Nghiên cứu xây dụng Quy trình nhân giống địa Lan kỹ thuật nuôi cấy mô Đặt vấn đề Hoa lan (địa lan phong lan) có giá trị kinh tế thẩm mỹ cao, nhu cầu tiêu thụ lớn, sản xuất hoa lan mang lại lợi nhuận cao cần thiết phải chọn lọc du nhập giống hoa đồng thời xây dựng đợc phơng pháp nhân giống hữu hiệu nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu thu đa dạng Để có đợc giống với số lợng lớn, chất lợng giống đảm bảo Biện pháp nhân giống truyền thống cho hệ số nhân thấp, thời gian đòi hỏi kéo dài, dễ bị thoái hoá Chính phơng pháp nhân giống in vitro với hệ số nhân cao, giống đồng đều, chất lợng cao đợc lựa chọn Quy trình nhân giống sản xuất địa lan đà đợc số quan doanh nghiệp nớc nghiên cứu đà triển khai sản xuất Tuy nhiên, công trình nghiên cứu tập trung số địa phơng phía Nam nh: Đà Lạt, TP HCM, Bên cạnh đó, việc nghiên cứu để tìm quy trình nhân giống in vitro cho loài lan quý nhằm tạo nguồn giống chất lợng cao cho sản xuất cha đợc giải Chính vậy, khuôn khổ đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nớc KC04.08, đề tài nhánh đợc giao nhiệm vụ: Nghiên cứu xây dụng quy trình nhân giống địa lan kỹ thuật nuôi cấy mô Mục đích yêu cầu đề tài 2.1 Mục đích đề tài Nghiên cứu xây dựng đợc quy trình nhân nhanh in vitro công đoạn sau in vitro cho số giống địa lan với công suất vạn cây/năm 2.2 Yêu cầu đề tài: 2.2.1 Thu thập mẫu lu giữ nguồn gen 2.2.2 Giai đoạn nhân in vitro Nghiên cứu chế độ khử trùng mẫu cấy, tạo nguồn vật liệu khởi đầu, trình nhân nhanh tạo hoàn chỉnh 2.2.3 Giai đoạn sau in vitro 2.2.3.1 Giai đoạn vờn ơm cấp I Nghiên cứu ảnh hởng khối lợng trớc vờn ơm giá thể,, dinh dỡng cho cây, thời vụ 2.2.3.2 Giai đoạn vờn ơm cấp II Nghiên cứu ảnh hởng giá thể, dinh dỡng đến sinh trởng phát triển Vật liệu, nội dung phơng pháp nghiên cứu 3.1 Vật liệu - Giống địa lan Trung quốc đỏ (Miss Kim) vật liệu sử dụng toàn thí nghiệm - Các giống: Xanh Chiểu; Hồng Bệt (Đà Lạt); Trung Quốc Xanh; Trung Quèc Vµng; C Miss korre; C Da fan vµ mét số giống địa Phợng hoàng thơm Mạc nâu lớn nguồn vật liệu dùng thí nghiệm sản xuất thử Các giống có giá trị thơng mại, có nhu cầu lớn thị trờng 3.2 Nội dung nghiên cứu 3.2.1 Điều tra, thu thập lu giữ nguồn gen 3.2.2 Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho nhân nhanh in vitro - Nghiên cứu ảnh hởng thời gian phơng pháp khử trùng mẫu - Nghiên cứu ảnh hởng chất điều tiết sinh trởng tới trình phát sinh hình thái mẫu cấy 3.2.3 Nghiên cứu nhân nhanh nguồn mẫu - Nghiên cứu ảnh hởng chất điều tiết sinh trởng đến khả nhân nhanh - Nghiên cứu ảnh hởng phơng thức nuôi cấy (đặc, lỏng, lỏng + lắc) đến khả nhân nhanh - ứng dụng phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào nhân nhhanh 3.2.4 Nghiên cứu tạo hoàn chỉnh - Nghiên cứu ảnh hởng NAA đến tạo hoàn chỉnh - Nghiên cứu ảnh hởng than hoạt tính đến tạo hoàn chỉnh 3.2.5 Các nghiên cứu giai đoạn sau nuôi cấy mô - Nghiên cứu xác định tiêu chuẩn nuôi cấy mô đa vờn ơm - Nghiên cứu ảnh hởng thời vụ giá thể - Nghiên cứu chế độ dinh dỡng đến sinh trởng, phát triển (giai đoạn vờn ơm) 3.3 Phơng pháp nghiên cứu - Các thí nghiệm đợc tiến hành phòng thí nghiệm nuôi cấy mô vờn thực nghiệm phòng CNSH - Viện sinh học Nông nghiệp - Trờng Đại học Nông nghiƯp I - Hµ néi vµ Sapa- Lµo Cai - Phơng pháp khử trùng: Mẫu cấy (chồi đỉnh, mắt ngủ chồi non) đợc tách từ mẹ khoẻ mạnh, bệnh đợc rửa khử trùng đơn (1 lần) hay kép (2 lần) HgCl2 0,1% nồng độ thời gian xử lý khác - Phơng pháp nuôi cấy: thí nghiệm nuôi cấy in vitro đợc thực điều kiện nhân tạo cho phép chủ động chế độ ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ + Cờng độ ánh sáng: 2400 - 3000 lux + Nhiệt độ phòng nuôi : 20 - 25oC + Quang chu kú: 16 giê s¸ng/ giê tèi - Bè trÝ thÝ nghiƯm: + C¸c thí nghiệm đợc bố trí ngẫu nhiên, lần lặp lại, công thức theo dõi 15 - 50 cá thể + Thí nghiệm đợc quan sát, theo dõi thờng xuyên 10 - 15 ngày/lần đo đếm tiêu sinh trởng phát triển công thức thí nghiệm + Số liệu đợc xử lý thống kê sinh học theo chơng trình IRRISTAT Kết thảo luận 4.1 Điều tra thu thập, xác định đối tợng thí nghiệm Trong trình thực hiện, đà tiến hành điều tra số tỉnh có trồng phát triển địa lan nh Hà Nội; Bắc Ninh Hng Yên, kết bảng Bảng 1: Một số giống địa lan trồng phổ biến nơi điều tra STT Tên Việt Nam Tên Khoa học Thanh Ngäc Cymbidium spp Hång Hoµng C Grandyflorum Griff Mạc Biên C Ensifolium (L) Sw Mạc §en C Sinense B¹ch Ngäc C Eburneum Lindl Trần Mộng Cymbidium spp Đông Lan Cymbidium spp Hoàng Vũ Cymbidium spp Hoàng Điểm Cymbidium spp 10 Thanh Tr−êng C Schoederi 11 Tè T©m Cymbidium spp 12 Quý Phi Cymbidium spp 13 Ngäc Anh, Ngäc Tr©m Cymbidium spp 14 Đào Hồng Cơ Cymbidium spp 15 Hoàng Cẩm Tố Cymbidium spp Sau điều tra, đà xác định đợc số giống quí có khả thơng mại cao đà tiến hành thu thập lu giữ nguồn mẫu vờn thực nghiệm Trờng (bảng 2) Bảng 2: Các giống đà thu thập vờn Đặc điểm hình thái, màu sắc, hơng vị hoa hoa/ (cm) Tên Việt Nam Số dài hoa Stt ChiỊu cµnh Thêi gian tõ në - tµn Mµu sắc Hơng thơm (ngày) Bạch Ngọc 25 35 Hoàng Điểm 45 - 46 11 30 Thanh Trờng 45 - 46 11 30 Đào Hồng Cơ 35 12 45 Hoµng CÈm Tè 120 25 45 Trắng Tên thơng mại hoa - 10 Thơm 1-2 Thơm 1-2 Hồng Thơm 11 - 12 Xanh vàng Thơm 12 - 13 Vàng họng điểm Xanh họng vàng Tên Khoa học Mạc nâu lớn C spp Phợng hoàng thơm C spp Xanh Chiểu C spp Hång BÖt C spp Miss kim C spp Organdi Moon Light C spp Lancelost Misono C spp 10 Miss korre C spp 11 Da fan C spp gian Thơm Bảng 3: Các giống đà đợc nuôi cấy lu giũ in vitro STT Thời 4.2 Giai đoạn tạo nguồn vật liệu khởi đầu Đây giai đoạn quan trọng cho trình nhân giống in vitro có đợc nguồn mẫu tiến hành tiếp giai đoạn sau Để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho trình nuôi cấy in vitro, đà lấy chồi bên có chiều cao từ - 5cm làm nguồn mẫu để tiến hành thí nghiệm 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hởng thời gian phơng pháp khử trùng đến mẫu đa vào nuôi cấy Bảng 4: ảnh hởng thời gian phơng pháp khử trùng tíi tû lƯ nhiƠm vµ tû lƯ sèng cđa mÉu ChØ tiªu theo dâi Tû lƯ nhiƠm Tû lƯ chÕt Tû lƯ sèng C«ng thøc (%) (%) (%) Khư trïng ®¬n: 100 - - Khư trïng ®¬n: phút 100 - - Khử trùng đơn: phút 80 10 10 Khö trïng kÐp: + 50 10 40 Khö trïng kÐp: + 40 20 40 Khö trïng kÐp: + 30 10 60 Khö trïng kÐp: + 20 30 50 Tõ kÕt qu¶ b¶ng cho thÊy viƯc khư trïng mÉu tr−íc đa vào nuôi cấy thực lần tỷ lệ nhiễm cao (80 - 100%) Với phơng pháp khử trùng kép (khử trùng lần bóc bao khử trùng tiếp lần 2) tỷ lệ nhiễm mẫu (20% - 50%) công thức khử trùng kép thời gian khác công thức phút + phút tỏ có hiệu tû lƯ nhiƠm lµ 20% - 30% nh−ng tû lƯ chÕt l¹i rÊt thÊp (10 - 30 %) kết sau khử trùng đạt đợc 50 - 60% sè mÉu s¹ch sèng sãt (trong tÊt công thức khác tiêu đạt - 40%) 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hởng chất điều tiết sinh trởng đến trình phát sinh hình thái mẫu Qua thử nghiệm nhiều chất điều tiết sinh trởng trạng thái riêng rẽ nh tổ hợp chúng với nhau, nhận thấy môi trờng có bổ xung riêng rẽ BA Kinetin (K) tổ hợp BA với Kinetin mẫu nuôi cấy có khả phát sinh hình thái theo dạng: chồi hay tiền chồi protocorm Kết thí nghiệm đợc thể bảng bảng Bảng 5: ảnh hởng BA đến trình phát sinh hình thái (sau 10 tuần cấy) Chỉ tiêu theo dõi Hệ số nhân Công thức Tỷ lệ Tỷ lệ tạo tạo chồi (%) protocorm (%) I (Đ/C):MS + 100ml ND + 10g ®−êng +1,5ppmBA+ 6,5g agar 1,21 100,00 0,00 I + 0,5mg Benzin Adenin 1,67 34,80 65,20 I + 1,0mg BA 2,40 31,24 68,76 I + 1,5mg BA 3,78 25,00 75,00 I + 2,0mg BA 3,64 22,25 77,75 I + 3,0mg BA 3,01 18,79 81,21 I + 5,0mg BA 2,98 9,80 90,20 B¶ng 6: ¶nh h−ëng Kinetin đến trình phát sinh hình thái mẫu (sau 10 tuần nuôi cấy) Chỉ tiêu theo dõi Hệ số nhân Công thức Tỷ lệ tạo chồi (%) Tỷ lệ tạo protocorm (%) I (Đ/C): MS + 100ml ND + 10g ®−êng +1,5ppm BA + 6,5g agar 1,21 100,00 0,00 I+ 0,5mg Kinetin 1,54 45,50 54,50 I+1,0mg K 1,70 42,10 57,90 I+1,5mg K 2,56 35,14 64,86 I+2mg K 2,98 33,20 66,80 I+3mg K 3,23 28,74 71,26 I+5mg K 3,01 25,00 75,00 Kết bảng cho thấy việc bổ xung chất điều tiết sinh trởng vào môi trờng nuôi cấy có khả kích thích phát sinh hình thái mẫu Sự phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy theo hai hớng: tạo chồi tạo thể protocorm, đặc biệt phát sinh hình thái theo hớng hình thành protocorm nguồn nguyên liệu cho trình nuôi cấy Kết thí nghiệm cho phép xác định đợc môi trờng thích hợp cho phát sinh hình thái mẫu ban đầu là: MS + 100ml ND + 10g ®−êng + 1,5ppm BA + 6,5g agar 4.3 Giai đoạn nhân nhanh Mục tiêu giai đoạn nghiên cứu nhằm tìm phơng thức tốt ®Ĩ cã ®−ỵc nhiỊu thĨ protocorm nhÊt, thêi gian ngắn 4.3.1 Nghiên cứu ảnh chất điều tiết sinh trởng đến khả nhân nhanh protocorm Qua nhiều thử nghiệm bổ sung chất điều tiết sinh trởng auxin xytokinin vào môi trởng nuôi cấy, nhận thấy để tăng hệ số nhân có BA Kinetin có hiệu Tác động chúng đến hệ số nhân đợc thể bảng Bảng 7: ảnh hởng BA đến khả nhân nhanh (sau tuần nuôi cấy) Chỉ tiêu theo dõi Công thức Hệ số nhân Tỷ lệ chồi Tỷ lệ (%) Protocorm (%) Chất lợng mẫu I (Đ/C) 1,38 4,33 95,67 +++ I+ 0,5ppm Benzin Adenin 1,57 7,72 92,28 +++ I + 1ppm BA 1,71 18,68 81,32 +++ I + 1,5ppm BA 2,17 27,74 72,26 +++ I + 2ppm BA 1,91 13,70 86,30 ++ I + 3ppm BA 1,78 11,28 88,72 ++ LSD (5%) 0,09 B¶ng 8: ảnh hởng Kinetin đến khả nhân nhanh (sau tuần nuôi cấy) Chỉ tiêu theo dõi Hệ số Tỷ lệ chồi Tỷ lệ Chất lợng nhân (%) Protocorm (%) mÉu I (§/C) 1,42 3,33 96,67 +++ I + 0,5ppm Kinetin 1,85 16,57 83,43 +++ I + 1ppm K 2,43 30,26 69,74 +++ I + 1,5ppm K 2,20 20,91 79,09 ++ I + 2ppm K 1,95 12,10 87,90 ++ I + 3ppm K 1,58 7,89 92,11 ++ LSD(5%) 0,13 Công thức Kết bảng cho thấy việc bổ xung BA vào môi trờng nuôi cấy đà làm tăng hệ số nhân so với đối chứng, hệ số nhân tăng (từ 1,38 2,17 lần) tỷ lệ thuận với nồng độ BA bổ xung vào môi trờng từ nồng độ 1,5ppm nhng tăng nồng độ (2ppm) hệ số nhân lại giảm Cùng với tăng hệ số nhân tỷ lệ mẫu hình thành chồi nh chất lợng chồi giảm Tiếp tục nghiên cứu ảnh hởng việc bổ xung kinetin đến hệ số nhân chồi chất lợng chồi tạo Các kết nhận đợc có quy luật tơng tự nh bổ xung vào môi trờng BA Tuy nhiên, kinetin tỏ có hiệu cao so với BA Với nồng độ kinetin 1ppm cho hệ số nhân đạt cao (2,43) tỷ lệ chồi thể protocorm hình thành cân đối có chất lợng cao 10 Mục lục Đặt vấn đề Mơc ®Ých yêu cầu đề tài .1 2.1 Mơc ®Ých cđa ®Ị tµi 2.2 Yêu cầu đề tài: .1 2.2.1 Thu thập mẫu lu giữ nguồn gen 2.2.2 Giai đoạn nhân in vitro 2.2.3 Giai đoạn sau in vitro .2 2.2.3.1 Giai đoạn vờn ơm cấp I 2.2.3.2 Giai đoạn vờn ơm cấp II Vật liệu, nội dung phơng pháp nghiên cứu .2 3.1 VËt liÖu .2 3.2 Néi dung nghiªn cøu 3.2.1 §iỊu tra, thu thập lu giữ nguồn gen 3.2.2 Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho nhân nhanh in vitro 3.2.3 Nghiên cứu nhân nhanh nguồn mẫu 3.2.4 Nghiên cứu tạo hoàn chỉnh .2 3.2.5 Các nghiên cứu giai đoạn sau nuôi cấy mô .3 3.3 Phơng pháp nghiªn cøu Kết thảo luận 4.1 Điều tra thu thập, xác định đối tợng thí nghiệm .4 4.2 Giai đoạn tạo nguồn vật liệu khởi đầu 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hởng thời gian phơng pháp khử trùng đến mẫu đa vào nuôi cấy 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hởng chất điều tiết sinh trởng đến trình phát sinh hình thái mẫu 4.3 Giai đoạn nhân nhanh .9 4.3.1 Nghiên cứu ảnh chất điều tiết sinh trởng đến khả nhân nhanh protocorm 30 4.3.2 Nghiên cứu ảnh hởng môi trờng phơng thức nuôi cấy ®Õn nh©n nhanh protocorm 11 4.3.3 Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trình nh©n nhanh 12 4.3.4 Nghiên cứu ảnh hởng nớc dừa đến khả tạo protocorm lớp mỏng nuôi cÊy 13 4.3.5 Nghiên cứu ảnh hởng chất điều tiết sinh trởng đến khả tạo protocorm lớp máng nu«i cÊy .14 4.3.6 Nghiên cứu khả tái sinh chồi từ protocorm 16 4.4 Giai đoạn tạo hoµn chØnh 16 4.5 Các nghiên cứu giai đoạn sau nuôi cấy mô 18 4.5.1 Nghiên cứu ảnh hởng khối lợng in vitro trồng đến sinh trởng phát triển giai đoạn vờn ơm cÊp I (bån m¹) 18 4.5.2 Nghiên cứu ảnh hởng giá thể đến sinh trởng phát triển cây.19 4.5.3 Nghiên cứu ảnh thời vụ, địa điểm đến tỷ lệ sống địa lan đa vờn ơm cấp I .20 4.5.4 Nghiªn cứu ảnh hởng chế độ dinh dỡng khác đến sinh trởng phát triển địa lan giai đoạn vờn ơm cấp I 20 4.5.5 Nghiên cứu ảnh hởng giá thể khác đến sinh trởng phát triển địa lan giai đoạn vờn ơm cấp II 21 4.5.6 Nghiên cứu ảnh hởng dinh dỡng khác đến sinh trởng phát triển địa lan giai đoạn vờn ơm cấp II 24 Kết luận đề nghị 26 5.1 KÕt luËn 26 Quy trình nhân giống địa lan nu«i cÊy m« .28 5.2 §Ị nghÞ: 29 31 S¶n phÈm III Qui trình nhân nhanh in vitro số giống địa lan quy mô bán sản xuất Thuộc đề tài: Nghiên cứu sử dụng công nghệ tế bào kỹ thuật thị phân tử phục vụ chọn tạo giống trồng M số: KC.04.08 Hà Nội, 11/2004 Qui trình nhân nhanh in vitro số giống địa lan quy mô bán sản xuất Qui trỡnh nhõn nhanh mt s ging địa lan kỹ thuật nuôi cấy mô bao gồm giai đoạn: điều tra thu thập nguồn mẫu giống; khử trùng; xác định quan ni cấy, kích thước, tìm nồng độ chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho phát sinh hình thái quan này; nhân nhanh kỹ thuật cắt lớp mỏng; tạo hoàn chỉnh; xác định tiêu chuẩn invitro; thời vụ cây, giá thể cây, xác định chế độ dinh dưỡng thích hợp Các giai đoạn thực sau: Trong phßng thÝ nghiƯm Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường sử dụng qui trình nhân số giống địa lan mơ tả dựa mơi trường khống theo Murashige Skoog ( 1962) gồm thành phần ghi đây: Lượng pha lít dd mẹ Lượng lấy cho lit môi trường Đa lượng NH4N03 33,0g KN03 38,0g MgS04.7H20 7,4g KH2P04 3,4g * CaCl2 2H20 8,8g Lấy 50ml/1lít (CaCl2 2H20 pha riêng) 2.Vi lượng H3P03 620,0mg MnS04.4H20 2230,0mg ZnS04.4H20 860,0mg KI 83,0mg Mo04 Na2.2H20 Lấy 10ml/1lít 25,0mg CoCI2.6H20 CuS04.5H20 2,5mg 2,5mg 3.Sắt FeSO4.7H20 5,56mg Na2EDTA 7,46mg Lấy 5ml/1lít 4.Vitamin Glycine 400,0mg Axit Nicotinic (B5) 100,0mg Pyridoxin(B6) 100,0mg Thiamin HCl (B1) *Inositol 20,0mg 100,0mg/ 1lít pH =5,8 - 6,0 Ly 5ml/1lớt Các thành phần hoá chất dùng pha chế môi trờng nuôi cấy đợc pha thành dung dịch mẹ nh sau: Dung dịch ĐL: Muối khoáng chính( trừ CaCl2), đợc cân lợng nh bảng đây, hoà tan chất, pha hỗn hợp lên thể tích 1lít Khi dùng pha 1lit môi trờng đong 50ml lợng dung dịch + Dung dịch CaCl2: Cân lợng 8,8g hoà tan nớc cất lên thể tích 1lít Đong 50 ml dung dịch pha 1lít môi trờng + Dung dịch vi lợng: cân lợng hoá chất nh bảng trên( pha mĐ cho 200 lit m«i tr−êng), pha tan tõng chất với nớc cất, lên thể tích lít Khi pha môi trờng lấy 10ml dung dịch + Dung dịch sắt: cân riêng hoà tan hai lợng muối nớc cất nóng vừa pha vừa đun nhẹ + Dung dịch vitamin: Thành phần gồm vật chất hữu vitamin Cân lợng chất nh bảng dới đây, pha nớc cất thành lít Ghi chú: loại dung dịch ph¶i b¶o qu¶n ë 4°C Mơi trường khống bổ xung thêm chất kích thích sinh trưởng tuỳ theo mục đích sử dụng BA để kích thích tái tạo protocorm, kinetin có tác dụng tái tạo chồi từ lát cắt mỏng, αNAA than hoạt tính có tác dụng tạo rễ hình thành hồn chỉnh Về tính tác dụng chất kích thích sinh trưởng nêu sau: BA( tên đầy đủ benzyladenin) có hoạt tính auxin, khơng mạnh kinetin Sự có mặt BA với nồng độ thích hợp mơi trường ni câý tạo nên cân chất điều hoà sinh trường, khiến cho ưu chồi bị phá vỡ, chồi phát triển thành cụm chồi Kinetin hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên thuộc nhóm Cytokinin, kích thích phân bào tạo chồi với mơ phân sinh Trong mối tương tác cân động với BA, Kinetin cho phép giữ cho khối mô nuôi cấy phát triển theo dạng định, chẳng hạn dạng cụm chồi non hoàn toàn hay cụm chồi cho nhiều chồi già αNAA( tên đầy đủ Naptinaxeticacid) có hoạt tính au xin Sự có mặt αNAA nồng độ thích hợp mơi trường ni cấy tạo nên cân chất điều hoà sinh trưởng, từ có q trình tái tạo rễ Than hoạt tính khơng phải chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng hấp phụ bớt chất điều tiết sẵn có cịn tồn dư giai đoạn nhân nhanh, làm cho mối cân auxin cytokinin thuận lợi theo xu hướng thuận lợi cho vic hỡnh thnh r Pha 100 ml loại chất BA, kinetin, αNAA theo tû lƯ 1:1 nh− sau: C©n 100mg loại, cho vào lọ thuỷ tinh sạch, thêm Na0H 0,1N tan hết lên thể tích 100ml Khi sử dụng lấy chất ĐTST phải sử dụng dụng cụ Tiến hành pha chế môi trờng: mẻ 20 lít Phần 1: Cân 130g agar bột vào nồi đun môi trờng (nồi thuỷ tinh hay kim loại) thêm khoảng lít nớc cất, đặt lên bếp đun cho thạch tan hoàn toàn Phần 2: Cân 200g đờng saccaroza+ lít nớc+ lít dung dịch ĐL+1 lít dung dịch CaCl2+0,2lít dung dịch vi lợng+ 0,1 lít dung dịch sắt + 0,1 lít dung dịch vitamin+ 2g myo innositol+ nớc dừađo pH chỉnh 5,8 dung dịch Na0H 0,1N; HCl 0,1N Trộn hai phần với thêm nớc cất cho đủ thể tích 20 lít Dùng máy phân phối môi trờng cho vào bình tam giác 50 hay 70ml, nút bình tam giác không thấm nớc, bọc nút nút giấy khử trùng 20 phút 120C Tiến hành đặt bình tam giác nơi khô mát, vô trùng khoảng tuần Ly mu vt: Chi nh, mt ngủ chồi non tách từ mẹ khoẻ mạnh Tiến hành tách cắt chồi bên có chiều cao từ đến cm Khử trùng: Dụng cụ sử dụng trực tiếp khử trùng bình trụ có nắp Các chồi bên sơ rửa dung dịch nước xà phòng Lần 1: dùng HgCl2 0,1% khử trùng phút Lần 2: bóc loại bỏ hồn tồn bao ngồi, khử trùng lại HgCl2 0,1% phút Cấy mẫu vật kích thích q trình phát sinh hình thái: dùng dao mổ vô trùng tách bỏ hết phần vỏ bao, phần mô bị tổn thương khử trùng, để lại phần chồi bên tinh có kích thước nhỏ khoảng 5x5mm Dùng panh cấy lên môi trường (MS+ 10% nước dừa+ 10g Saccroza + 6,5g agar+1,5mg BA)/1lít; pH: 5,8; lượng mơi trường 70ml/1 bình tam giác, hấp khử trùng 20 phút 120°C; Các bình mẫu ni điều kiện: nhiệt độ 20 - 25°C, cường độ chiếu sáng: 3000 – 3500 lux, quang chu kỳ: 16 sáng/ tối Trong điều kiện mẫu cấy phát sinh hình thái tạo chồi tiền chồi( thể protocorm) Nhân nhanh: sản phẩm giai đoạn khởi động mẫu nguồn vật liệu( phương pháp cắt lớp mỏng) cho giai đoạn Trong giai đoạn nhân nhanh thu hai dạng: tiền chồi, chồi Thể tiền chồi(dạng protocorm tiếp tục cắt thành lát mỏng có kích thước từ 0,3 – 0,5 mm, cấy môi trường (MS+ 15% nước dừa+ 10g Saccroza + 6,5g agar +1,0mg Kinetin 0,5mg BA)/1lít ; pH: 5,8; lượng mơi trường 70ml/1 bình tam giác, hấp khử trùng 20 phút 120°C; Các bình mẫu ni điều kiện: nhiệt độ 20 - 25°C, cường độ chiếu sáng: 3000 – 3500 lux, quang chu kỳ: 16 sáng/ tối Tất chồi có chiều cao khoảng 5,5 – 6,5 cm chuyển sang giai đoạn sau, giai đoạn tạo hoàn chỉnh Hệ số nhân nhanh: sau tuần ni cấy vịng nhân nhanh lặp lại, việc nhân nhanh tiến hành quanh năm với hệ số nhân 6,236 Tạo hồn chỉnh:Các chồi có chiều cao 5,5 – 6,5 cm, mập khoẻ chuyển vào mơi trường kích thích rễ sau: (MS+ 10g Saccroza + 6,5g agar+ 0,3mg αNAA 1g than hoạt tính)/1lít ; pH: 5,8; lượng mơi trường 50ml/1 bình tam giác, hấp khử trùng 20 phút 120°C; Các bình mẫu ni điều kiện: nhiệt độ 20 - 25°C, cường độ chiếu sáng: 3000 – 3500 lux, quang chu kỳ: 16 gi sỏng/ gi ti Quy trình nhân giống địa lan nuôi cấy mô Chồi bên - cm Khư trïng b»ng HgCl2 0,1% lÇn phút phút Tạo protocorm (sau tuần nuôi cÊy) MS + 100ml ND + 10g Saccaroza + 1,5mg BA + 6,5g agar/lít Nuôi cấy lát mỏng tế bào (0,3 - 0,5mm) Nhân nhanh (sau tuần nuôi cấy) MS +15%ND+1mg Kinetin (hc 0,5mg BA) + 10g saccaroza + 6,5g agar Ra rễ cho in vitro (4 tuần) Tạo hoàn chỉnh MS +10g saccaroza + 0,3mgNAA (hoặc 1g than hoạt tính) + 6,5g agar/lít Cây có khối lợng gam - Giá thể dớn - Thời vụ : từ thu đến đầu hè Vờn ơm cấp I (3 tháng) Vờn ơm cấp II - Dinh d−ìng: dung dÞch (A,B) ë - Nền giá thể 1/2 mùn + 1/4 dơng xỉ + 1/4 phân dê - Dinh dỡng: 30:10:10 +vi lợng + vitamin quy trình sản xuất vạn in vitro/ năm 50 Chồi (1 mắt ngủ + chồi đỉnh) tuần 100 mẫu 10 tuần 25 bình mẫu tuần (nuôi cấy lát mỏng) 120 bình mẫu tuần 280 bình mẫu tuần 600 bình mẫu tuần 1200 bình mẫu 600 bình chồi 600 bình mẫu (10 chồi/bình) 6000 hoàn chỉnh 600 bình chồi 6000 hoàn chỉnh 12000 Quy trình công nghƯ sau nu«i cÊy m« Giai đoạn vườn ươm cp I: * Chuẩn bị nhà trồng cây: Vờn ơm cấp cần có yêu cầu sau: + Lới đen che nắng: dùng loại lới che 80 - 85 % ¸nh s¸ng + M¸i che m−a ( cã thĨ dùng ni lông mái nhựa) + Giàn để (cao 40 50 cm) + Vờn đợc đặt vị trí thông thoáng * Chuẩn bị Cỏc sau giai đoạn tạo hồn chỉnh có đủ tiờu chun Cây in vitro có trọng lợng > gam cã – l¸, – rƠ đợc đa khỏi phòng nuôi cấy để dới ánh sáng tán xạ cho quen dần với điều kiện môi trờng tự nhiên Sau 2- tuần dùng panh gắp khỏi bình nuôi cấy thả vào chậu nớc rửa hết agar bám rễ sau rửa lại thêm đến lần xếp vào rổ để chỗ mát cho nớc * Chuẩn bị giá thể: Dớn khô bỏ vào chậu nớc cho hút nớc đến bÃo hoà Sau vắt kiệt nớc chuấn bị để trồng Vờn ơm trồng rổ tha có khả thoát nớc tốt.Dới đáy rỉ lãt líp xèp vơn 2- cm TiÕp theo lớp xơ dừa cho lớp cách mặt rổ cm lớp giá thể xơ dừa vừa có tác dụng tiết kiệm dớn vừa có tác dụng làm thông thoáng * Cách trồng Dùng dớn đà vắt khô quấn cho kín hết rễ (khi quấn cần để hở phần cổ rễ) xếp vào rổ có xơ dừa đà chuẩn bị sẵn với mặt độ 60 – 70 c©y/rỉ cã diƯn tÝch 0,25 m2 Phun mï bề mặt cho ớt dùng vòm che ni lông bao lấy rổ (vòm che cao mặt rổ 20- 30 cm chọc lỗ nhỏ) Một ngày mở ni lông phun mù nh 3- lần Sau đến ngày bỏ vòm che rổ Sau bỏ vòm che trì chế độ tới ẩm 70 80 % (chể độ tới vờn ơm hoàn toàn phun sơng) Tuỳ theo thời vụ khác mà sau tuần tiền hành cung cÊp dinh d−ìng cho c©y sử dụng dinh dưỡng AB( theo tỷ lệ 1:1, nồng độ 1/250) lÇn/tuÇn phun ớt Sau thỏng cỏc cõy chuyển sang vườn ươm cấp II Vườn ươm cp II: Khu vờn trồng cấp cần chuẩn bị tơng tự nh vờn ơm cấp có phần lới che sáng giảm bớt nghĩa giai đoạn cần dùng lới che ánh sáng loại 50 60% ánh sáng * Chuẩn bị giá thể, chậu trồng + Phân dê ủ kỹ sau tháng dùng đợc + Rễ dơng xỉ chạt nhỏ thành đoạn cm + Mùn Ba loại đợc trộn theo tỷ lệ 1/2 mùn :1/4 rễ dơng xỉ :1/4 phân dê trộn + ChËu trång: sư dơng chËu nhùa ®en mỊm, chiỊu cao 20 – 30 cm ®−êng kÝnh 10 – 15 cm Giá thể trộn xong cho vào chậu cách mặt chậu cm nhấc từ rổ đặt vào chËu trång c©y/chËu Trång c©y hë cỉ rƠ, sau trồng xong xếp lên giá phun cho ớt giá thể 10 Duy trì độ ẩm (75 80%) đặc biệt độ ẩm không khí thông thoáng quan trọng Sau trồng sang chậu đợc tuần tới bổ xung thêm dinh dỡng tuần/ lần loại phân có tỷ lệ ni tơ cao (N:P:K=30:10:10) * Phòng trừ sâu bệnh Đối tợng sâu bệnh hại địa lan vờn ơm cấp vờn sản xuất bệnh thối khuẩn thờng xuất nhiều nhiệt độ không khí cao, ma kéo dài hay trời có sơng ẩm độ không khí > 90% Vì thờng sau có tợng tiến hành phun phong cho loại thuốc sau: Alli S, SOM5D với lợng thuốc gam/lít phun sơng cho ớt giá thể 11 Sơ đồ Quy trình công nghệ sau nuôi cấy mô Cây in vitro Khối lợng >1g, lá/cây; rễ/cây Vờn ơm cấp i - Giá thể: Dớn - Thời vụ: Thu - đầu hè (tại Hà Nội); tất thời điểm (tại Sapa Lào Cai) - Độ ẩm vờn: 80 85% - Độ sáng: 50 – 60% - Dinh d−ìng: ph©n láng AB tû lệ 1:1 nồng độ 1/250 tháng Vờn ơm cấp ii - Giá thể: 1/2 mùn + 1/4 dơng xỉ + 1/4 phân dê - Độ ẩm vờn: 80 85% - Độ sáng: 70 80% - Dinh dỡng: - Dinh d−ìng: 30:10:10 +vi l−ỵng + vitamin cđa MS 12 ... S¶n phÈm III Qui trình nhân nhanh in vitro số giống địa lan quy mô bán sản xuất Thuộc đề tài: Nghiên cứu sử dụng công nghệ tế bào kỹ thuật thị phân tử phục vụ chọn tạo giống trồng M số: KC.04.08... 11/2004 Qui trình nhân nhanh in vitro số giống địa lan quy mô bán sản xuất Qui trỡnh nhõn nhanh mt số giống địa lan kỹ thuật nuôi cấy mô bao gồm giai đoạn: điều tra thu thập nguồn mẫu giống; khử... trình nhân giống địa lan nuôi cấy mô nh sau: 27 Quy trình nhân giống địa lan nuôi cấy mô Chồi bên - cm (đỉnh chồi, mắt ngủ) Khử trùng HgCl2 0,1% lần phút phút Tạo protocorm (sau tuần nuôi cấy)