Báo cáo tổng kết đề tài cấp trung tâm KHTN&CNQG 2002-2003 Tên đề tài: “ Nghiên cứu sử dụng các axít béo ω3, ω6 có hoạt tính sinh học cao trong hỗ trợ phòng chống một số bệnh ung thư
Trang 1Báo cáo tổng kết đề tài
cấp trung tâm KHTN&CNQG
(2002-2003)
Tên đề tài: “ Nghiên cứu sử dụng các axít béo ω3, ω6 có hoạt tính sinh học cao
trong hỗ trợ phòng chống một số bệnh ung thư ở điều kiện Việt nam “
(Thuộc hướng KH&CN: Các Hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học )
Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Quốc Long
Cơ quan chủ trì: Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên
Trung tâm KHTN & CNQG
Thời gian thực hiện: 2002 - 2003 ( 02 năm )
Cơ quan phối hợp chính:
- Học Viện Quân Y, Bộ quốc phòng
- Viện Sinh thái & Tài nguyên, Trung tâm KHTN&CNQG
- Viện nghiên cứu Lipit BGKF, Muenster - LB Đức
- Viện Sinh vật viễn đông, Viện HLKH - LB Nga
6363
07/5/2007
Trang 2Mở đầu
Ung thư đang là một trong những căn bệnh nan y, gây tử vong hàng đầu ở Việt nam
và trên thế giới Có 10 dạng ung thư chủ yếu chiếm đến 70% mọi dạng ung thư như : kết tràng, trực tràng, vú, tiền liệt tuyến, tuyến tuỵ, buồng trứng, bàng quang, ống gan-mật,và bạch cầu [ 1 ]
Từ các công trình nghiên cứu về dịch tễ học và khảo sát mô hình trên động vật thí nghiệm, có nhiều bằng cứ cho thấy tỉ lệ mắc các bệnh ung thư trên có liên quan chặt chẽ
đến chế độ ăn uống có chứa nhiều hàm lượng chất béo và mỡ [ 2 ] Các công trình nghiên cứu đều cho thấy : vấn đề điều chỉnh lượng mỡ trong thực phẩm và các bữa ăn -
rất có thể là chìa khoá cho phòng ngừa và kìm hãm các căn bệnh ung thư phát sinh Tuy
nhiên xung quanh mối liên quan đó còn nhiều vấn đề cần phải giải quyết như sự tác động khác của các loại hình chất béo khác nhau nên quá trình gây bệnh và phát triển bệnh mà trong đó các axit béo đóng vai trò rất quan trọng ( chất béo no hay không no, Các axit béo đa nối đôi nhóm ω3, ω6 nguồn gốc động vật hay thực vật, hay nguồn gốc từ sinh vật biển.[ 3,4 ]
Các axit béo đa nối đôi nhóm ω 3,ω 6 PUFA (Polyunsaturated fatty acids), có mặt
trong dầu các hạt thực vật, hoặc mỡ các sinh vật biển - thuộc loại các axit béo có cấu trúc
đặc biệt (non-methylene-interrupted polyenoic fatty acids)và chúng thường có hoạt tính
sinh học rất cao và đặc hiệu bởi cấu trúc đặc biệt của chúng Chúng thuộc loại những chất không thể thiếu được trong các quá trình sinh tổng hợp của các cơ thể sống
(Essential oil ) Tiêu biểu cho chúng là : Arachidonic acid (AA), Eicosapentaenoic acid
(EPA), Docosahecxanenoic acid (DHA) và γ - Linolenic acid (GLA) Tác dụng hoạt tính
sinh học của chúng rất đa dạng như: trong chữa bệnh tim mạch, làm thức ăn kiêng cho người béo phì, là thành phần không thể thiêú trong dinh dưỡng trẻ em, chống lão hoá, hen suyễn thấp khớp kinh niên, chữa bệnh ngoài da như vẩy nến, chữa bỏng, chống viêm
[ 5,6 ] Xu hướng trên thế giới gần đây do căn bệnh ung thư ngày càng tăng nhanh và trở thành nguy cơ trực tiếp đe doạ con người, nhất là đối với cộng đồng dân cư có mức sống cao, ăn quá nhiều chất béo, các nhà khoa học trên thế giới đã tập chung nghiên cứu theo hướng - tìm sự liên quan giữa chất béo trong thức ăn với căn bệnh ung thư, đặc biệt đã có
một số kết quả rất khả quan về tác dụng của Các axit béo đa nối đôi nhóm ω 3,ω 6 có
hoạt tính sinh học cao có khả năng kìm hãm và phòng chống tích cực với các căn bệnh ung thư vú ở phụ nữ, và ung thư tiền liệt tuyến ở đàn ông cũng như ung thư kết tràng và tuyến tuỵ ở trên mọi đối tượng [ 1,2,3,4 ]
Trang 3Ơ đề tài này, chúng tôi nghiên cứu về tác dụng của các axít béo ω 3,ω 6 từ nguồn dầu
béo tự nhiên và định hình tạo chế phẩm theo hướng ngăn ngừa và hỗ trợ phòng chống một số dạng ung thư phổ biến trong điều kiện ở Việt nam
Phần I
Điều tra sàng lọc nguyên liệu
Trang 4I.1 Nguyên liệu và phương pháp phân tích
Nguyên liệu mẫu hạt thực vật:
Hơn 60 mẫu các loại hạt thực vật được thu thập từ các địa phương ở cả 3 vùng miền bắc, trung, nam Việt nam, một số hạt phổ dụng được thu mua tại các chợ siêu thị
và của hàng giống rau quả Hà nội
Tất cả các mẫu hạt đều được các chuyên gia thực vật của Viện ST&TN sinh vật, Trung tâm KHTN&CNQG phân loại đầy đủ: tên khoa học, họ, địa điểm, thời gian thu mẫu, lưu giữ tiêu bản
Phương pháp phân tích
Chiết tách dầu hạt (Lipit):
Các mẫu hạt thực vật được lựa chọn đạt tiêu chuẩn, đem xay nhỏ trong máy xay rồi
chiết với n-Hecxan trên dụng cụ chuyên dụng Twisselmann trong 6 giờ theo phương
pháp tiêu chuẩn quốc tế ISO/DIS 659: 1988 mô tả ở [11] Dịch chiết thu được, đem cất loại dung môi ở áp suất thấp - thu được lượng dầu béo tổng số của hạt (Lipit tổng số)
Đem cân và tính ra hàm lượng phần trăm so với mẫu hạt (hoặc cả vỏ, hoặc nhân hạt) Các số liệu về tên mẫu hạt thực vật khảo sát và hàm lượng dầu hạt được chỉ ra trên bảng
1
Phân tích thành phần axit béo ( Fatty acids):
Các axit béo được phân tich dưới dạng metyleste trên máy Sắc kí khí với cột mao quản chuyên dụng cho phân tích axit béo theo phương pháp tiêu chuẩn quốc tế ISO/FDIS 5590: 1988 mô tả ở [12]
Điều kiện phân tích máy Sắc kí khí để nhận dạng các axit béo:
Máy Sắc kí khí hãng Hewlett Packard instrument Model 5890 Series II equipped with Capillary column, CP-Sil 88 Chạy theo chương trình nhiệt độ: 140oC/5 phút, 140-260oC, tốc độ: 4oC/ phút, 260oC/5 phút; Split: 1:20; Injector 280oC: sử dụng phổ dữ liệu chuất chuẩn Các dẫn xuất của các axit béo đặc biệt được chuẩn bị dưới dạng DMDS và DMOX và phân tích theo các phương pháp của Francis [6}, Yu et al [7], có sự trợ giúp của Sắc kí khí- khối phổ (GC-MS) Hewlett Packard instrument Model 5890 Series II/5989 A (EI, 70 eV), equipped with a 0.25 àm ZB-1 fused silica capillary column
Trang 5(Phenomenex), 30 m x 0.25 i.d Khí mang Helium; tỉ lệ 1.0 mL/min Kết quả thành
phần các axit béo có trong 61 mẫu hạt thực vật khảo sát đ−ợc chỉ ra trên bảng 2:
Bảng 1 : Hàm l−ợng dầu các mẫu hạt thực vật Việt nam đã điều tra sàng lọc
T
T
Tên Việt nam ( Tên khoa học )
Họ Địa điểm, thời gian
thu mẫu
Hàm l−ợng dầu ( %)
Trang 7( cïi dõa t−¬i )
60 DÇu Oliu * Oleaceae Hµ néi 11/2002 40-70
Trang 8T
Tên Việt nam ( Tên khoa học )
Họ Địa điểm, thời gian
thu mẫu
Hàm lượng dầu ( %)
có hàm lượng dầu cao này còn có mặt các loại dầu hạt nước ngoài: hướng dương (35-55%); Oliu (40-70%); Cọ (40-65%), tuy nhiên đây là những loại dầu ta phải nhập khẩu đây là yếu tố ta phải xem xét thêm khi quyết định lựa chọn đối tượng nào được sử dụng làm nguyên liệu ban
đầu.
Trang 10
NO
Fatty acids
Seed
Unusual 20:
26 Amaranthus
mangostanus
0.29 0.07 19.08 0.19 0.10 3.19 18.82 1.26 44.68 0.14 7.23 g 0.92 0.24 0.02 - 0.11 -
5.48 #
0.05 3.30 0.19 0.04 0.79 63.69 7.06 4.99 0.31 - 0.11 0.03 0.01 0.06 - 0.04
33 Schizonepeta
tenuifolia
0.05 0.03 9.11 0.12 0.08 1.65 14.26 1.48 29.18 42.45 - 0.21 0.19 0.06 0.03 0.05 -
36 Chrysanthemum
coronarium
0.07 0.02 9.40 0.11 0.10 2.25 3.91 0.51 77.75 0.14 1.5 e
2.7 f
0.49 0.11 0.24 0.03 0.09 -
40 Connarus
paniculatus
0.20 - 25.21 0.10 0.09 4.01 30.05 0.62 37.87 0.50 - 0.23 0.29 0.25 - 0.22 0.14
41 Pinus massoniana 0,1 - 4,1 0,2 - 1,8 17,0 0,8 47,7 0,4 18,4 h 0,2 - - -
42 Pinus caribea 0,1 - 5,3 0,1 - 4,6 16,7 0,5 54,9 1,3 10,3 h 0,4 - - -
43 Pinus merkusii 0,1 - 5,4 0,1 - 2,0 19,3 0,7 46,0 0,3 18,3 h 0,4 - - -
44 Pinus kesyia 0,1 - 5,5 0,1 1,4 18,7 0,7 43,6 0,3 18,2 h 0,3 - - -
45 Pinus dalatensis 0,1 - 7,1 0,4 - 1,8 20,7 1,4 47,4 0,4 12,2 h 0,4 - - -
46 Pinus krempfii 0,1 - 6,1 0,1 2,2 24,3 0,4 51,1 0,4 7,3 h 0,4 - - -
47 Pinus koraensis - - 4,7 0,1 - 2,0 27,0 0,3 45,3 0,2 14,9 h 0,3 - - -
48 Pinus siberya - - 4,4 0,1 - 2,6 25,1 0,5 43,2 0,2 18,1 h 0,3 - - -
49 Cycas revoluta Thumb 0,2 - 38,8 2,6 - 4,7 38,6 2,8 10,2 0,6 - 0,4 0,1 0,1 - 0,8 - 50 Cannabis sativa L - - 6,65 0,1 - 0,07 - - 67,37 24,31 - 0,73 0,49 0,28 - - -
51 Cassia tora L 0,1 - 19,3 0,3 0,1 6,4 19,5 0,9 47,0 2,0 - 2,1 0,4 1,6 - 0,3 - 52 Vigna aurea ( Roxb.) 0,2 0,1 23,8 - 0,2 5,9 5,6 0,5 43,3 18,3 - 0,9 0,2 1,0 - 0,1 - 53 Sesamum orientale L - - 8,9 0,1 - 5,7 36,2 1,4 46,2 0,4 - 0,7 0,2 0,1 - 0,1 - 54 Arachis hypogea Linn - - 11,4 - - 3,3 45,3 - 32,5 - - 1,4 1,1 3,3 0,1 - 1,1 55 Glycine max (L.) 0,1 - 11,2 0,1 - 0,4 22,0 - 53,8 7,5 - 0,4 0,2 0,5 0,1 - 0,2 56 Zea mays L 0,1 0,1 # - 12,1 0,2 - 2,4 32,1 - 50,9 0,9 - 0,5 0,3 0,2 - - 0,2 57 Gossypium sp. 0,8 - 23,7 0,8 - 2,6 18,4 - 53,0 0,1 - 0,3 0,1 0,1 - - -
58 Sunflower - - 6,5 - - 4,5 21,1 - 66,2 - - 0,3 0,1 0,8 0,1 0,2 0,1 59 Cocos nucifera L 18,1 57,8 # - 8,9 - - 2,7 6,4 - 1,6 - - 0,1 - - - - -
Trang 11#.12:0 fatty acids; a Conj fatty acids; b 9,10 Cpa fatty acids; c 9,10 Cpe fatty acids; d 8,9 Cpe fatty acids; e Epo
fatty acids; f acetylenic fatty acid; g Squalen; h ∆5-Unsaturated Polymethylen Interupted Fatty Acid
Nhận xét chung
Nhìn chung trong hầu hết các hạt đếu có mặt các dạng axit béo phổ dụng trong dầu hạt thực vật như các axit béo no: Palmitic (C16:0), Stearic (18:0), Arachidic (20:0); các axit béo có một nối đôi: Pamitoleic (16:1), Oleic (18:1), các axit béo chứa 2 nối đôi: Linoleic (18:2n-6) và các axit béo chứa 3 nối đôi: Linolenic (18:3 n-3)
Một số dạng axit béo có cấu trúc đặc biệt chỉ tồn tại ở một số họ hạt thực vật, ví dụ như: dạng axit béo đa nối đôi liên hợp (C18:3 Conj ) có hàm lượng cao trong một vài hạt: mướp đắng (60,6%), gấc (58,61%), trẩu (73%), những axit béo này có vai trò quan trọng trọng nguyên liệu công nghệ sơn, vật liệu; các dạng axit béo mạch vòng Cpa Cpe là những tác nhân gây ung thư thì hay tồn tại trong các hạt họ Malvaceae và Gnetaceae với hàm lượng
đáng kể như: hạt nhãn (16,93%), hạt vải (42,38%), hạt gắm (32%); còn dạng axit béo có chứa oxy mạch vòng Epo thì thường hay tồn tại với hàm lượng nhỏ <5% trong các hạt họ Malvaceae và Compositae, chúng có vai trò quan trọng trong vật liệu epoxy công nghiệp; một dấu hiệu đặc trưng riêng cho hạt thực vật họ thông Pinaceae là luôn chứa một hàm lượng lớn các axit béo ∆5-
Unsaturated Polymethylen Interupted Fatty Acid (10,3-18,4%), những axit
béo dạng ∆5 này đã được chứng minh là có tiềm năng hoạt tính sinh học cao
Trang 12trong y,dược Trong một vài trường hợp cá biệt có hàm lượng cao axit béo no (axit lauric C12:0) như hạt thìa là (5,48%) và dầu dừa (57,8%)
Các kết quả trên giúp ta có cái nhìn tổng thể và định hướng chọn lọc sử dụng hợp lí các nguồn dầu hạt thực vật hợp lí trong thực tiễn sử dụng.
I.2 Định hướng nguyên liệu và chế phẩm
Để lựa chọn nguyên liệu ban đầu cho quá trình tạo chế phẩm thử nghiệm tiếp theo, chúng tôi dựa trên 2 yếu tố chính sau:
Hàm lượng dầu ( lipit ) tương đối lớn ( trên 20% ) và phải là nguồn sẵn
có, ổn định, dễ khai thác trong tự nhiên, giá thành rẻ Qua kết quả khảo sát hàm lượng dầu của hơn 60 hạt thực vật trên, ta thấy thuộc về nhóm này gồm có các hạt: họ hạt cải ( 33,1%- 45,2%); họ hạt đậu tương (22,1%), hạt vừng ( 42,5%); hạt lạc (52,3%); hạt ngô (35,5%); dầu dừa (30,7%); hạt lanh (32,5%) , ngoài ra còn có một số dầu hạt nhập khẩu như: hướng dương (35-55%); Oliu (40-70%); Cọ (40-65%)
Đối tượng chúng ta quan tâm là các axit béo có hoạt tính sinh học cao ,
mà chúng tồn tại trong thành phần các dầu hạt thực vật, vai tró của các
axit béo có hoạt tính sinh học cao đó chính là các axit béo đa nối đôi
ω3, ω6 ( Polyunsaturated fatty acids -PUFA ω3, ω6), bới vậy hàm lượng của các axit béo PUFA ω3, ω6 này có càng cao trong loại dầu hạt
thực vật nào - cũng sẽ là một yếu tố quan trọng dẫn đến sự lựa chọn của
chúng tôi đối với đối tượng nguyên liệu ban đầu
Trang 13Xuất phất từ 2 yếu tố nêu trên, chúng tôi tiến hành thu thập và khảo sát 09 loại dầu thực vật được thu thập từ các siêu thị ở Hà nội và các đại lí của các Hãng cung cấp dầu
ăn thông dụng trong nhân dân Chất lượng các lọại dầu đều được các Hãng cung cấp đảm bảo chất lượng thương phẩm có chứng nhận tiêu chuẩn chất lượng và hạn sử dụng như:
Neptune ( Công ty dầu thực vật Cái Lân ), Simply ( dầu đậu nành- Công ty dầu thực vật
Cái Lân), Dầu mè (dầu vừng-Công ty dầu thực vật Tường An), Olive Oil ( dầu Oliu- Tây Ban Nha ), Rio ( dầu Hướng dương- Argentina ), Dầu lạc (Công ty dầu thực vật Trường Xuân ), Crown (Công ty dầu thực vật Trường Xuân ), Corn Oil (Wesson- USA), Hemp
seed Oil ( Canada ), và dầu EBS1( dầu ω3 ) - chiết tách từ mỡ cá biển theo phương pháp
tiêu chẩn Quốc tế [ 7 ], được cung cấp bởi phòng Hóa- Sinh biển, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên
Thành phần và hàm lượng các axít béo có trong các mẫu dầu nghiên cứu được phân tích theo phương pháp tiêu chuẩn [ 8 ] tại phòng Hóa- Sinh biển, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và kết quả được chỉ ra trên bảng 3:
Bảng3: Thành phần và hàm lượng các axít béo có trong 10 mẫu dầu nghiên cứu
SFA
(g/100gr.)
MUFA (g/100gr.)
Tổng PUFA
ω3, ω6 (g/100gr.)
1 Dầu EBS1( dầu cá biển) 3-4 0.107 -
0.422
0.144 - 0.710
Trang 147 Đậu phộng (dầu lạc) 52,3 0.205 0.465 0.325
10 Hemp seedOil (dầu lanh) 32,5 0.145 0.164 0.692
PUFA: Polyunsaturated fatty acid ( Axit béo không no đa nối đôi )
MUFA: Monounsaturated fatty acid ( Axit béo không no một nối đôi )
SFA: Saturated fatty acid ( Axit béo no bão hòa)
Chúng tôi tiến hành phối trộn tất cả các mẫu dầu dạng nguyên chất và một số dạng
công thức phối hỗn hợp giữa các loại dầu khác nhau, nhằm tìm ra một vài dạng chế phẩm tối −u có hoạt tính khả quan nhất; 32 dạng công thức mẫu thử nghiệm đã đ−ợc
giới thiệu trên bảng 4:
Bảng 4: 32 dạng công thức phối hỗn hợp giữa các loại dầu thử nghiệm
1 Dầu EBS1 (nguyên chất)
2 Dầu Neptune (nguyên chất)
3 Simply (nguyên chất)
4 Dầu mè (nguyên chất)
5 Olive Oil (nguyên chất)
6 Rio (nguyên chất)
7 Dầu lạc (nguyên chất)
8 Crown (nguyên chất)
9 Corn Oil (nguyên chất)
10 Dầu EBS1 (10%)+ Dầu Neptune(90%)
11 Dầu EBS1 (10%)+ Simply (90%)
12 Dầu EBS1 (10%)+ Dầu mè (90%)
13 Dầu EBS1 (10%)+ Olive Oil (90%)
14 Dầu EBS1 (10%)+ Rio (90%)
15 Dầu EBS1 (10%)+ Dầu lạc (90%)
16 Dầu EBS1 (10%)+ Crown (90%)
17 Dầu EBS1(10%)+ Corn Oil (90%)
18 Dầu EBS1 (20%)+ Dầu Neptune (80%)
19 Dầu EBS1 (20%)+ Simply (80%)
20 Dầu EBS1 (20%)+ Dầu mè (80%)
21 Dầu EBS1 (20%)+ Olive Oil (80%)
22 Dầu EBS1 (20%)+ Rio (80%)
23 Dầu EBS1 (20%)+ Dầu lạc (80%)
24 Dầu EBS1 (20%)+ Crown (80%)
Trang 1525 Dầu EBS1 (20%)+ Corn Oil (80%)
26 Dầu EBS1 (40%)+ Simply (30%) + Dầu lạc (30%)
27 Dầu EBS1 (40%)+ Simply (15%) + Dầu lạc (45%)
28 Dầu EBS1 (40%)+ Simply (5%) + Dầu lạc (55%)
29 Dầu EBS1 (60%)+ Simply (5%) + Dầu lạc (35%)
30 Dầu EBS1 (40%)+ Dầu mè (30%) + Dầu Neptune (30% )
31 Hemp seed Oil (nguyên chất)
32 Dầu EBS1 (10%)+ Hemp seed Oil (90%)
I.3 Nghiên cứu thực nghiệm các axit béo ω3, ω6 như các tác
nhân hỗ trợ và phòng chống ung thư
I.3.1 Phần thử nghiệm hoạt tính sinh học ( Invitro)
• Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity):
Theo phương pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietrinke [ 9 ], tiến hành trên phiến vi lượng 96 giếng, kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampixilin, Tetracylin, Amphoterixin B và Nystatin Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm đại diện các nhóm:
- Vi khuẩn Gr- : E coli, P aeruginosa
- Vi khuẩn Gr+ : B subtillis, S aureus
- Nấm mốc: asp niger, F oxysporum
- Nấm men: C albicans, S cerevisiae
• Thử khả năng gây độc tế bào (Cytotoxicity):
Theo phương pháp được tiến hành tại Viện ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI)
[10] Các dòng tế bào ung thư người: KB ( Ung thư biểu mô người), Fl (ung thư màng tử cung).Tế bào ung thư được duy trì liên tục ở các điều kiện tiêu chuẩn và được trộn với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở các nồng độ khác nhau trên phiến vi lượng 96 giếng, phiến thử bao gồm tế bào + môi trường nuôi cấy + chất thử, được ủ ở 37oC trong 3 ngày trong
tủ ấm CO2 Sau đó tế bào được lấy ra cố định, rửa, nhuộm và hoà lại bằng dung dịch chuẩn, đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515-540nm Giá trị IC50 được tính trên chương
trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của
chất thử và giá trị OD đo được
Trang 16• Kết quả hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các mẫu thử:
Trong phần thử hoạt tính kháng sinh cho thấy phần lớn các mẫu biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ở mức độ trung bình ( với giá trị ức chế tối thiểu MIC= 200àg/ml) Tổng cộng có 6 trong số 30 mẫu thử biểu hiện có hoạt tính kháng ít nhất 1 trong sô 8 vi sinh vật kiểm định, 12 mẫu có hoạt tính kháng 2 trong số 8 vi sinh vật kiểm
định, 7 mẫu kháng 3 trong số 8 vi sinh vật kiểm định, điều này cũng phù hợp với đặc
tr−ng của các dầu béo chỉ là những chất có tính kháng vi sinh vật kiểm định chứ không phải là những chất có tính chất kháng vi sinh vật đặc hiệu Kết quả đ−ợc ghi lại ở bảng 5
Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (àg/ml)
Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men
S
TT
Kí hiệu
mẫu E.coli P.aerug inosa B.subtill is S.aureus ASP.nig er F.oxyspor um C.albican s S.cerevisi ae
Trang 17 Kết quả thử khả năng gây độc tế bào (Cytotoxicity):
Trong số 32 mẫu thử với 2 dòng tế bào, có 3 mẫu thể hiện hoạt tính ức chế sự tăng sinh của cả 2 dòng ở nồng độ ức chế IC50 là 30-40àg/ml, đó là các mẫu số 4, 10, và 27,
các mẫu còn lại không có biểu hiện ức chế các dòng tế bào thử Điều này cũng phù hợp với các tài liệu đã công bố [1,2,3,4] về sự can thiệp của các chất axít béo ω3 và ω6 chủ
yếu là theo cơ chế chống lại hiện tượng metastasis ( tức ngăn chặn không cho tế bào ung
thư phát triển và di căn vào các bộ phận khác - gây nguy cơ tử vong rất nhanh ), chứ không phải theo cơ chế tiêu diệt các tế bào ung thư như các nhóm chất khác và như vậy hoạt tính của chúng chỉ được phát huy mạnh, rõ nét khi thử nghiệm trên cơ thể sống
Invivo Mẫu 32 có hiện tượng ức chế, nhưng cần phải làm kiểm chứng lại Các mẫu có
hoạt tính là: số 4, 10, 27 sẽ được tiếp tục thử nghiệm trên động vật thực nghiệm tiếp theo,
trong đó có đặc biệt quan tâm mẫu số 1- vì hoạt tính axít béo ω3 của nó đã được khẳng
định trong các tài liệu cập nhật ở [1,2,3,4] Kết qủa thử hoạt tính gây độc tế bào được tổng kết ở bảng 6:
KB: Tế bào ung thư biểu mô của người ; Fl: Tế bào ung thư màng tử cung người
Kết quả thử nghiệm bổ xung kiểm chứng riêng biệt mẫu số 27 ( đặt tên là chế
phẩm OF 27 , và các mẫu EBS1 (ω 3); Hem Oil (ω 6) trên 3 dòng tế bào ung thư KB,
RD, Hep-2 cho kết quả trên bảng 7
Dòng tế bào- Giá trị IC 50 (àg/ml) STT Kí hiệu mẫu
Kết luận
Trang 181 Chứng (+) 0,002 0,001 0,001
2 ω3 (EBS1) 0,235 0,737 0,64 Dương tính cả 3 dòng
3 ω6 (Hemp oil) >5 1,13 4,65 Dương tính 2 dòng
4 OF27 (ω3/ω6) 2,65 2,13 0,62 Dương tính cả 3 dòng KB: Tế bào ung thư biểu mô người; RD: Tế bào ung thư màng tim người
Hep-2: Tế bào ung thư gan người
I.3.2 Phần thử nghiệm hoạt tính sinh học
- Thuốc: chế phẩm EBS1 hoà tan trong dầu lạc vừa đủ để 1 lô chuột uống hàng ngày
mỗi con 0,2 ml (tương đương với liều 2g/kg) và 1 lô chuột uống hàng ngày mỗi con 0,2
ml (tương đương với liều 4g/kg) So với 1 lô chuột uống dầu lạc (đối chứng)
- Tất cả 3 lô chuột cho uống thuốc trong 10 ngày liên tục sau đó gây y báng bằng cách
tiêm 5 x 106 tế bào 180 sarcoma trong 0,1 ml dung dịch nuôi cấy vào ổ bụng chuột Theo dõi và giết chuột vào các thời điểm 3, 6, 10 ngày sau khi gây u báng
• Các chỉ tiêu quan sát: trọng lượng, khối lượng dịch ổ bụng, tổng số tế bào ung thư
trong ổ bụng
• Phương pháp nghiên cứu: giết chuột lấy toàn bộ dịch ổ bụng để đo thể tích, cân
trọng lượng dịch Dùng buồng đếm hồng cầu để tính số tế bào trong 1 ml dịch và tổng số tế bào ung thư trong toàn bộ lượng dịch ổ bụng Làm tiêu bản để quan sát hình thái tế bào
Trang 19
Khối l−ợng (ml)
Tổng số tế bào (x 10 6 )
Chứng 6 0,16 ± 0,04 0,01 ± 0,04 86,33 ± 26,69
Liều
2g/kg 6 0,23 ± 0,2 0,2 ± 0,2 54,66 ± 15,57
* Khác đối chứng P< 0,05
Trang 20ắ Ơ liều sử dụng cho uống EBS1( 2g/kg thể trọng ) có thể hạn chế sự phát triển ung
thư 180 sarcoma trên chuột nhắt trắng
ắ Những nghiên cưú tiếp tục trên động vật thực nghiệm đang được tiến hành và sẽ
được thông báo tiếp theo
Kết luận phần I
1 Đã thu thập, khảo sát sàng lọc hàm lượng dầu (Lipit), thành phần và hàm lượng các axit béo của 61 mẫu hạt thực vật Việt nam, qua đó cho
phép định hướng một số đối tượng có tiềm năng để sử dụng làm nguồn
nguyên liệu ban đầu cho bước nghiên cứu tạo chế phẩm có hoạt tính sinh học tiếp theo
2 Từ 10 mẫu dầu thương phẩm thông dụng, đã khảo sát thành phần và hàm lượng các axit béo không no đa nối đôi ω3, ω6 có hoạt tính sinh
học (PUFA ω 3, ω 6), axit béo không no một nối đôi (MUFA) và axit béo
no bão hòa (SFA), qua đó phối trộn và đưa ra 32 dạng công thức để thử
nghiệm hoạt tính sinh học
3 Đã tiến hành nghiên cứu Invitro: thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm
định (Antimicrobial activity) và thử nghiệm gây độc tế bào
(Cytotoxicity) theo phương pháp được tiến hành tại Viện ung thư Quốc
gia của Mỹ (NCI) trên các dòng tế bào ung thư người: KB (Ung thư biểu
mô người), Fl (ung thư màng tử cung) của 32 dạng mẫu chế phẩm Ba
mẫu OF 27 và ω3, ω6 được khảo sát bổ xung trên 3 dòng tế bào ung
thư: KB (Ung thư biểu mô người); RD ( Tế bào ung thư màng tim người)
và Hep-2 ( Tế bào ung thư gan người) đều cho tín hiệu khả quan
4 Từ các kết quả sơ bộ trên Invitro; trên cơ sở các tài liệu khoa học tham khảo trên thế giới về công thức phối hợp ( tỉ lệ ω 3/ ω 6 thích hợp ), tại
điều kiện cụ thể của thực tiễn Việt nam cùng với tính hợp lí về thời gian
nghiên cứu của đề tài ( 02 năm ) - chúng tôi lựa chọn công thức số 27 và
đặt tên là chế phẩm OF 27 để tiếp tục nghiên cứu sâu thêm trên trên
động vật thực nghiệm (Invivo)
Trang 215 Bước đầu khảo sát thăm dò tác dụng dự phòng của chế phẩm EBS1(ω3)
đến sự hạn chế phát triển u báng 180 Sarcoma - ở chuột nhắt trắng Kết
quả cho thấy ở liều sử dụng 2g/kg thể trọng, có thể hạn chế sự phát triển
ung thư 180 Sarcoma Những nghiên cưú tiếp tục trên động vật thực nghiệm đang được tiến hành và sẽ được thông báo tiếp theo.
Phần II
Nghiên cứu an toàn và sơ bộ thăm dò một số
tác dụng sinh học của chế phẩm OF 27
trên động vật thực nghiệm
( Bộ môn Dược lí học - Học Viện Quân Y )
Trang 22đặt vấn đề
Mục tiêu của đề tài:
1 Nghiên cứu toàn diện các vấn đề độc tính cấp, độc tính trường diễn của
chế phẩm OF27, khảo sát ảnh hưởng của việc dùng uống dài ngày chế phẩm OF27 đến các thông số huyết học, sinh hoá trên động vật thực
nghiệm
nghiệm về khả năng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp Protein, khả năng làm tăng năng lực tâm thần kinh, khả năng điều biến miễn dịch, ức
chế đột biến và ức chế hình thành khối u của chế phẩm OF27
Chế phẩm OF27 do phòng Hoá sinh biển - Viện Hoá học các hợp chất
thiên nhiên cung cấp dưới dạng chất lỏng màu nâu sáng, mùi vị đặc trưng, đã
được kiểm nghiệm về hoá học, có độ tinh khiết đạt tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) Các nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Dược lí học-Học viện Quân Y
Trên cơ sở các kết quả thu được sẽ tiến hành việc tiêu chẩn hoá chế phẩm, xây dựng quy trình và hoàn thiện quy trình bào chế, ổn định và kiểm nghiệm chế phẩm tạo ra dược phẩm thử lâm sàng trên người tình nguyện.
Trang 23Phương pháp và kết quả nghiên cứu
1 Nghiên cứu độc tính cấp diễn của OF 27
Phương pháp của Abraham - Tunner A (1, 5 )
Tính toán theo phương pháp cải tiến của Livschitz P.Z.(1986) theo công thức sau :
Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của OF27 theo đường uống
Các nhóm chuột nhắt trắng 12 - 12 con được cho uống ở 6 mức liều theo thứ tự tăng dần Số chuột chết được đếm theo nhóm trong vòng 72 giờ Kết quả được trình bày ở bảng 1 :
Trang 242 Nghiên cứu độc tính bán mạn tính (cho động vật dùng thuốc trường diễn liều thấp)
Phương pháp được mô tả bởi Abraham (1) và theo quy định của WHO và Bộ Y tế
về hiệu lực và an toàn thuốc trong nghiên cứu thuốc y học cổ truyền dân tộc (6, 7)
Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc OF27 khi cho uống trường diễn đối với trong lượng cơ thể và trọng lượng gan, lách, thận động vật :
(0,1ml/10g)
Thuốc n/c OF27 0,02 g/kg
Thuốc tham chiếu EBS 1 0,5 g/kg
• Nhận xét: Các kết quả ở bảng 2 cho thấy chỉ số tăng trọng lượng so sánh theo các
nhóm sau 5 tuần và tỷ số này giữa các nhóm trắng, chứng, thuốc nghiên cứu và thuốc tham chiếu khác nhau không có ý nghĩa thống kê ( p > 0,05 ), chứng tỏ thuốc nghiên cứu không làm ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể chuột nghiên cứu
Đây là chỉ số quan trọng đánh giá thuốc mới khi nghiên cứu trường diễn (1, 6, 7)
Trang 25Møc liÒu 0,03 g/kg
Nhãm N/C
Thêi gian
Chøng CMC 2% x 0,1 ml/10g TLCT
Thö chÕ phÈm OF27 0,03g/kg TLCT
Tham chiÕu EBS1
Trang 26 Kết quả nghiên cứu trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, lách, thận và tỷ số giữa trọng lượng mỗi tạng so với trọng lượng cơ thể khi dùng mức liều 0,02 g/kg/24 giờ
* Nhận xét :
So sánh giữa các nhóm chứng và thuốc OF27 các chỉ tiêu trọng lượng cơ thể,
trọng lượng các cơ quan gan, lách, thận và tỷ số giữa trọng lượng mỗi tạng so với trọng lượng cơ thể, sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
Như vậy khi dùng mức liều 0,02 g/kg/24 giờ, không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể cũng như trọng lượng các cơ quan gan, lách, thận
Trang 27 Nghiên cứu ảnh hưởngcủa chế phẩm OF27 với các chỉ tiêu huyết học của động vật thí nghiệm cho uống trường diễn (1, 5, 6, 7):
Với mức liều 0,02 g/kg thể trọng cho dùng trường diễn, các thông số huyết học được trình bày ở bảng 5 :
OF27 ( n = 12) Chứng CMC ( n= 12) Nhóm N/C
thí nghiệm
Sau thí nghiệm
Trước thí nghiệm
Sau thí nghiệm
Với mức liều đã sử dụng (0,02 g/kg/24 giờ) uống trường diễn, đã không làm ảnh
hưởng đến số lượng các tế bào máu động vật thực nghiệm (p > 0,05)
Chế phẩm OF27 không độc với chức năng tạo máu