêuchuẩn Chấpnhận Không tốt(b) Tiềm ẩn mốinguy(c)Tổng số khuẩn lạc hiếu

khí ( 300C/48h) N/A 103-<104 104 N/ANhóm vi sinh vật chỉ thị

Enterobacteriaceae <100 100-<104 104 N/A

Nhóm gây bệnh

Ghi chú N/A : (không được phép)

Họ Enterobacteriaceae bao gồm nhiều loại vi khuẩn tìm thấy trong hệ

đường ruột của con người và động vật kể cả những loài gây bệnh như Salmonella

và Shigella Các loài thuộc Enterobacteriaceae là những chỉ thị hữu dụng nhằm chỉ

ra tình trạng nhiễm khuẩn trong quá trình chế biến

Một lượng > 104 / g sản phẩm có mặt trong sản phẩm là không chấp nhậnđược đối với loại sản phẩm ăn liền như xúc xích lên men

Escherichia coli.

Sự có mặt của E coli trong các sản phẩm ăn liền là không thể chấp nhận

được bởi nó chỉ ra tình trạng vệ sinh nghèo nàn và dễ dàng có những sự nhiễmkhuẩn khác

Sản phẩm ăn liền nờn cú lượng số E coli là < 3 và số tế bào E coli > 100 /g

là không thể chấp nhận được

Salmonella được báo cáo là gây độc đối với sự tiêu dùng salami ở Úc, Ý và

hầu hết hiện nay là ở Anh, nhiều nhất là sản phẩm salami-snack, một loại sản

phẩm có thời gian chế biến rất ngắn Tuy nhiên trong các trường hợp, Samonella

không có khả năng phát triển trong xúc xích lên men nếu sự nhiễm tạp của nóthấp Trong các dạng salami được sản xuất ở Úc, sự axit hóa bởi các chủng khởi

động có ảnh hưởng một cách rõ rệt hơn đối với Salmonella so với sự axit hóa bởi

glucono-δ-lactone

Ở Việt Nam hiện chưa có tiêu chuẩn cụ thể cho loại sản phẩm này, do đóchúng tôi tham khảo một số tiêu chuẩn trên để đánh giỏ chất lượng sản phẩm nemchua và xúc xích lên men

B.ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC Cể HOẠT TÍNH SINH HỌCVÀCHẾ PHẨM TỎI TRONG SẢN PHẨM THỊT LÊN MEN.

I Sự lên men tự nhiên

gram âm nổi trội trong thịt và các vi khuẩn sinh hương gram dương bao gồm Micrococcus và các loài Staphylococcus coagulase dương và âm, cũng như các loại LAB Người ta chứng minh rằng quá trình lên men theo thứ tự bất đầu là các loài Enterobacteriaceae, tiếp theo là Enterococcus và cuối cùng là Lactobacillus và Pediococcus.Ở những loại xúc xích có bổ sung nitrate mà không có mặt của nitrite thỡ cỏc loại vi khuẩn có thể phát triển rộng hơn và điều này làm cải thiện chất lượng của xúc xích lên men khô một cách rõ rệt Với những loại xúc xích được lên men theo đúng công nghệ thì LAB phát triển nhanh và đạt mức cfu/g sau 2-5 ngày lên men Sự giảm giá trị pH tương ứng làm cho chủng Pseudomonas và các loại cầu khuẩn gram âm nhạy cảm với axit khác bị tiêu diệt trong vòng 2-3 ngày, mặc dù có nhiều loài có thể chống chịu axit hơn như Salmonella, có thể tồn tại trong thời kỳ kéo dài Số lượng LAB có xu hướng giảm sau khi đạt được cực đại, mặc dù trong các loại xúc xích được chín bởi nấm mốc thì thời kỳ thứ hai của quá trình sinh trưởng thường diễn ra khoảng sau 15 ngày trùng với sự tăng giá trị pH do sự chuyển hóa lactate Sự trì hoãn quá trình lên men lactic ban đầu và sự giảm chậm giá trị pH tạo thuận lợi cho sự phát triển của S aureus và có thể sinh enterotoxin Lượng mùi hương thấp cũng có thể do sự phát triển của các vi sinh vật không mong muốn.

Các loài thuộc chủng Lactobacillus là các LAB nổi trội trong quá trình lên men xúc xích tự nhiên Các loài xuất hiện phổ biến nhất là Lb bavaricus,

Lb curvatus, Lb farciminis, Lb plantarum và Lb sake Lb sake có thể là loài đóng vai trò quan trọng nhất, tiếp đó là Lb curvatus Các loài không mong muốn như loài Lb viridescens sinh H2O2, cũng có thể xuất hiện với

số lượng rõ rệt Pediococcus xếp thứ 2 sau chủng Lactobacillus, nó nổi trội hơn về số lượng trong quá trình lên men Các loài Pd damnosus, Pd acidilactici và Pd pentasacceous đều đóng vai trò quan trọng Lactococcus

và Leuconostoc thường chỉ xuất hiện với số lượng nhỏ, mặc dù chủng Leuconostoc với số lượng lớn thường đi kèm với các loại xúc xích kém chất lượng.

II Sự lên men thịt có cấy chủng khởi đầu (starter culture)[22]

1 Nhóm vi sinh vật hay sử dụng làm chủng giống trong sản xuất thịt lên men

Để định hướng quá trình lên men và nâng cao chất lượng của nhóm sản phẩm thịt lên men trên thế giới việc lựa chọn và sử dụng các chủng cấy

vi sinh vật có lợi vào công nghệ sản xuất thịt lên men đã được thực hiện từ rất lâu Các chế phẩm vi sinh vật thương mại được bán rộng rãi trên cơ sở cỏc nhúm vi sinh vật như sau:

Vi khuẩn:

- Các chủng LAB được sử dụng phổ biến: Lactobacillus ( Lb plantarum, Lb curvatus, Lb rhamnosus, Lb sakei…); Pediococcus (P pentosaceus); Lactococcus lactis.

- Micrococcaceae ( Micrococcus varians).

- Staphylococci ( Staphylococcus carnosus, S .xylosus )

Nấm men: Debaryomyces hansenii, Candida famata

Nấm mốc: Penicillium nalgiovense, P chrysogenum, P camemberi

Các chủng LAB được lựa chọn làm chủng khởi động trong xúc xích lênmen phải đáp ứng một số các tiêu chuẩn như sau :

- Phải có khả năng cạnh tranh hiệu quả đối với các LAB bản thể.

- Phải sinh axit lactic với số lượng đầy đủ.

- Phải có khả năng chống chịu NaCl và có thể phát triển ở nồng độ muối cao ( có thể là 6% ).

- Phải có khả năng chống chịu được NaNO2 và có thể phát triển ở nồng độ

ít nhất là 100mg/kg.

- Phải có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 15-40°C, tối ưu ở 37°C.

30 Phải là chủng lên men đồng hình.

- Phải không phân giải protein ( must not be proteolytic ).

- Phải không sinh H2 O2 với số lượng lớn

- Nờn có catalase dương

- Nên có khả năng phân giải nitrate

- Nên có khả năng tăng cường hương cho xúc xích thành phẩm

- Nên không có khả năng sinh các amin biogenic

- Nờn không sinh nhày nhớt

- Nên có khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây hư hỏng và các vi sinh vật không mong muốn.

- Nên có khả năng chống chịu hoặc kết hợp với các chủng khởi động khác.

Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết nhằm mục đích:

 Rút ngắn thời gian lên men

 Tăng tốc độ cho quá trình làm chín

 Loại bỏ những nguy hiểm do các vi sinh vật khác

 Loại các vi sinh vật không mong muốn và các vi sinh vật gõybệnh bệnh

 Tăng chất lượng sản phẩm

 Làm sản phẩm ổn định và bảo quản tốt hơn

 Góp phần đưa lại hương vị đặc trưng

2 Vi khuẩn lactic sinh bacterioxin ứng dụng trong sản xuất thịt lên men

Cơ chế kháng khuẩn hay cạnh tranh môi trường của LAB là do gây ra

sự nhiễu vi sinh vật đối với các vi khuẩn gây hỏng và gây bệnh thông qua một số cơ chế như cạnh tranh oxi và dưỡng chất, cạnh tranh vị trí tấn cụng/bám dính và sản sinh ra một loạt các chất ức chế: axit lactic, axetic, acetaldehit, diacetyl, hydroperoxit, reuterin… và bacterioxin Trong đó

bacterioxin một thành phần kháng khuẩn có bản chất protein chỉ được sinh

ra bởi một số loài Nhiều loại bacterioxin có phổ kháng khuẩn khá rộng đặc biệt là có khả năng kháng được các vi sinh vật gây bệnh, sinh độc tố Do có bản chất là protein nên rất dễ bị phân huỷ bởi proteaza trong hệ thống tiêu hóa, do vậy hiện nay trên thế giới nó được quan tâm đặc biệt nhằm ứng dụng trong chế biến và bảo quản thực phẩm

Bacterioxin là các polipeptit có tính kháng khuẩn được sản sinh trênribosome hoặc các protein có tác dụng kháng khuẩn khi ở dạng thành thục, chốnglại một phổ hẹp các loài vi khuẩn họ hàng gần gũi (Jack và cộng sự, 1995) Tuỳthuộc vào bản chất protein của mình mà bacteriocin có thể bị vô hoạt bởi cácproteaza trong đường ruột Phần lớn các bacterioxin đã biết cho đến nay là cácphân tử cation có tới 60 phần tử axit amin và bền nhiệt

Bacterioxin do vi khuẩn lactic sinh ra là các phân tử protein hay peptit mang điện tích dương, kích thước nhỏ (gồm 30-60 axit amin), có điểm đẳng điện cao và có khả năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ gần với vi khuẩn sinh ra bacterioxin đó Nhiều chủng vi khuẩn lactic sản sinh bacterioxin là: Latococcus sub lactic (nisin), L acidophilus (lactacinB,F), L brevis, L casei, L carnis, L delbrueckii, L fermenti, L gasseri, L helveticus, L plantarum…

2.1 Bacterioxin của vi khuẩn lactic [11]

Theo hệ thống do Klaenhammer công bố, các bacterioxin được chia thành 4 nhóm như sau:

a- Nhóm I: Nhóm lantibiotic gồm các bacterioxin có phân tử lượng nhỏ hơn

5 kDa, có chứa các axit amin dị thường lanthionin, tiêu biểu là nisin, lactixin

481, carnoxin U149 và lactoxin S Chúng là các peptit nhỏ, phân biệt với cácbacteriocin khác nhờ các thành phần axit dehydroamino và axit amin thioeter củachúng

b- Nhóm II: Nhóm bacterioxin có phân tử lượng nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt

nhưng không chứa lanthionin (<10KDa), được chia thành 3 phân nhóm trên cơ

sở hoặc là trật tự khác biệt của đầu amin của chuỗi mạch, sự tạo thành các lỗ

bacteriocin II được chia nhỏ thành 3 phân nhóm khác nhau Nhóm IIa gồm cácbacteriocin là các peptit đơn bao gồm nhóm giống Pediocin ức chế Listeria;Nhóm IIb là các bacteriocin có các peptit đôi tiêu biểu là Lactococxin G, lactococxin M và lactixin F và nhóm IIc là các bacteriocin được tiết ra phụ thuộcthứ cấp (Von Heijne, 1986, 1988) Lactococin B

c- Nhóm III: Nhóm bacterioxin có phân tử lượng lớn hơn 30 kDa, không bềnnhiệt Nó bao gồm nhiều enzim ngoại bào có tính kháng khuẩn (hemolisins vàmuramidases) mà có thể bắt chước hoạt động sinh lý của bacteriocin bền nhiệt, tiêu biểu là helvetixin J, helvetixin V-1829, acidophilucin A, lactticin A và

B Nhóm này bao gồm cả các enzim ngoại bào làm tan vi khuẩn.

Bảng 2.1: Đặc điểm của bacterioxin của vi khuẩn lactic

(theo Vuyst và Vandamme, 1993)

Bacteriocin Vật sản xuất TrườngỨc

chế*

Số lượngaxit amin Vị trí

Nhóm I: Lantibiotics

Nisin (A và Z) Lactococcus lastic Rộng 34 Transposon Lacticin 481 Lactococcus lastic Rộng 27 Plasmit Lactocin S Lactobacillus sake Rộng 37 Plasmit Carnocin U149 Carnobacterium

Nhóm II: Non-lantibiotic, nhỏ, bền nhiệt

Diplococcin Lactococcus lastic Hẹp 51 Plasmit Lactococcin A Lactococcus lastic Hẹp 54 Plasmit Lactococcin B Lactococcus lastic Hẹp 47 Plasmit Lactococcin M Lactococcus lastic Hẹp 48 Plasmit Lactacon F Lactobacillua Hẹp 57&48 Plasmit

Sakacin A Lactobacillus sake Rộng 41 Plasmit Curvacin A Lactobacillus

Sakacin P Lactobacillus sake Rộng 41 Chưa biếtCarnobacteriocin

A&B Carnobacterium piscicola Rộng 53&48 Plasmit

Pediocin AcH Pediococcus

( * Trường ức chế hẹp là chỉ các bacteriocin chỉ có ảnh hưởng lên các loài sản

xuất)

d- Nhóm IV: Nhóm bacterioxin phức hợp là nhóm trong cấu trúc của chúng

ngoài protein ra còn chứa một hay nhiều loại chất khác là các lipit hoặc mộtnửa hydrocacbon cùng với protein, tiêu biểu cho nhóm này là plantarixin S,leuconoxin S, lactoxin 27.

Cho đến nay, nhóm bacteriocin I và II là nhóm được nghiên cứu kỹ nhất vìchúng đa dạng nhất và có nhiều ứng dụng trong công nghiệp Các LAB có khảnăng sản sinh bacterioxin trong thịt được công bố đa số thuộc về nhóm I và II.Đặc tính bacterioxin

Tính chất công nghệ quý báu của bacterioxin là vẫn giữ được hoạt tính

ở một số điều kiện xử lý khác nhau như nhiệt độ, pH, dung môi hữu cơ… Plantacin rất bền sau khi bảo quản ở nhiệt độ 4 - 20C, hoặc xử lý với dung môi hữu cơ như metanol, cloroform, axetonitrit và nhiệt độ 1000C trong 60 phút hoặc 1210C trong 10 phút Lactacin B, Lactacin F chịu được 1000C trong vòng 1giờ được dùng nhiều trong việc sản xuất thực phẩm đóng hộp

Bản chất các bacterioxin là peptit nên bị phân hủy bởi hệ enzim proteaza của hệ thống tiêu hóa vì vậy không có hại đối với cơ thể.

Với các đặc tính trên của bacterioxin đã mở ra triển vọng ứng dụng rộng lớn của bacterioxin trong công nghiệp thực phẩm

2.2 Ứng dụng của bacterioxin trong công nghệ thịt và thịt lên men [12]

a- Phương pháp ứng dụng bacterioxin trong các sản phẩm thịt theo bốn biện pháp cơ bản sau :

Bổ sung chủng LAB thuần khiết, có sản sinh bacterioxin và có thể pháttriển được vào trong thực phẩm Biện pháp này là cách trực tiếp để phối hợp đồngđều bacterioxin vào trong các sản phẩm thực phẩm Sự thành công của nó phụthuộc vào khả năng phát triển và sản xuất bacterioxin của chủng bổ sung trong cácđiều kiện kỹ thuật và môi trường (nhiệt độ, pH, chất phụ gia, …) của thực phẩm

Vì thịt không thể thanh trùng paster trước khi bổ sung chủng LAB nên các chủngLAB để ngăn ngừa sinh học hoặc để lên men thịt phải có khả năng cạnh tranh với

hệ vi sinh vật tự nhiên

Bổ sung các chế phẩm bacteriocin thô, dịch lên men hoặc dịch cô đặc thunhận được từ quá trình nuôi LAB sản sinh bacteriocin trong các chất nền phức tạp.Cách này tránh được việc sử dụng các hợp chất tinh chế

Bổ sung các chất đối kháng đã tinh chế hoặc bán tinh chế Theo cách này,liều lượng bacteriocin phải chính xác hơn và do đó phải được ước lượng trước.Tuy nhiên, ứng dụng của nó còn hạn chế, tuỳ theo tập quán sử dụng phụ gia củatừng nước

Bổ sung LAB ưa nhiệt ụn hoà như là yếu tố bảo quản ‘an toàn dự phòng’ đểchống lại sự lạm dụng nhiệt độ Trong trường hợp này, các chủng bảo vệ sinh họcsẽ giữ ở mật độ như ban đầu trong các điều kiện kiện giá lạnh còn trong điều kiệnlạm dụng nhiệt độ, chúng sẽ phát triển cạnh tranh vượt trước các vi khuẩn gâybệnh Vì vậy tránh được những nguy hại cho sức khoẻ

b- Ứng dụng của các bacterioxin trong thịt và các sản phẩm thịt [12]

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy LAB sinh ra từ thịt như là một nguồncung cấp các chủng sản xuất bacterioxin Tuy nhiên chỉ một số bacterioxin đượcnghiên cứu như là chất bảo quản sinh học trong thực phẩm và đặc biệt là trong cácsản phẩm thịt bao gồm nisin A, P và K và leucoccin A, đặc biệt là pediocin PA-1/AcH…

Nissin dạng phun xịt (AmbicinR, 5000AU/malolactat) có hiệu quả loại trừ

sự ô nhiễm trên bề mặt thịt Sự phối hợp của nitrit với nisin 1000-10000 IU/g có

hiệu quả chống lại Clostridium và một vài vi khuẩn gây bệnh Gram dương khác như Lissteria và Staphylococcus trong xúc xích Đức, thịt lợn nghiền nhão và thịt

thô Trong xúc xích lên men kiểu Mỹ sự sản sinh Pediocin trong xúc xích ngăn

ngừa sự phát triển của L monocytogenes ngay khi không có độ chua Hoạt động

của Pediocin PA-1 không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của chất béo hay proteintrong thực phẩm, còn tác động của Pediocin và axit lactic lại hỗ trợ lẫn nhau Quá

trình chế biến Wisonsin sử dụng chủng sản sinh Pediocin P acidilactici cùng với

cacbohydrat đã được USDA phê chuẩn để sử dụng trong thịt muối có hàm lượngnitrit giảm để trợ giúp ngăn ngừa sự sản sinh độc tố botulinum do sự bùng phát

của Cl botulinum Quá trình này cũng được cải tiến để sử dụng trong các thực

phẩm bảo quản lạnh có độ axit thấp như salat gà ở pH 5,1

c- Những hạn chế của bacterixin và biện pháp tăng phạm vi ứng dụng

Một cản trở trong việc ứng dụng các bacteriocin làm chất bảo quản sinh họccho thịt là do chúng có khu vực vật chủ hẹp, chỉ ảnh hưởng tới các vi khuẩn họhàng gần gũi Tuy nhiên các chủng sản sinh bacteriocin có thể có tác động dươngtính đối với các vi khuẩn Gram (-) theo cách gián tiếp như là tạo ra một hệ vi sinhvật chiếm ưu thế và loại trừ các vi sinh vật Gram (-) ưa lạnh

Trái lại với vi khuẩn G (+), vi khuẩn G(-) , như Escherichia coli O157 :H7,

có thêm vào màng trong một màng ngoài mà những kháng khuẩn kỵ nước khôngthể xuyên qua Lớp trong của màng ngoài thì được tạo thành bởiglyserophospholipid, trong khi lớp ngoài thì được tạo ra bởi lipopolysaccharide.Lipopolysaccharide bao gồm một phần chất béo kỵ nước bên trong và một phần

heteropolysaccharide ưa nước bên ngoài, mà được ổn định bởi cation hoá trị II(như Mg 2+) Màng nguyên vẹn bên ngoài có thể bị phá hỏng bởi sự thấm qua, như

là EDTA, a xit citric hoặc a xit lactic, mà kháng khuẩn kỵ nước có thể xuyên vào

tế bào G (-) Tác động của LAB trong tế bào có thể một phần dựa trên việc tạo ranồng độ tương ứng của a xit lactic trong môi trường vi sinh, mà kết hợp với chấttẩy trong ruột như muối mật để kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn gây độc G (-)

Các biện pháp xử lý khác nhau đã được thử nghiệm làm cho vi khuẩn Gram(-) nhạy cảm với bacterioxin, đặc biệt là nisin Việc sử dụng nisin cùng với tácnhân có càng kẹp (EDTA, Tween, Triton-X 100) đã mở rộng phổ kháng khángkhuẩn của nisin tới cả các vi khuẩn Gram (-) (bằng sáng chế US 4 980 163) Sựgõy sốc về tính thẩm thấu (hàm lượng muối cao) cũng đã được thử nghiệm như làphương tiện để vi khuẩn Gram (-) nhạy cảm hoá với nisin

3 Các hợp chất kháng khuẩn từ tỏi và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 3.1 Tỏi và các hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật [8][15]

Lịch sử phát hiện và sử dụng tỏi làm gia vị và làm thuốc Các nhà nghiêncứu thực vật coi Trung Á là nơi phát sinh của cây tỏi, và Allium sativum (tên khoahọc của tỏi) dường như đã được con người sử dụng từ thời đại đồ đá mới Lần đầutiên nhà khoa học người Đức Wertheim (1844 - 1845) đã chứng minh được bảnchất của các chất gõy mựi ở tỏi mà cũng là các chất có tác dụng sinh lý và dược lýcủa tỏi chính là các hợp chất sulfur Hàm lượng các hợp chất sulfur có trong tỏicao khác thường so với trong cỏc cõy thực vật khác (1,1-3,5%), và nếu làm mất đi

từ cỏc tộp tỏi một lớp hợp chất sulfur dễ bay hơi gọi là các thiosulfinates trong đó

có rất nhiều allicin thì sẽ là mất đi tất cả hoặc hầu hết tác dụng chống vi khuẩn của

tỏi; tác dụng chống nấm của tỏi, tác dụng chống sơ vữa động mạch, tác dụng chống huyết khối , và tác dụng hạ thấp lipid máu (Silber,1933)

cuốn hơi nước, tỏi ngâm trong dầu thực vật hoặc ete, tép tỏi ngâm dấm…Hệ cáchợp chất sulfur trong các chế phẩm tỏi khác nhau không giống nhau do ảnh hưởngcủa các tác động (tác động cơ học, tác động nhiệt…) trong quá trình chế biến

4 Ứng dụng hoạt tính kháng vi sinh vật của tỏi trong công nghệ thực phẩm

Sau những nghiên cứu mang tính cơ sở xác định các thành kháng khuẩn củatỏi thì hoạt tính kháng vi sinh vật của tỏi đã được nghiên cứu rất nhiều Năm 1979,Dankert et al đã nghiên cứu nước tỏi tươi trong môi trường thạch khuếch tán đốivới 5 loại vi khuẩn Gram (-), 3 loại vi khuẩn Gram (+) và 2 loài nấm men, kết quả

là tất cả các vi sinh vật kiểm tra đều bị ức chế bởi nước ép tỏi

Các nhà ngiờn cứu ở Iran, trong khi đánh giá các loại dầu từ các loại cỏ và

gia vị, đã nhận thấy rằng dầu tỏi ra một dải ức chế kháng lại Listeria

monocytogenes serotype 4a (food borne) trong các phương pháp khuếch tán thạch.

Naganawa (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ajoen và Diallyl disulfides(DAD) (một hợp chất chính có trong dầu tỏi) lờn nấm và vi khuẩn Các kết quả đãchỉ ra rằng ảnh hưởng kháng vi sinh vật có thể là do sự có mặt của liên kết disulfit

và nhóm sulfinyl trong mỗi chất.Các giá trị MIC (minimum inhibitory

concentration) của các vi khuẩn được tìm ra là: Bacillus cereus (300àg/ml),

Bacillus subtilis (>500g/ml), Staphyloccocus aureus (400àg/ml), Mycobacterium smegmatis(>500g/ml), Mycobacterium phlei (>500g/ml), Mycrococus luteus

(>500àg/ml), Streptococus sp (>500àg/ml), Streptomyces griseus (>500àg/ml),

Escherichia coli (400àg/ml), Klebsiella pneumonie (>500àg/ml), Xanthomanas maltophilia (>500àg/ml), Pseudomonas aeruginosa ( không có nồng độ ức chế

nào vượt quá 500àg/ml)

Những kết quả nghiên cứu trên đã khẳng định hoạt tính kháng vi sinh vậtcủa các hợp chất từ tỏi là rất rộng bao gồm cả các vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)đặc biệt tỏi ức chế được nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, sinh độc tố và cả nhiều loạinấm men, nấm mốc có hại Điều đó làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo đểứng dụng tỏi vào trong các sản phẩm thực phẩm với mục đích bảo quản

Chung,C.H (1997) một nghiên cứu trực tiếp đối với sản phẩm lên men làkim chi thì thấy rằng việc bổ sung nước ép tỏi đã loại được hoàn toàn vi khuẩn

Escherichia coli ra khỏi sản phẩm trong 7 ngày đầu tiên lên men kim chi Cũng

một nghiên cứu về sản phẩm cá lên men lactic chứa nhiều tỏi, Paludan-Muller thấyrằng tỏi có một vai trò kép trong các sản phẩm này ở nồng độ muối thấp: (1) nhưmột chất nền cho sự lên men; (2) như một chất ức chế vi khuẩn G- và nấm men;

(3) sự có mặt và tăng nhanh của LAB đặc biệt các loài Lactobacillus ( L casei, L.

pentosus, L plantarum) được tìm thấy ở cuối quá trình lên men đã chứng tỏ việc

bổ sung tỏi vào các sản phẩm lên men không những ức chế được các vi sinh vật cóhại đồng thời còn tăng cường quá trình lên men lactic

Lee và S.B.Tak đã tiến hành nghiên cứu phối hợp sử dụng các chất bảoquản có nguồn gốc tự nhiên gồm axit lactic (0,1M), dịch chiết hạt cây bưởi chùm(2000ppm), chitosan (2%) và AGE (2%) để tăng thời gian bảo quản thịt bò tươi ởnhiệt độ thấp (-5, 0, 5 oC) Kết quả cho thấy đã kéo dài thời gian bảo quản sảnphẩm ở cả ba chế độ nhiệt độ từ 10 ngày lên đến hơn 15 ngày thông qua khảo sát

các chỉ tiêu về tổng E coli, và hàm lương VBN (volatile basic nitrogen - hợp chất

nitơ bay hơi )

Hay một nghiờn cứu khác của Bhurinder Singh về việc sử dụng kết hợp

AGE và Nisin trong việc kháng lại 6 loài khác nhau của chủng Listeria

monocytogenes trong đó có cả loài đột biến kháng lại nisin Kết quả thu được thật

tuyệt vời khi mà hỗn hợp đó kháng lại tất cả các chủng kiểm định kể cả chủngtrước đó kháng lại nisin Tác động có tính tương hỗ đó của tỏi đối với nisin rất có

ý nghĩa đối với các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống khi mà trong cácthực phẩm đó tỏi đóng vai trò là một gia vị

Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy việc ứng dụng tỏi và các chế phẩm từtỏi như một chất bảo quản thưc phẩm có một tiềm năng vô cùng to lớn đặc biệt đốivới các sản phẩm thực phẩm có sử dụng tỏi như một gia vị Tỏi là gia vị có mặt hầu hết trong các sản phẩm thịt lên men, được sử dụng ở nhiều dạng như tỏi tươi, bột tỏi hay dầu tỏi Hàm lượng tỏi có trong các loại xúc xích lên men

thay đổi từ 0- 5 thậm chí 10% đối với tỏi tươi Riêng đối với một số sản phẩm lên men có sử dụng tỏi cho thấy vừa ức chế tốt vi khuẩn Gram (+), G(-), nấm men, và một số chủng gây hại… Không ức chế các chủng lactic

có lợi cho quá trình lên men Hỗ trợ nisin kháng lại các chủng đột biến kháng lại nisin và là chất nền cho quá trình lên men tốt hơn cả bột gạo.

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

Chế phẩm BIO-NC là hỗn hợp 4 loại vi khuẩn lactic cú cỏc đặc tính tốt: 2chủng sinh bacteriocin kháng khuẩn tốt và một chủng probiotic và 1 chủng thủyphân protein được sử dụng với tỷ lệ 1/1/1/1 được nghiên cứu từ trước.

Bột tỏi được sử dụng như một phụ gia tạo hương vị và có đặc tính khángkhuẩn tốt được sản xuất ở phòng thí nghiệm (Tỏi tươi bóc vỏ thái lát mỏng 1mmsau đó sấy ở nhiệt độ 50 – 550C trong 8 tiếng đạt độ ẩm < 7% Nghiền mịn và bảoquản lạnh 0 – 40C

Quy trình công nghệ sản xuất thịt lên men:

1.1.Quy trình sản xuất nem chua trong nghiên cứu:

Chế phẩmBIO-NC

Thịt lợn nạcThái miếng

Xay nhuyễnPhối trộn

Thuyết minh quy trình công nghệ:

1 Nguyên liệu chính:

* Sử dụng nguyên liệu chính là thịt nạc mông hoặc thịt nạc thăn

- Loại bỏ các phần thịt kém chất lượng như mô xương, mô sụn còn sót lại,loại bỏ phần thịt bị bầm dập, tụ mỏu

* Bì phải được làm sạch lụng sút, rửa sạch, và được chần chín sơ bộ đến khi

bì vừa trong là được và được để làm nguội để đưa đi thái sợi mảnh

2 Căt miếng.

- Thịt lợn được đưa đi cắt miếng, cắt thành từng miếng nhỏ tạo điều kiệncho quá trình xay được dễ dàng

3 Băm nhuyễn và phối trộn:

Thịt được xay nhuyễn và mịn với tốc độ nhanh rồi băm nhuyễn phối trộncùng gia vị, phụ gia, bột tỏi, chế phẩm vi sinh vật sau đó bì được đưa vào phối trộnnhanh trong 1- 2 phút để tránh bị cắt vụn

4 Định lượng và bao gói:

Nguyên liệu sau khi được trộn thành một khối đồng nhất được đem đi địnhlượng sau đó được bao gói bằng bao bì lá chuối khô được lau sạch hoặc bao bì PE.Trong quá trình bao gói bằng túi PE cú thờm công đoạn hút chân không để tạođiều kiện yếm khí cho quá trình lên men Tuỳ theo điều kiện cụ thể mà bao gói vớikhối lượng 60 g ( đường kính nem 30 mm ) Quá trình bao gói phải đảm bảo kín

để tạo điều kiện yếm khí và phải đảm bảo vệ sinh

5 Lên men:

Nem sau khi được bao gói xong được để lên men Sử dụng thiết bị ổn nhiệt

ổn ẩm để ổn định nhiệt độ, độ ẩm môi trường lên men Thời gian lên men thường

là 24 – 48 h thì nem đạt độ chín vừa phải Nem chua chớn cú trạng thái rắn, khụ,dũn dai, mùi thơm của thịt lên men, vị chua vừa ăn

Thuyết minh quy trình công nghệ:

- Mỡ :

Là nguồn cung cấp chất béo

Mỡ có tác dụng làm giảm hoạt độ nước khối bán thành phẩm tăng độ dính,

độ bộo,làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm

Mỡ lạnh đông có màu trắng đục, mùi thơm tự nhiên của thịt mỡ

4 Nhồi vào bao bì:

Mục đích:

- Tạo cho sản phẩm có hình dạng, kích thước ổn định và đồng nhất

Nguyên liệu sau khi được trộn thành một khối đồng nhất được định lượngsau và nhồi vào bao bì ruột lợn khô.Quá trình nhồi phải đảm bảo chặt và đều, vỏbao căng đều và buộc kín 2 đầu khối lượng mỗi xúc xích ≈ 40 – 50g

5 Lên men:

Xúc xích sau khi được bao gói xong được để lên men Sử dụng thiết bị ổnnhiệt ổn ẩm để ổn định nhiệt độ, độ ẩm môi trường lên men Thời gian lên menthường là 48 h thì xúc xích đạt độ chín sinh hóa (pH đạt 4,7)

6 Xử lý nhiệt

Xúc xích sau khi lên men được xử lý nhiệt trong thiết bị sấy tuần hoànkhông khí có nhiệt độ 700C trong thời gian 1h (tâm sản phẩm đạt 630C trongkhoang 25 – 30 phút)

7 Bảo quản

Sau khi lên men trong khoảng 30h nem đạt độ chín sinh hóa (kết quảnghiên cứu trước) được đưa đi bảo quản ở hai điều kiện nhiệt độ là 100C và 20C

2 Hoá chất và môi trường: [2]

2.1.Môi trường MRS đặc ( phân lập và đếm vi khuẩn lactic)

2.4 Môi trường VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar) ( Phân lập và đếm tổng

Enterobacteria)

-Cân điện tử FARORIUS-NhậtCân điện tử FARORIUS-Nhật

-Thiết bị khử trùng HYLAYAMA HV 25/50/85/100-Nhật Thiết bị khử trùngHYLAYAMA HV 25/50/85/100-Nhật

-Máy đo pH 320 pH Meter METTLER POLED Máy đo pH 320 pH MeterMETTLER POLED

-Máy đo Quang Model 80-2088-Anh Máy đo Quang Model 80-2088-Anh-Máy hút chân không (Đài Loan) Máy hút chân không (Đài Loan)

-Mỏy dỏn tỳi-Trung Quốc Máy dán túi-Trung Quốc

-Tủ ổn nhiệt ổn ẩm Comstant Temp and Humidity Chamber J-RHCL-B,JISCO,Hàn Quốc Tủ ổn nhiệt ổn ẩm Comstant Temp and Humidity Chamber J-RHCL-B,JISCO, Hàn Quốc

-Các thiết bị khác: tủ lạnh, lò vi sóng, máy xay … Các thiết bị khác: tủ lạnh,lò vi sóng, máy xay …

II Phương pháp nghiên cứu

1 Phương pháp hoá lý.

Phương pháp xác định pH

Cách tiến hành:

Cân 25 g mẫu xay kĩ với 50 ml nước cất, tráng sạch lại bằng 50 ml nước cấtnữa, đem đựng dung dịch vào cốc thuỷ tinh 250 ml.

Cắm điện cực đo pH vào

Ghi lại giá trị pH đo được trên đồng hồ

Trang trên 2 đĩa thạch môi trường MRS, lật ngược đĩa và nuôi ở 300C trong24-48 giờ sau đó đem quan sát và đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa Khuẩn lạcthường trắng đến trắng đục, bề mặt trơn bóng, kích thước khuẩn lạc nhỏ 0.1-0.5mm

C -Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

n1 - Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1(độ pha loãng thấp nhất)

n2 - Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng tiếp theo)

f1 - Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1

v - Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri

b.Xác đinh tổng số nấm mốc

Cơ sở

Trong quá trình sản xuất nem chua ngoài quá trình lên men lactic ra cũn cú

sự phát triển của nấm men và nấm mốc.Nấm men mốc có nhiều trong tự nhiên vàrất dễ nhiễm vào các sản phẩm thực phẩm làm hỏng hoặc biến đổi chất lượng sảnphẩm và hình thành độc tố mycotoxin rất nguy hiểm

Xác định số lượng nấm mốc có trong sản phẩm để đánh giá chất lượng, tìnhtrạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏngcủa sản phẩm

Nguyên tắc: Môi trường dinh dưỡng phải chứa chất ức chế sự phát triển của vikhuẩn là gentanicin

Cấy lên bề mặt thạch của môi trường OGYA lượng mẫu đã pha loãng nhấtđịnh và nuôi ở nhiệt độ 30 0C trong điều kiện hiếu khí , thời gian 48-72 giờ Đếmtất cả số khuẩn lạc có tạo hệ sợi mọc trên đó từ đấy suy ra lượng nấm mốc cótrong mẫu phân tích

Tiến hành: Làm tương tự như với vi khuẩn lactic

Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S.aureus) , hình cầu, Gram dương có khả

năng sinh ra nội độc tố gây ngộ độc thực phẩm Các tế bào thường liên kết thànhhình cỏc chựm nho, không tạo bào tử , không di động, có khả năng sinh coagulaselàm đông huyết tương Khi phát triển trong môi trường tào sắc tố có mầu từ trắngtới vàng sậm

Phương pháp tiến hành:

Cân 10g mẫu nghiền với 90ml nước cất vô trùng sau đó pha loãng tới độ

pha loãng cần thiết Trang trên môi trường chọn lọc Staphylococcus 110, lật ngược

nuôi trong tủ ấm 370C trong 24-72 giờ sau đó quan sát và đếm số khuẩn lạc nghingờ (màu sắc vàng nhạt, trắng ngà có thủy phân gelatin)

Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ là S aureus đã đếm được trờn cỏc đĩa

peptri,ỏp dụng công thức dưới đây để tính số lượng St aureus trung bình có trong1ml hay 1g mẫu thử:

N=C.R/n.f.vTrong đó

C -Tổng số khuẩn dạc đếm được trên tất cả các đĩa

n -Số đĩa pettri đã nuôi cấy

f -Hệ số pha loãng của mẫu

v -Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa peptri

R - Số khuẩn lạc là Staphylococcus aureus /tổng số khuẩn lạc nghi ngờ Tiến hành làm test khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ có phải S aureus

bằng thực hiện điện di sản phẩm PCS của các khuẩn lạc này so với sản phẩm PCR

của chủng S aureus ATCC 25923 chuẩn.

d Tổng số vi sinh vật đường ruột Enterobacteria ( theo National standard method of Health Protection Agency - UK ).

Cơ sở

Là nhóm vi khuẩn đường ruột bao gồm một số các vi khuẩn gram õm,khụng tạo bào tử , hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng lên menđường glucoza (+) và oxidaze (-)

Xác định lượng vi khuẩn đường ruột cho biết mức độ ô nhiễm và tình trạng

vệ sinh trong phân xưởng sản xuất, hay mức độ nhiễm phân của sản phẩm

Phương pháp tiến hành:

Chuẩn bị 10g mẫu nghiền với 90 ml nước cất vô trùng sau đó pha loãngthập phân tới độ pha loãng cần thiết trên môi trường chọn lọc cho nhóm vi khuẩnnày là VRBGA

Nhận xét phân loại và đếm khuẩn lạc hồng tới đỏ tía, đường kính khoảng 0.5 mm

có quầng tủa hay không để đưa đi kiểm tra lên men glucoza và oxidaze

Kết quả và tính toán

Có 5 loại khuẩn lạc nghi ngờ thuộc họ Enterobacteria có đặc điểm như sau:

A : Khuẩn lạc đỏ hồng, có quầng, khuẩn lạc tròn, bề mặt bóng lồi.

B : Khuẩn lạc đỏ hồng, có quầng, khuẩn lạc mép không tròn răng cưa

C :Khuẩn lạc đỏ hồng, không có quầng hồng tím, khuẩn lạc nhỏ

D : Khuẩn lạc vàng nâu, xung quanh có tím hồng, không quầng

E : Khuẩn lạc hồng, xung quanh mép vàng, không quầng, khuẩn lạc to

Sau đó được thử test sinh hoá lên men glucoza và oxidaze

 Thử test có lên men glucoza hay không

Tiếp tục cấy 5 khuẩn lạc trên vào môi trường thạch Glucoza nuôi ở 370c đểqua đêm Sau đó test oxi hoá bằng cách : Cấy khều khuẩn lạc cấy trên môi trườngthạch glucoza nuôi ở 370C trong 24 giờ

Quan sát sự thay đổi màu môi trường tức xung quanh khuẩn lạc có quầngmàu môi trường biến đổi thì kết luận có dương tính (+) và đem thử oxidaza

 Thử test oxidaze:

Pha 1g chỉ thị N,α-N… với 9ml nước cất sau đó đổ vào hộp peptri Cắtgiấy lọc và nhúng vào dịch chỉ thị, vớt ra đĩa và đem cấy vạch khuẩn lạc đã thửtest glucoza (+) trên giấy lọc đã được nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng

NA Khều khuẩn lạc và vạch trên giấy nhúng dịch chỉ thị

Quan sát sự thay đổi của vế vạch nếu không màu kết luận âm tính (-) khẳngđịnh là Enterobacteriaceae, nếu có màu xanh kết luận dương tính (-) và không phải

là Enterobacteriaceae

Từ đó xác định được tổng số lượng vi khuẩn Enterobacteriaceae theo đặcđiểm các khuẩn lạc đã được kiểm tra

g Phương pháp tạo chế phẩm BIO - NC.

Việc lựa chọn chủng làm chế phẩm trong nghiên cứu này là hỗn hợp 4 chủng

vi khuẩn lactic

Lactobacillus plantarum H1.40 phân lập từ nem chua và có khả năng sinh

bacteriocin.(nhóm nghiên cứu trước)