Nghiên cứu sản xuất artemisinin bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thanh hao (artemisinin bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thanh hao (artemisinin annua l ) và phát triển trên quy mô pilot (giai đoạn 2007 2008)

Tổng quan tài liệu 8Kết quả nghiên cứu 36I. Chọn dòng thanh hao trên đồng ruộng và in vitro 37.................................................................1. Chọn dòng thanh hao trên vườn ươm và đồng ruộng......................................................... 382. Chọn dòng thanh hao in vitro .......................................................................................................41II. Nuôi cấy tếbào thanh hao .......................................................................................................483. Nuôi cấy phát sinh tếbào mô sẹo thanh hao trên môi trường bán rắn (agar) 504. Nuôi cấy dịch huyền phù tếbào thanh hao trong môi trường lỏng 585. Nuôi cấy dịch huyền phù tếbào thanh hao trong bioreactor ....................................................................................................................................63III. Nuôi cấy rễtơthanh hao .........................................................................................................746. Chọn mô thanh hao nuôi cấy phát sinh rễtơ.....................................................................777. Nuôi cấy chuyển nạp gen rễtơvào mô lá thanh hao .........................................................808. Nuôi cấy rễtơthanh hao trên môi trường bán rắn (agar) 829. Nuôi cấy rễtơthanh hao trong môi trường lỏng ...................................................................8910. Nuôi cấy rễtơthanh hao trong bioreactor............................................................................. 96IV. Phương pháp phân tích và tinh chếartemisinin ...................................................................10211. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TCL) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 10312. Phương pháp chiết suất và tinh chếartemisinin................................................................. 110Kết luận và Đềnghị118Tài liệu tham khảo 119Phụlục

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH HỢP TÁC KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

MALAYSIA – VIỆT NAM

ĐỀ TÀI THỰC HIỆN NGHỊ ĐỊNH THƯ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ARTEMISININ

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.) VÀ PHÁT TRIỂN TRÊN QUY MÔ

PILOT (GIAI ĐỌAN 2007-2008)

Cơ quan chủ quản VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

Cơ quan chủ trì VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI

Chủ nhiệm đề tài PGS.TS TRẦN VĂN MINH

8145

Tp Hồ Chí Minh 8-2009

I Chọn dòng thanh hao trên đồng ruộng và in vitro 37

1 Chọn dòng thanh hao trên vườn ươm và đồng ruộng 38

3 Nuôi cấy phát sinh tế bào mô sẹo thanh hao trên môi

6 Chọn mô thanh hao nuôi cấy phát sinh rễ tơ 77

7 Nuôi cấy chuyển nạp gen rễ tơ vào mô lá thanh hao 80

8 Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trên môi trường bán rắn

(agar)

82

9 Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trong môi trường lỏng 89

10 Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trong bioreactor 96

IV Phương pháp phân tích và tinh chế artemisinin 102

11 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TCL) và sắc ký lỏng

12 Phương pháp chiết suất và tinh chế artemisinin 110Kết luận và Đề nghị 118Tài liệu tham khảo 119Phụ lục

TÓM TẮT

1 Chọn dòng thanh hao trên vườn ươm và đồng ruộng

Trong điều kiện nhiệt đới (TPHCM), trồng thử nghiệm vào tháng 2/1-20/4/2008 (ngày ngắn), đã chọn được hai dòng TC1.8 và TC2.1 có hàm lượng artemisinin tương ứng là 0,448% và 0,408% Trong điều kiện vùng cao (Đà Lạt), trồng thử nghiệm vào tháng 20/1-30/6/2009 (ngày ngắn), đã chọn lọc được hai dòng TC1.136 và TC2.29 có hàm lượng artemisinin tương ứng 1,470% và 1,297%

2 Chọn dòng thanh hao in vitro

Môi trường khoáng LV thích hợp cho quá trình chọn dòng in vitro Hai dòng Thanh hao TC1.8 và TC2.1 thể hiện bản chất di truyền thấp cây

so với cây mẹ trên vườn ươm Phương pháp chọn dòng in vitro đáp ứng được yêu cầu chọn dòng nhanh hao trong điều kiện nhiệt đới Hai dòng Thanh hao chọn lọc thể hiện được khả năng nhân giống, tạo mô sẹo và tái sinh mô sẹo in vitro trên cùng điều kiện môi trường nuôi cấy

3 Nuôi cấy phát sinh tế bào mô sẹo thanh hao trên môi trường bán rắn (agar)

Thân lá rễ được sử dụng làm mẫu nuôi cấy phát sinh mô sẹo Môi trường nuôi cấy thích hợp phát sinh và tăng sinh mô sẹo: LV + BA (0,5mg/l) + NAA (0,5mg/l) Môi trường thích hợp cho tái sinh mô sẹo là

LV + BA (3mg/l) + NAA (0,2mg/l) Mô sẹo có màu trắng khi để trong tối

và có màu xanh khi để dưới ánh sáng

4 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thanh hao trong môi trường lỏng

Kết quả nghiên cứu trên agar và môi trường lỏng tương thích nhau Môi trường thích hợp cho nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù là LV và B5 Môi trường dinh dưỡng khoáng B5 thích hợp cho tổ hợp NAA+kinetin: B5 + NAA (1mg/l) + kinetin (0,5mg/l) Môi trường dinh dưỡng khoáng LV

thích hợp cho tổ hợp BA+NAA: môi trường thích hợp cho tăng sinh mô sẹo và tăng sinh dịch huyền phù tế bào là LV + BA (0,5mg/l) + NAA (0,5mg/l) + pepton (1g/l) Thời gian cấy truyền thích hợp là sau 3 tuần nuôi cấy có tốc độ tăng sinh tế bào cao nhất (17,2)

5 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thanh hao trong bioreactor

Kết quả nghiên cứu cho thấy trên môi trường nuôi cấy phát sinh mô sẹo phôi hóa, là dạng tế bào tiền phôi được nhân sinh khối, có khả năng tổng hợp được artemisinin LV + NAA (0,5mg/l) + BA (0,5mg/l) cần phải điều chỉnh hàm lượng các chất khoáng và bổ sung như: đường sucrose (30g/l), đạm tổng số (40mM), tỷ lệ giữa NH4+/NO3- (15/60), nồng độ

KH2PO4 (200mg/l), GA3 (1mg/l), yeast extract (100mg/l) hay chitosan (150mg/l) đã cải thiện khả năng tích tụ artemisinin trong tế bào 0,432%

6 Chọn mô thanh hao nuôi cấy phát sinh rễ tơ

Môi trường khoáng B5 thích hợp cho quá trình nuôi cấy phát sinh rễ

Sự phát sinh rễ mạnh mẽ với mẫu nuôi cấy là lá và nồng độ NAA (0,5mg/l) Cytokinin (BA, kinetin) và IAA, IBA không thích hợp cho quá trình phát sinh rễ

7 Nuôi cấy chuyển nạp gen tạo rễ tơ vào mô lá thanh hao

Lá từ chồi thực sinh in vitro được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy chuyển gen Phương pháp dùng agrobacterium tỏ ra hiệu quả Đã thu nhận được mô lá chuyển gen đã loại hẳn agrobacterium Rễ tơ hình thành mạnh

mẽ trên môi trường MS không chất sinh trưởng và được sử dụng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu về sau

8 Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trên môi trường bán rắn (agar)

Cytokinin không kích thích tăng sinh rễ nhưng 2iP kích thích tích tụ artemisinin Auxin kích thích tăng sinh rễ nhưng không kích thích tích tụ artemisinin Bổ sung chất điều hòa sinh trưởng vào ngày thứ 14 sau cấy có

ý nghĩa kích thích tăng sinh rễ và tích tụ artemisinin với tổ hợp TH1 [B5+

GA3 (0,01mg/l) + ABA (0,1mg/l) + NAA (5mg/l)]

9 Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trong môi trường lỏng

Môi trường MS cải tiến có đạm nitrate (30mM), tỷ lệ NH4+/NO3

-(1/5), đường sucrose 50g/l, KH2PO4 (1,5mM), GA3 (5mg/l), NAA (0,5mg/l) cải thiện khả năng tích tụ artemisinin (1,468%)

10 Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trong bioreactor

Môi trường MS cải tiến, 26+2oC, 16 giờ chiếu sáng /ngày, pH=6 đã cải thiện khả năng tích tụ artemisinin (1,982%) kết hợp với bioreactor bán chìm nổi theo chế độ ngập/nổi (15/45) đã nâng cao hiệu quả tích tụ artemisinin rõ rệt (2,088%) Yeast extract và chitosan kích thích tích tụ artemisinin có hiệu quả

11 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TCL) và sắc ký lỏng cao

áp (HPLC)

Đã xây dựng được phương pháp phân tích và điều chế artemisinin từ mẫu cây Thanh hao cấy mô, mô sẹo soma, mô sẹo phôi hóa, dịch huyền phù tế bào (nuôi cấy trên máy lắc và bioreactor), rễ (nuôi cấy trên máy lắc

và bioreactor)

TỒNG QUAN TÀI LIỆU

tùy địa phương

Vòng đời: Trứng muỗi nổi từng chiếc trên mặt nước, hình thon dài khoảng 1mm, có hai phao hai bên, nở sau 2–3 ngày thành bọ gậy Bọ gậy

ăn các hạt hữu cơ nhỏ Ở vùng nhiệt đới, từ khi trứng nở tới muỗi trưởng thành khoảng 11 – 13 ngày

Tập tính: Muỗi Anophele hoạt động từ khi mặt trời lặn đến khi mặt

trời mọc Mỗi loài khác nhau về giờ đốt mồi cao điểm và địa điểm đốt mồi (trong nhà hay ngoài nhà) Muỗi thường nghỉ trong suốt thời gian cần thiết

để tiêu máu và phát triển trứng ngay trong nhà hay ở các bụi cây Chúng thường đẻ trứng ở các vũng, rãnh, ruộng nước, nơi nước lặng trong suối nước chảy chậm

Các loài Anophele khác nhau về mức độ thích đốt người hay đốt súc

vật Một số loài đốt cả người và súc vật; một số chủ yếu đốt súc vật, số khác chỉ đốt người Các loài đốt người là những loài truyền sốt rét nguy hiểm nhất

Những điểm phân biệt muỗi Anophele với các loài muỗi khác

• Chiều dài của pan bằng chiều dài của vòi

• Ở tư thế nghỉ, vòi và thân muỗi thường hợp thành với mặt phẳng muỗi đậu một góc nhọn Góc này thay đổi tùy loài, từ nhọn đến gần

900 Ngoại trừ loài Anophele culicifacies, thân hầu như song song với mặt

bằng muỗi đậu (www.bio.ioit-hcm.ac.vn)

Bệnh có những triệu chứng nguy hiểm, người bệnh có thể chết 12 giờ sau khi có biểu hiện triệu chứng Biểu hiện lâm sàng của bệnh với 3

dấu hiệu: sốt rét run vã mồ hôi, thiếu máu, gan to, lách to Có nhiều thể lâm

sàng: sốt cách nhật do P vivax (hay P ovale ở Châu Phi), có thể tái phát sau khi rời khỏi vùng dịch; sốt cách nhật ác tính do P falciparum, không tái phát khi rời vùng dịch; sốt cách hai ngày do P malariae, có thể tái phát sau khi rời vùng dịch Sốt rét do P falciparum thường có nhiều biến chứng

nặng: sốt rét ác tính, sốt nôn ra mật, đái ra hemoglobin gây tử vong cao

Cơ thể những người bị bệnh sốt rét nhiều lần sẽ xuầt hiện hệ thống miễn dịch lại vi khuẩn Tuy nhiên, hệ thống này chỉ tồn tại trong một hay hai năm sau khi nhiễm bệnh Vì thế, người ta không thể miễn dịch được với

vi khuẩn sốt rét dù đã nhiều lần bị bệnh Hiện chúng ta vẫn chưa có vaccin

phòng ngừa bệnh ( http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn )

Ở Việt Nam đã xác định có hơn 60 loài Anophele Các loại muỗi

Anophele minimus, A dirus, và A sundaicus mang hai ký sinh trùng sốt rét,

P falciparum và P vivax Các loại muỗi này cũng có nhiều ở Ðông Nam

Á Ký sinh trùng P vivax xuất hiện giới hạn trong khu vực đồng bằng sông Cửu Long, trong khi P falciparum thường có ở các vùng núi và cao

nguyên như Tây nguyên, Hoàng Liên Sơn, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Tĩnh

là các nơi đã xảy ra nhiều dịch sốt rét trong thập niên 1980 đến đầu những năm 1990 Một số loài muỗi khác được nghi ngờ truyền gây sốt rét ở Việt

Nam là A campestris, A culicifacies, A lesteri

2 Bệnh sốt rét và những nghiên cứu về bệnh sốt rét

Cách đây trên 10.000 năm, bệnh sốt rét đã có ở Châu Phi Cách đây khoảng 5.000 – 10.000 năm, bệnh có ở Mesopotamia, bán đảo Ấn Độ và Đông Nam Á Từ thế kỷ 19, bệnh sốt rét có mặt trên khắp thế giới Đến đầu thế kỷ 20, hàng triệu người trên khắp thế giới đã chết vì loại bệnh này Tuy nhiên, vào những năm đầu thập niên 1950, bệnh sốt rét hầu như đã biến mất khỏi Bắc Mỹ và Châu Âu, nạn nhân sốt rét hiện nay chủ yếu là ở Châu

Phi (www.malariasite.com)

Năm 1880, thầy thuốc người Pháp là Alphonce Laveran (1845–1922)

đã phát hiện ra vi trùng gây bệnh sốt rét (giải Nobel Năm 1907) – căn bệnh

làm chết người ở các nước nhiệt đới và Á nhiệt đới nhiều hơn bất kỳ bệnh nào khác

Năm 1897, Ronald Ross (1857 – 1932), bác sĩ người Anh nghiên cứu

về côn trùng học khi nghiên cứu muỗi truyền bệnh sốt rét, đã phát hiện ra

ký sinh trùng bệnh này trong muỗi Anophele Năm 1902, ông đã được trao

giải Nobel về thành tựu này

Sốt rét do ký sinh trùng sốt rét thuộc giống Plasmodium gây nên Ở người, do 4 loài Plasmodium falciparum, P vivax, P malariae và P ovale Trong đó, P falciparum là loại gây sốt rét ác tính, có tỉ lệ tử vong cao, nhất

là ở trẻ em ; P vivax và P ovale gây sốt cách nhật lành tính Đôi khi, P

vivax cũng gây sốt rét ác tính

các quần thể muỗi Anophele lại phát triển theo mùa (phụ thuộc nhiệt độ và lượng mưa) nên sốt rét có 2 điểm cao vào đầu và cuối hoặc trong suốt mùa mưa Bệnh lây truyền ở nơi có nhiệt độ trung bình trên 14,5oC Nước ta thuộc vùng nhiệt đới, nhiệt độ trung bình cao hơn nhiệt độ trên, do vậy

bệnh lan truyền quanh năm Do nhiệt độ và lượng mưa dao động theo chu

kỳ mùa (mùa mưa và mùa khô) nên bệnh cũng phát triển không đều hằng tháng mà thường có 2 đỉnh cao trong năm, đỉnh đầu năm (tháng 4 đến tháng 6), đặc biệt đỉnh cuối năm vào mùa mưa: từ tháng 8 đến tháng 11

Hình 1: Ký sinh trùng Plasmodium falciparum xâm nhập vào tế bào hồng cầu

Nhiệt độ tốt nhất để ký sinh trùng sốt rét phát triển trong cơ thể muỗi

là từ khoảng 28–30oC Nếu nhiệt độ trung bình là 28oC thì P falciparum cần hơn 9 ngày, P.vivax chỉ cần hơn 7 ngày; nếu nhiệt độ trung bình là

30oC thì P falciparum cần hơn 8 ngày, P vivax cần hơn 6 ngày để hoàn

thành giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi từ thể giao bào (gametocytes)

ở dạ dày đến thể thoa trùng (sporozoites) ở tuyến nước bọt và có khả năng truyền bệnh Muỗi đốt máu người và truyền ký sinh trùng sốt rét sang cho

người lành để gây bệnh (Theo Sức Khỏe & Đời Sống:

http://www.netcenter.com.vn )

Hình 2: Chu trình của bệnh sốt rét ( http://www.dpd.cdc.gov )

Hình 3: Ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum phá vỡ hồng cầu

Bệnh sốt rét đã trở thành vấn đề toàn cầu, là căn bệnh thường thấy ở

105 quốc gia, phổ biến ở nhiều vùng thuộc châu Á, châu Phi, Trung Mỹ và Nam Mỹ Hàng năm, có 300 – 500 triệu người trên khắp thế giới bị nhiễm bệnh và hơn một triệu người chết vì loại bệnh này Tình trạng mắc bệnh và

tử vong, đặc biệt là ở trẻ em và thai phụ do sốt rét gây nên đang ở báo động mạnh Du khách và dân nhập cư mang bệnh sốt rét là một trong những nguyên nhân khiến bệnh sốt rét lan truyền khắp thế giới

Mỗi ngày tại châu Phi có đến 3.000 trẻ em tử vong vì sốt rét (thống

kê năm 2003), nghĩa là cứ mỗi 30 giây lại có một em chết vì căn bệnh này

Hai loại muỗi A gambiae và A funesus được xem là “vô địch” trong lĩnh

vực truyền bệnh cho người tại đây Bệnh gây thiệt hại khoảng 12 tỷ USD/năm cho châu Phi, chiếm đến 40% ngân sách phục vụ sức khỏe cộng đồng (Thanh Vân - theo Eurekalert)

Hình 4: Bản đồ tình trạng bệnh sốt rét trên thế giới

Việt Nam cũng nằm trong khu vực sốt rét nặng của thế giới Khoảng

60 năm trước, mỗi năm nước ta có gần 1 triệu người mắc bệnh, chiếm 5% dân số (Morin, 1926), tỉ lệ tử vong đến 20% Chương trình Thanh toán sốt rét được tiến hành từ năm 1960 nhưng hiện vẫn có khoảng 45 triệu dân ta

sống trong vùng lưu hành sốt rét Các vùng này chiếm 3/4 diện tích cả nước gồm vùng rừng núi phía Bắc, ven dọc Trường Sơn, cao nguyên miền Trung, khu vực Đông Nam, Tây Nam và miền duyên hải

(http://www.suckhoedoisong.vn/)

Liệu pháp chữa trị và kiểm soát bệnh sốt rét đang trở nên khó khăn hơn do chiều hướng kháng thuốc của ký sinh trùng và chiều hướng kháng thuốc diệt côn trùng của muỗi đang gia tăng Mặc dù vậy, chỉ có 4 trong số khoảng 1.400 loại thuốc mới, được phát triển trong giai đoạn từ 1975 đến

1999 là để chống sốt rét Vì thế, hiện nay sốt rét vẫn là một căn bệnh khó tiêu diệt Các nhà khoa học vẫn không ngừng nghiên cứu nhằm tìm ra một loại thuốc mới điều trị sốt rét hiệu quả hơn

Theo báo cáo của Viện Y học (IOM), bệnh sốt rét đang tái phát ở mức độ cao, từ đó nhấn mạnh đến việc cần thiết phải bổ sung nguồn thuốc cấp bách với giá thành rẻ hơn nhưng có thể thay thế các thuốc trị sốt rét cũ

Hơn 100 năm từ khi muỗi Anophele và ký sinh trùng Plasmodium

falciparum được biết đến, con người vẫn chưa tận diệt được các loại

Anophele hay trị được ký sinh trùng trong mọi trạng thái của chu kỳ sống

của nó trên người bệnh và trên vector muỗi

Năm 1998, với sự hợp tác của Ngân hàng Thế Giới (WB), Quĩ Liên hiệp quốc vì trẻ em (UNICEF) và Chương trình Vì sự phát triển của Liên hiệp quốc (UNDP), WHO đã ra chương trình "Ðẩy lùi sốt sét" (RBM-Roll Back Malaria) để đẩy mạnh nghiên cứu, hy vọng đẩy lùi được bệnh sốt rét với mục tiêu giảm nửa số tử vong cho đến năm 2010 Cũng trong năm

1998, Chương trình tìm thuốc chống sốt rét (MMV-Medicines for Malaria Venture) được thành lập tại Geneva, nhằm gây quỹ để khám phá và phát triển được ít nhất một loại thuốc mới trị sốt rét mỗi 5 năm Hiện MMV có 7 chương trình nghiên cứu thử nghiệm các loại thuốc mới Ở Hoa Kỳ, năm

1999, Chương trình chế tạo thuốc chủng ngừa sốt rét (MVI-Malaria Vaccine Initiative) được thành lập

Tuy nhiên, với sự xuất hiện của muỗi kháng DDT và của ký sinh

trùng P falciparum kháng chloroquinine bắt đầu từ Đông Nam Á và Nam

Mỹ sau đó lan ra các vùng khác, sự hữu hiệu của giải pháp trên đã giảm đi Hiện nay, trong 4 ký sinh trùng gây bệnh, chloroquinine chỉ còn có tác

dụng hiệu quả duy nhất với P ovale

Tháng 10/2002, hai tạp chí khoa học Science và Nature đã công bố

toàn bộ bộ gen (geneomes) của ký sinh trùng P falciparum (loại ký sinh trùng nguy hại nhất trong 4 loại (P falciparum, P vivax, P malariae và P

ovale) và của muỗi Anophele gambiae, loại muỗi chủ yếu ở Phi châu mang

cả 4 loại ký sinh trùng trên

Sử dụng bản đồ gen để so sánh phản ứng của các ký sinh trùng khi tiếp xúc với các loại thuốc chống sốt rét khác nhau, các nhà khoa học đã xác định được một vùng gen mới lạ có liên quan rất lớn đến việc kháng lại thuốc chloroquine So sánh các vùng gen của các loài ký sinh trùng từ các

châu lục khác nhau, thấy rằng các mẫu ký sinh trùng sốt rét P falciparum ở

Châu Phi có sự biến đổi DNA lớn hơn rất nhiều so với những các mẫu ở Châu Á và Châu Mỹ

Hình 6: Bảng giải mã chromosome 3 của Plasmodium falciparum

Hiện nay, thuốc xịt muỗi DDT vẫn được dùng ở một số nơi, hạn chế trong xó nhà chỗ muỗi hay trú ngụ DDT tuy không còn hiệu quả như xưa, nhưng nó vẫn giảm được tuổi thọ của muỗi kháng thuốc Lý do chính mà DDT không còn được dùng rộng rãi nơi công cộng và đã bị cấm ở nhiều nước vì DDT là một chất ô nhiễm hữu cơ bền (POP-Persistent Organic Pollutant), không dễ dàng bị huỷ

Để diệt ký sinh trùng sốt rét, thuốc phổ thông được dùng từ nhiều năm nay là các thuốc có chất hoá học dựa vào hợp chất thiên nhiên như chloroquinine, ta vẫn gọi là ký ninh, chế tạo từ vỏ cây quina-quina gốc ở Nam Mỹ

Thuốc trị ký sinh trùng sốt rét: tốt và hiệu nghiệm nhất hiện nay là

artemisinin lấy từ cây Thanh hao (quinghao) mà Trung Quốc đã tìm ra đầu thập niên 1970, áp dụng thành công trong các thử nghiệm lâm sàng và hiện được dùng rộng rãi Artemisinin có tác dụng diệt nhanh chóng các ký sinh trùng lưu thông trong máu và khi dùng chung với các thuốc chống sốt rét khác cho kết quả rất tốt, làm giảm nhiều xác suất tái xuất hiện của các ký sinh trùng kháng thuốc

Tại Việt Nam, hai danh y Tuệ Tĩnh và Hải Thượng Lãn Ông cũng đã dùng Thanh hao hoa vàng trị được bệnh sốt rét, đổ mồ hôi trộm Từ năm

1984, Việt Nam cũng đã dùng Thanh hao để trích ra các hợp chất

artemether, artemisinin và artesunate, nghiên cứu trị sốt rét thành công trong thử nghiệm và thực tiễn trên bệnh nhân sốt rét Trong chiến tranh, dù không phổ biến, Thanh hao cũng đã được dùng để trị sốt rét

Dùng muỗi biến đổi gen để chữa sốt rét: Triển vọng lớn nhất và cũng

gây nhiều chú ý, tranh luận nhất là dùng kỹ thuật di truyền để tạo ra giống muỗi mới bằng cách biến đổi gen giống muỗi gây bệnh để chúng không thể gây bệnh Giống muỗi biến đổi gen này được cho ra môi trường thiên nhiên

để chúng vượt trội, cạnh tranh tiêu diệt hay làm loãng mật độ giống muỗi truyền bệnh qua kết hợp với giống truyền bệnh Từ đó, các thế hệ sau của chúng sẽ có gen khiến chúng không mang ký sinh trùng bệnh sốt rét

Đầu năm 2002, các nhà nghiên cứu ở Đại học Cleveland (Ohio) đã

cấy thành công một gen mới vào bộ gen loại muỗi A stephensi làm nó

kháng lại được ký sinh trùng sốt rét WHO đã đặt chương trình nghiên cứu

và áp dụng các giống muỗi biến đổi gen là một trong những ưu tiên lớn nhất để chống sốt rét

Dùng vi nấm 'thuần hoá' muỗi truyền bệnh sốt rét: Tại Hội thảo về

Sốt rét châu Phi lần IV, các nhà khoa học đến từ Hà Lan, Tanzania và Anh

đã trình bày kết quả nghiên cứu về một loại vi nấm có thể sử dụng làm công cụ ngăn chặn muỗi truyền ký sinh trùng sốt rét sang người

Theo đó, có một loại vi nấm tại Đông Phi, khi lây nhiễm sang một số

loại côn trùng, gồm cả muỗi Anophele, có thể phát triển và làm vòng đời

của muỗi giảm đi 2/3 GS Willem Takken, Đại học Wageneign Hà Lan,

nói: "Ngay sau khi một con muỗi bị nhiễm nấm, nó lập tức ngừng hành vi

hút máu Nó sẽ chỉ hút nước hay các loại nước quả chứ không hút máu Một điều nữa là khi muỗi đã bị nhiễm nấm, chúng không thể nào làm cho

ký sinh trùng sốt rét phát triển được"

Hình 7: Muỗi được biến đổi gen có mắt màu xanh lục sáng

Năm 1979, Trung Quốc đã tiến hành một cuộc thử nghiệm lâm sàng dùng artemisinin trên 2.099 bệnh nhân sốt rét Một kết quả không tưởng là tất cả đều hết bệnh Ngoài ra, artemisinin dùng trên 143 bệnh nhân sốt rét với ký sinh trùng đã nhờn thuốc chloroquine và 141 bệnh sốt rét màng não cũng cho kết quả khả quan Nhiều thử nghiệm lâm sàng tiếp theo ở Trung Quốc, Đông Nam Á đều cho các kết quả tương tự

Ở Việt Nam, trong một thử nghiệm năm 1993 trên 638 bệnh nhân, dùng thuốc uống artemisinin cho thấy: trong vòng 24 tiếng, 98% ký sinh trùng sốt rét biến mất Nhóm bệnh nhân dùng thuốc trong 5 ngày chỉ có

10% là ký sinh trùng xuất hiện lại Artemisinin chống được cả P

falciparum và P.vivax Trong một thử nghiệm khác năm 1999, kết quả tốt

nhất là dùng artemisinin và sau đó dùng quinine trong 3-5 ngày sau

Artemisinin là hoạt chất chính của cây Thanh hao hoa vàng Khi cây

ra nụ, lá Thanh hao được thu hoạch có màu vàng nâu hoặc nâu sẫm, giòn

dễ vụn nát, mùi thơm hắc đặc biệt, vị đắng Đây là lúc lá có hàm lượng artemisinin cao nhất, 1,6% trong lá khô (lá xanh chỉ có 0,6% artemisinin)

Lá Thanh hao được tán nhuyễn, xay thành bột để chiết xuất hoạt chất artemisinin

Ngày nay, artemisinin được coi là phòng tuyến hữu hiệu cuối cùng trong kho vũ khí chống ký sinh trùng sốt rét

4 Thanh hao hoa vàng và artemisinin

Thanh hao hoa vàng ở Việt nam được thu hoạch để sản xuất thuốc chống sốt rét và có khả năng kháng khuẩn, kháng sâu tự nhiên Từ trước

đến nay, Thanh hao được sử dụng như loài dược thảo và hiện đang được trồng phổ biến để sản xuất artemisinin sử dụng trong lâm sàng điều trị bệnh sốt rét ác tính Artemisinin có tác dụng chống lại sốt rét và ký sinh trùng sốt rét, ký sinh trong cơ thể người Hơn nữa, artemisinin còn có tác dụng đề kháng lâu dài Như chúng ta đã biết, trùng bào tử là những động vật ký sinh liên tục ở những tế bào hoặc tổ chức của ký chủ và trong chu trình có giai đoạn biểu hiện dạng bào tử Trùng bào tử dinh dưỡng bằng phương pháp

thẩm thấu, sinh sản theo hai kiểu vô tính và hữu tính Plasmodium quan

trọng nhất vì nó gây bệnh sốt rét Có 4 loài plasmodium chính sống ký sinh

ở người là: P falciparum, P vivax, P malariee, P ovale Mặc dù P vivax

là loài gây bệnh sốt rét phổ biến nhất nhưng loài P falciparum là loài độc

nhất Artemisinin là đối tượng cần nghiên cứu và sản xuất rộng rãi góp phần phòng chống bệnh sốt rét ác tính

Thanh hao là loài cây thân thảo mọc hàng năm, gốc hóa gỗ Cây mọc hoang thường cao 1,5-2m, chăm bón tốt có thể cao đến 3-5m Toàn thân có mùi thơm nhẹ, thân có rãnh, gần như không có lông Lá mọc cách, có phiến xoan, 2-3 lần kép thành đoạn hẹp nhọn, không lông, lá vàng rồi chết khô, không rụng vì cuống lá rất dai Cụm hoa hợp thành một chùy kép, chùy cao

ở ngọn mang chùm dài, hẹp; hoa đầu cao 1,8-2m; lá bắc ngoài hẹp, có lông xanh; lá bắc giữa và lá bắc trong, xoan rộng; hoa toàn hình ống, khoảng 15 cái; hoa ngoài cái, hoa trong lưỡng tính, mỗi cành nhỏ có 3-7 cụm hoa, mỗi cụm hoa có 25-35 hoa, trong đó có 20-25 hoa lưỡng tính ở giữa, hoa cái có 5-8 hoa ở xung quanh, kích thước hoa rất nhỏ, vỏ có rãnh dọc có các tuyến tinh dầu (1gram quả khô có 20.000-22.000 hạt) Quả bế nhẵn, dài 0,5mm, không có mao lông

Thanh hao phân bố ở Nhật bản, Triều tiên, Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam Ở nước ta thường gặp ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang

Trong 15 loài thuộc chi artemisia ở Việt nam, có 4 loài rất giống

nhau về ngoại hình là A apiaceae, A capillaris, A campetris và A annua

Trong đó chỉ có A annua có artemisinin và tinh dầu Bộ phận dùng là lá

Thanh hao Thu hoạch vào thời kỳ có nụ là lúc hàm lượng artemisinin cao nhất (1.6% trong lá khô) Trong khi nếu thu hoạch khi lá còn xanh thì hàm lượng artemisinin chí có 0.6% Cây nở hoa cho hàm lượng artemisinin còn 1%

Hiện nay các nhà nghiên cứu đã chọn được giống Thanh hao hoa vàng có hàm lượng artemisinin cao, có thể thu được 3,5-5kg artemisinin trên một tấn lá khô nguyên liệu Việt Nam cũng đã sản xuất được các mặt hàng dược phẩm có chứa artemisinin trong điều trị bệnh sốt rét ác tính Để

có được sản lượng lá khô cao nhất là thu lá làm nhiều lần Bắt đầu từ lúc lá chuyển sang màu vàng là thu lá ngay, cho đến khi ngọn chớm có nụ là cắt toàn bộ cây, rồi tuốt lá phơi và sấy khô

Artemisinin là đối tượng nghiên cứu nhiều ở Việt Nam tại Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Bộ Y Tế, Bộ Công Nghiệp, Bộ Quốc Phòng và đã nhận được giải thưởng Hồ Chí Minh (2004) Artemisinin cũng

đã được nghiên cứu nhiều về kỹ thuật tách chiết va trồng trọt và chọn dòng Thanh hao hoa vàng có hàm lượng artemisinin cao ở Viện Nghiên Cứu Dược Liệu Trung Ương Ngoài ra quy trình tách chiết sản xuất artemisinin

từ cây Thanh hao hoa vàng cũng đã được hoàn thiện tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới và Viện Nghiên Cứu Dược Liệu Trung Ương Chọn dòng Thanh hao giàu hoạt chất artemisinin đã được Trung tâm Nghiên cứu Dược liệu Cam Ly (Công ty Dược liệu TW TPHCM) đang được thực hiện tại Đà Lạt nhiều năm nay Cây Thanh hao là đối tượng được nhiều cơ quan nghiên cứu đầu ngành quan tâm và hoàn thiện công nghệ chiết xuất chủ yếu từ cây Thanh hao trồng trọt

“Công trình nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ cây Thanh hao hoa vàng Việt nam và chuyển hóa các chất dẫn xuất có hoạt tính mạnh hơn chữa sốt rét” (Giải thưởng Hồ Chí Minh 2004) Theo Quyết định số 105/2003/QĐ/CTN của Chủ tịch nước Trần Đức Lương ký ngày 28/2/2003

đã quyết định trao giải thưởng Hồ Chí Minh cho công trình y tế trên cho 16

đơn vị: Bộ Y Tế (11 đơn vị), Bộ Quốc Phòng (2 đơn vị), Bộ Công Nghiệp (1 đơn vị) và Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam (2 đơn vị)

Nghiên cứu sản xuất artemisinin trong nước từ cây Thanh hao trồng trọt đã được hoàn thiện ở quy mô pilot Trang thiết bị ở các cơ sở nghiên cứu được đầu tư đầy đủ và hiện đại có khả năng phân tích và chiết xuất sản phẩm tinh khiết Thời gian sản xuất Thanh hao trồng trọt thì ngắn (từ tháng

7 dương lịch – tháng 12 dương lịch ở phía Bắc và từ tháng 7 dương lịch – tháng 12 dương lịch ở Đà Lạt), được thu hái trước khi cây ra hoa và mỗi năm chỉ trồng được một vụ Khu vực trồng Thanh hao có giới hạn chủ yếu

ở khu vực phía Bắc (thời gian có khí hậu lạnh tháng 12dương lịch – tháng 2dương lịch) và vùng Đà Lạt (có khí hậu lạnh quanh năm) Hiện nay giống Thanh hao giàu hoạt chất vẫn còn đang tiến hành nghiên cứu chọn dòng do

có những dòng Thanh hao giàu hoạt chất từ lá và có những dòng giàu hoạt chất từ rễ Giá thành chiết xuất artemisinin từ cây Thanh hao trồng trọt là quá đắt và thời gian sản xuất rất ngắn trong năm (GS Nguyễn Lân Dũng, 2007) là giới hạn phát triển artemisinin

Phần trên mặt đất của Thanh hao hoa vàng chứa artemisinin (thành phần chính), acid artemisinic, quinghaosu I (artennuin A), quinghaosu II (artennuin B), quinghaosu III (desoxyartemisinin), quinghaosu IV, quinghaosu V (artennuin E), artemisininlacton (artennuin F), artemisiten (dehydroartemisinin), artemisinic acid methyl ester, artennuin C, artemisinin G, artemisino, 11 R – (-) – dihydroartenuin epoxyartemisinic, dihydroepideoxyartennuin B, epideoxyartennuin B Ngoài ra, còn có 1,1% tinh dầu gồm 47 thành phần, trong đó artemisiaceton (52,5%), 1 – 8 cineol

quercetagetin –6,7 – tetramethylether; quercetagetin –6,7 – 4’ – trimethyl ether; 3,5 – dihydroxy –3’,4’ – 6,7 – tetramethoxyflavon; 3,3’,5’ – dioxyflavon; kaempferol; quercetin; 6 - methoxy kaempferol, artemetin; casticin; chrysopletin

- Các dẫn chất polyacetylen là anuadiepoxyd và ponticaepoxyd

- Tinh dầu cây Thanh hao hoa vàng Việt Nam chứa α - pinen, camphen, sabinen, β - pinen, β - myrcen 4,38%, p cymen, 1 – 8 cineol 15,44%, artemisiaceton, linalol, limonen oxyd, camphor 23,75%, artemisialcol, 4 – terpineol, 2 – methylen – 5 – isopropenylcyclohexanol, geranyl acetat, β - cubeben, α - cubebon - β - caryophylen 6,29%, β - farnesen, ∆ - cadinen

(Nguyễn Xuân Dũng và cs, 1990)

Theo Woerdenbag và cs (1994), lá Thanh hao hoa vàng cho các hàm lượng cao nhất về artemisinin (0,86%), acid artemisinic (0,16%) và artennuin B (0,08%) vào thời điểm cây được 5 tháng tuổi Sau đó, hàm lượng các chất này đều giảm đi Tinh dầu đạt hàm lượng tối đa (1%) trước khi cây ra hoa Lúc này, tinh dầu chứa monoterpen 55% và sesquiterpen 45%

Năm 1967, dịch chiết từ cây Thanh hao được khoa học xác định có hoạt tính chống sốt rét Năm 1971, các nhà khoa học đã tách từ cây này một hợp chất chữa lành cho chuột nhiễm ký sinh trùng Plasmodium berghei

Năm 1972, tinh chất kết tinh của hợp chất trên được Trung Quốc cô lập và xác định cấu trúc: là một chất sesquiterpene lactone với một cầu nối peroxide bên trong Đây là artemisinin, hoạt chất chính của cây Thanh hao

1979 : xác định được cấu trúc artemisinin bằng tia X

Tại Việt Nam, năm 1989 Đinh Huỳnh Kiệt và cộng sự công bố kết quả phân tích thành phần hóa học của Thanh hao hoa vàng mọc hoang và chiết suất artemisinin để chữa sốt rét cho bộ đội

Hình 8: Cấu trúc của artemisinin

Ký sinh trùng sốt rét xâm nhập tế bào máu hồng huyết cầu và tiêu thụ 25% chất hemoglobin trong hồng huyết cầu, tuy vậy chúng không phân hóa phân tử heme (chứa sắt) mà chứa phân tử sắt ở môt dạng polymer gọi

là hemozoin Khi artemisinin phản ứng với sắt ở hemozoin, chất sắt biến artemisinin thành một độc tố, sinh ra các gốc hóa học tự do phản ứng nhanh chóng giết chết ký sinh trùng

Hình 8: Cấu trúc của các dẫn xuất từ artemisinin

Mặc dù artemisinin đã được dùng khá lâu ở Trung Quốc và Đông Nam Á nhưng vẫn chưa thấy sự xuất hiện của ký sinh trùng nhờn thuốc artemisinin Lý do có thể là sự phá huỷ rất nhanh chóng và triệt để ký sinh

trùng sốt rét của artemisinin khi tiếp xúc với phân tử sắt (Fe) trong ký sinh trùng đã không cho chúng nhiều cơ hội đột biến

Hình 9: Cơ chế hoạt động của artemisinin

Wang và cs (2004) nghiên cứu về sự ảnh hưởng của gen fpf1

(flowering promoting factor 1) ở thời điểm Thanh hao ra hoa, mối liên hệ giữa việc nở hoa và quá trình tổng hợp artemisinin nhận thấy sự ra hoa không là yếu tố cần thiết cho sự gia tăng hàm lượng artemisinin; thời điểm thu hoạch tốt nhất là lúc cây ở cuối giai đoạn sinh trưởng và có sự tạo chồi

Artemisinin là một endoperoxide sesquiterpene lactone thuộc nhóm isoprenoid Một trong những con đường sinh tổng hợp quan trọng nhất ở thực vật là con đường isoprenoid Terpenoid được tạo nên bởi isopentenyl diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP) Ở thực vật cấp cao hơn có hai con đường sinh tổng hợp độc lập nhau dẫn đến việc hình thành IPP: con đường mevalonate trong cytosol và con đường mevalonate

trong thể hạt (Liu và cs, 2005)

Mới đây, hai gen mã hóa cho deoxy-Dxylulose-5-phosphate synthase (DXPS) và deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXPR) được tách từ rễ cây Thanh hao chuyển gen đã chứng minh được rằng con đường

sinh tổng hợp terpenoid diễn ra trong thể hạt (Krushkal và cs, 2003; Souret

và cs, 2002) Do đó, con đường mevalonate không phải là con đường duy nhất để tổng hợp artemisinin trong cây Thanh hao Akhila và cs (1987) đề nghị con đường sinh tổng hợp artemisinin hoàn chỉnh bắt đầu từ mevalonic acid và IPP Tiếp theo là sự tổng hợp farnesyl pyrophosphate (FPP), germacrane skeleton, dihydrocostunolide, cadinanolide, arteannuin B, và artemisinin Hàm lượng của artemisinic acid gấp 8–10 lần so với artemisinin ở cây Thanh hao Vì thế, có giả thuyết cho rằng artemisinic acid là tiền chất cho sự sinh tổng hợp artemisinin B và artemisinin Sangwan và cs (1993) cho rằng có sự biến đổi artemisinic acid thành artemisinin B và artemisinin cả ở cây tự nhiên và trong tế bào nuôi cấy

Bertea và cs (2005) đã nhận biết được chất trung gian và các enzyme liên quan đến sự tổng hợp artemisinin ở Thanh hao Một số enzyme liên quan đến sự tổng hợp artemisinin như 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR), farnesyl diphosphate synthase (FPPS), and sesquiterpene synthase (SES) HMGR catalyzed HMG-CoA to yield MVA (Liu và cs 2006)

CMK: 4-(Cytidine 5’-diphospho)-2-Cmethyl- D-erythritol kinase

CMS: 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyl transferase

DXR: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase

DXS: 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase

FPPS: farnesyl diphosphate synthetase

GPPS: geranyl diphosphate synthase

HMGR: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A(HMGCoA) reductase HMGS: HMG-CoA synthase; IDS isopentenyl diphosphate synthase

MVÀ CS: 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase

MDD: mevalonate diphosphate decarboxylase

MK: mevalonate kinase

MPK: mevalonate-5-phosphate kinase

SES: sesquiterpene synthase

Hình 10: Con đường sinh tổng hợp artemisinin (Liu và cs 2005; Bertea và cs 2005)

5 Artemisinin và công nghệ sinh học

Ở nhiều nước đang phát triển như Châu Phi, các nước Châu Á như Malaysia, Việt Nam… bệnh sốt rét đã lấy đi nhiều sinh mạng con người, rất tốn kém về chi phí y tế và lao động Bệnh sốt rét đã đánh mất khoảng 1 triệu người hàng năm (Schellenberg và cs, 2001) Bệnh sốt rét gây ra tính suy giảm đề kháng, gây ra trạng thái nóng lạnh ở người bệnh và là nhân tố chính ở các nước có bệnh sốt rét cao Sự giao lưu giữa các dân tộc ngày càng cao sẽ dẫn đến sự lây lan nhất là trong khu vực các nước đang phát triển

Tổng hợp thuốc chống bệnh sốt rét pamaquine được đầu tiên sử dụng

để điều trị bệnh sốt rét và từ đó dẫn đến nhiều dẫn xuất 8-aminoquinoline, chloroquine và mefloquine Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc với liều cao (300-600mg) và kéo dài (hơn 3 tháng) đã phát hiện dẫn đến suy nhược hệ

thần kinh (Bruce-Chwatt và cs, 1981) P falciparum phát triển rất nhanh

tính kháng thuốc chống bệnh sốt rét bao gồm cả chloroquine, sulfa pyrimethmine kết hợp và quinine (White và cs, 1999) Công cuộc tìm kiếm thuốc kháng bệnh sốt rét hiện đang diễn ra cấp thiết và khẩn trương để ngăn chận sự kháng thuốc chống sốt rét không hiệu quả trong tương lai

Một trong những dẫn xuất quan trọng có khả năng chống bệnh sốt rét

là artemisinin được chiết xuất từ Artemisia annua (cây Thanh hao hoa

vàng) Thanh hao hoa vàng được các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện năm 1972 Artemisinin được phát hiện có hiệu quả hơn so với chloroquine

và mefloquine kháng lại các dòng ký sinh Plasmodium Artemisinin được

phát hiện gần đây hơn so với chloroquine và cho phản ứng nhanh với tính chống chịu bệnh sốt rét Hơn nữa, độc tính phản ứng phụ cho thấy ít xuất hiện hơn so với chloroquine (Klayman, 1985)

Artemisinin và các dẫn xuất của nó có lẽ đã được tổng hợp nhưng các chất chống bệnh sốt rét tổng hợp hiện nay cho thấy không hiệu quả kinh tế so với chiết xuất từ cây Thanh hao Malaysia là một trong nhiều nước đang đi tìm kiếm chloroquine kháng bệnh cho các vùng có bệnh sốt rét đang hoành hành, và artemisinin được khuyến cáo cho điều trị bệnh

hiệu quả Artemisinin annua được trồng nhiều ở Việt Nam và Trung Quốc

Cây Thanh hao được thu hoạch trước khi ra hoa để sản xuất artemisinin chỉ sản xuất được 2-3kg trên 1 tấn lá khô Tuy nhiên giá thành chiết xuất lại quá cao Artemisin có hiệu quả cao trong phòng chống bệnh sốt rét, nhưng giá thành sản xuất cao và theo mùa vụ (Keasling, 2006) Hiện nay các nước trên thế giới đi tìm các phương pháp khác nhau để sản xuất artemisinin có hiệu quả với giá thành thấp

Tại Trường Đại học Berkeley, các nhà khoa học (Dae-Kyu Ro và cs, 2006) đã tiến hành tách được 2 gen từ cây này liên quan đến việc tổng hợp

ra artemisinic acid Acid này chỉ qua vài phản ứng hóa học sẽ chuyển thành artemisinin Sau đó các nhà khoa học đã chuyển thành công 2 gen này vào

tế bào men rượu (Saccharomyces cereviseae) Việc đưa chủng nấm men

mang gen tái tổ hợp sinh artemisinin vào sản xuất trong các nồi lên men (bioreactor) với hy vọng làm giảm giá thành so với phương pháp tách chiết

từ Thanh hao trồng trọt

Hiện nay công trình này đang được đưa vào sản xuất thử nghiệm tại Institute for One World Health hợp tác với Amyris Biotechnologies dưới sự tài trợ của quỹ Bill and Melinda Gates Foundation với kinh phí 42,6 triệu USD (Hale, 2006) Nhóm tác giả hy vọng khi đi vào sản xuất trên quy mô công nghiệp thì nhiều bệnh nhân ở các nước nghèo có cơ hội chữa bệnh Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp: giai đoạn đầu là thay đổi một

số gen của nấm men bằng phương pháp gây đột biến để gia tăng việc sản xuất farnesyl pyrophosphate (FPP); giai đoạn hai là đưa gen amorphadiene synthase (ADS) của cây Thanh hao hoa vàng vào tế bào nấm men để tổng hợp FPP thành amorphadiene; và giai đoạn cuối là đưa gen P450 của cây Thanh hao hoa vàng vào nấm men để oxy hóa 3 bậc chuyển amorphadien thành artemisinic acid Công cuộc nghiên cứu đang diễn ra phía trước, và vấn đề đặt ra là sản phẩm artemisinin chuyển gen có ảnh hưởng đến người bệnh và vấn đề phòng chống bệnh sốt rét trên người bệnh

Đi theo hướng này Parshikov và cs (2004) đã nuôi cấy dòng

Cunningham elegans tái tổ hợp sản xuất artemisinin bằng con đường biến

đổi sinh học 7-O-hydroxyartemisinin

Các nhà khoa học tại Trường Đại học Quốc Gia Đài Loan (Yuan-Tay Shyu, 2005) đề xuất phương pháp nuôi cấy rễ Thanh hao in vitro để chiết xuất artemisinin Nhưng công cuộc nghiên cứu còn đang tiến hành Đi theo hướng này còn có các nhà khoa học Trung Quốc (Liu và cs, 2005) đã tìm được điều kiện nuôi cấy thích hợp in vitro sản xuất được 233,3mg/l môi

trường lỏng Rễ có vai trò quan trọng trong nuôi cấy sản xuất artemisinin (Ferreira và cs, 1995a, 1996b)

Weathers và cs (1994), Giri và cs (2001) đã nuôi cấy Artemisia

annua lây nhiễm với các dòng Agrobacterium rhizogenes khác nhau kích

thích quá trình tăng sinh rễ trong nuôi cấy và hoạt chất artemisinin sinh ra tương quan thuận với tần suất sinh rễ

Trong quá trình nuôi cấy Samad và cs (2005) tại Trường Đại Học Nottingham ghi nhận rằng cây tái sinh từ lá có hàm lượng hoạt chất artemisinin tạo ra hơn hẳn loại trồng trọt trên cùng giống trong giai đoạn vườn ươm và trên đồng ruộng

Kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào sản xuất các chất có hoạt tính sinh học tại Đại Học Quốc Gia Malaysia cho nhiều hứa hẹn do việc sử dụng nguyên liệu truyền thống và sản phẩm sản xuất ra ổn định về mặt hoạt tính và không gây phản ứng phụ cho người với hoạt chất artemisinin qua

nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Artemisia annua (Chan và Nallamai, 2001,

2003; Chan, 2002; Nallamai và Chan, 2004) Kết quả nuôi cấy tế bào cho thấy hàm lượng sản xuất ra cao gấp 2-3 lần so với phương pháp canh tác truyền thống trong cùng một chu kỳ canh tác trên đồng ruộng (Ferreira & Janick, 1995, 1996) Ngoài ra còn thành công trong nuôi cấy tế bào chiết xuất hoạt chất Tropane alkaloids (Lai và cs, 2003; Chan và cs, 2005), Canthin-6-one alkaloids (Siregar và cs, 2004), Anthocyanidin (Koay và cs, 2005), Rosmarinic acid (Lim và cs, 2006), …

Kết quả nghiên cứu về chiết xuất artemisinin bằng phương pháp HPLC ở các cơ quan và bộ phận khác nhau trên cây Thanh hao cấy mô trồng trong nhà kính và trên đồng ruộng cho kết quả sau (Ferreira và cs, 1995a): (artemisinin = %DW x 1000) Bộ phận (nhà kính/ruộng): lá (3-30/6-60), thân chính (0-3/0,4-7), rễ (0/0), hoa (12-42/104-264), hạt phấn (0/NDz), vỏ hạt (NDz/116), hạt (36/81) – z: không xác định Cho thấy lá vẫn là bộ phận cho artemisinin nhiều nhất

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Chọn dòng thanh hao trên đồng ruộng

- Nguyên liệu: hạt Thanh hao nhận từ Trung tâm nghiên cứu Dược liệu (Hà Nội) Có hai dòng đã được chọn lọc: (i) thấp thân và ra hoa muộn ký hiệu TC1 (ii) cao thân và ra hoa muộn ký hiệu TC2 Cây con 30 ngày tuổi được đưa ra trồng khu thí nghiệm

- Địa điểm chọn dòng: TPHCM (vụ tháng 2/1-20/4/2008) và Đà Lạt (vụ tháng 1-6/2009)

- Chọn dòng tại TPHCM (vụ tháng 2/1-20/4/2008): Thực hiện tại vườn ươm Thủ Đức (VSHNĐ) Thí nghiệm được chia thành 2 lô (dòng TC1 và TC2), mỗi lô 10 cụm, mỗi cụm 20 cây Cụm chọn dòng được thu lấy hạt và được gieo ươm lấy cây con trồng chọn dòng trên Đà Lạt vụ tháng 20/1-20/6/2009 Thời gian trồng 14 tuần (bắt đầu ra hoa) Bón phân phun sương qua lá 2 tuần một lần (1gurea/ lít) Dinh dưỡng cơ chất bầu đất (14x22cm) theo tỷ lệ (1/1/1 = đất ruộng/tro trấu/phân chuồng hoai)

- Chọn dòng tại Đà Lạt (vụ tháng 20/1-20/6/2009): Thí nghiệm được chia thành 3 lô, mỗi lô 100 cây (100 cây dòng TC1 và 100 cây dòng TC2, đối chứng là 100 cây dòng Đà Lạt) Thời gian trồng 21 tuần (bắt đầu ra hoa) Bón phân (20-20-15) 2 đợt (sau trồng 4 tuần và 12 tuần) không bón lót

- Thiết kế thí nghiệm: Bố trí theo khối đầy đủ, không lập lại, số liệu được

xử lý theo chương trình MSTATC (p=0.05) Chỉ tiêu theo dõi vào ngày thu họach: chiều cao thân, số nhánh cấp 1, chiều dài nhánh dài nhất (lá thứ 2 từ gốc tính lên)

- Định lượng artemisinin (ppm) trong 1g bột khô phân tích theo công thức 1g = [C x V]/m {C=hàm lượng chạy máy (ppm); V=thể tích chiết để chạy máy; m=trọng lượng g bột khô dùng để chiết xuất} Định tính = định lượng (ppm)/106mg

2 Chọn dòng thanh hao trên đồng ruộng

- Nguyên liệu: Dòng Thanh hao đầu dòng được chọn lọc tại TPHCM (TC1.8 và TC2.1), chồi đỉnh được sử dụng làm mẫu nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy: MS (Murashige-Skoog, 1962), LV (Litvay, 1985)

- Có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng: BA, NAA

- Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 28+2oC, RH=65%, cường độ ánh sáng 22,2 µmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày

- Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, lập lại 3 lần, mỗi lần 3 bình tam giác, mỗi bình tam giác cấy 7 mẫu Số liệu được phân tích bằng chương trình thống kê MSTATC (p=0,05)

3 Nuôi cấy tế bào mô sẹo thanh hao trên môi trường agar

- Nguyên liệu: thân lá rễ cây cấy mô được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy: LV (Litvay, 1985)

- Có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng: BA, 2,4D, NAA

- Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 28+2oC, RH=65%, cường độ ánh sáng 22,2µmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày

- Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, lập lại 3 lần, mỗi lần 3 bình tam giác, mỗi bình tam giác cấy 7 mẫu Số liệu được phân tích bằng chương trình thống kê MSTATC (p=0,05)

4 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thanh hao trong môi trường lỏng

1 Chọn lọc môi trường khoáng và chất điều hòa sinh trưởng

- Nguyên liệu: lá cây cấy mô 10 tháng tuổi được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy, có kích thước 5 mm 100 mg/mảnh mô sẹo/bình tam giác chứa 50

- Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, lập lại 3 lần, mỗi lần 3 bình tam giác, mỗi bình tam giác cấy 7 mẫu lá Số liệu ghi nhận sau 30 ngày nuôi cấy Số liệu được phân tích bằng chương trình thống

kê MSTATC (p=0,05)

- Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường agar và môi trường lỏng + Nuôi cấy tạo mô sẹo: Nghiệm thức được chọn có >60% mô sẹo đạt kích thước >18mm

- Thí nghiệm 1-6: nuôi cấy lá non

- Thí nghiệm 7-10: mở rộng thí nghiệm 1-2, nuôi cấy lá non

- Thí nghiệm 11-12: lập lại thí nghiệm 9-10, mẫu nuôi cấy là mô sẹo (kích thước 5mm)

- Thí nghiệm 13-14: lập lại thí nghiệm 11-12, mẫu nuôi cấy là mô sẹo (kích thước 5mm)

- Thí nghiệm 15: có bổ sung pepton (1g/l)

+ Nuôi cấy dịch huyền phù: Nghiệm thức được chọn có >60% hệ số tăng sinh >10 (thể tích lắng tế bào)

2 Động thái sinh trưởng của dịch huyền phù tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào dịch huyền phù là LV + BA (0,5mg/l) + NAA (0,5mg/l) + pepton (5g) + CW (10%) + sucrose (30g/l) Thể tích nuôi cấy 50 ml Sinh khối tế bào đưa vào nuôi cấy 1,26g Đường cong sinh trưởng được dựng lên theo từng mốc thời gian nuôi cấy cách khoảng 3 ngày

5 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thanh hao trong bioreactor

- Nguyên liệu: dòng Thanh hao TC1

- Dịch huyền phù tế bào mô sẹo phôi hóa được nuôi cấy với 1g/50ml môi trường lỏng LV + NAA (0,5mg/l) + BA (0,5mg/l) + pepton (1g/l) Thời gian nuôi cấy 21 ngày 300ml môi trường dung dịch mẹ tế bào huyền phù phôi hóa được cấy vào 700ml môi trường bioreactor Thể tích bioreactor cuối cùng là 1 lít

- Môi trường dinh dưỡng khoáng được sử dụng trong nghiên cứu là LV (Litvay, 1985)

- Có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng: BA, NAA, sucrose (30g/l), nước dừa (CW-10%)

- Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 28+2oC, RH=65%, cường độ ánh sáng 22,2µmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, tốc độ cánh khuấy 30rpm, tốc độ máy lắc 80rpm

- Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, có 3 lần lập lại, chu kỳ nuôi cấy 21 ngày, ly tâm tách sinh khối tế bào và định tính artemisinin bằng HPLC Số liệu được xử lý bằng phần mềm MSTATC (p=0,05)

- Định lượng artemisinin (ppm) trong 1g bột khô phân tích theo công thức 1g = [C x V]/m {C=hàm lượng chạy máy (ppm); V=thể tích chiết để chạy máy; m=trọng lượng g bột khô dùng để chiết xuất} Định tính = định lượng (ppm)/106mg

6 Chọn mô thanh hao nuôi cấy phát sinh rễ

- Nguyên liệu: Hạt Thanh hao dòng TC1.8 chọn dòng được sử dụng gieo hạt trên môi trường MS in vitro Cây cấy mô được sử dụng để làm nguyên liệu nuôi cấy Lá, thân và mô sẹo được sử dụng nuôi cấy phát sinh rễ

- Môi trường nuôi cấy: B5 (Gamborg, 1968), MS (Murashige-Skoog, 1962), LV (Litvay, 1985)

- Có bổ sung: Kinetin, BA, IAA, IBA, NAA, 2,4D

- Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 28+2oC, RH=65%, cường độ ánh sáng 22,2µmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày

- Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, lập lại 3 lần, mỗi lần 3 bình tam giác, mỗi bình tam giác cấy 7 mẫu lá Số liệu ghi nhận sau 30 ngày nuôi cấy Số liệu được phân tích bằng chương trình thống

kê MSTATC (p=0,05)

7 Nuôi cấy chuyển nạp gen tạo rễ tơ vào mô thanh hao

+ Nguyên liệu: Chủng Agrobaterium ATCC 11325 nhập từ Hoa Kỳ (công

ty ITS) Hạt giống thanh hao dòng TC1.8 thu được qua thí nghiệm chọn dòng ở TPHCM Hạt TC1 do Trung tâm nghiên cứu dược liệu Hà Nội cung cấp

+ Chủng agrobacterium được nuôi cấy trên môi trường LB (Luria Bertani): Tryton 10g/l, extract yeast 5g/l, NaCl 10g/l, pH 7,2 Để nhân giống cho nghiên cứu chuyển nạp gen, vi khuẩn được nuôi lắc qua đêm trong môi trường LB ở 26oC

+ Gieo hạt in vitro

Thí nghiệm được tiến hành theo một quy trình bao gồm:

- Hạt giống được rửa qua savon trong khoảng 3-5 phút

- Mang hạt đã rửa trên vào tủ cấy vô trùng

- Rửa bằng nước cất vô trùng 2-3 lần

- Lắc trong ethanol 70% trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3-5 lần

- Ngâm trong dung dịch Hypochlorite - Na trong 30 phút

- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 3-5 lần

- Cấy hạt đã khử trùng vào những erlen 250ml có chứa 50 ml môi trường khoáng cơ bản là MS (Murashige-Skoog, 1962)

- Một tháng sau hạt nảy mầm sẽ được cấy chuyền sang môi trường MS không có hormon tăng trưởng thực vật

+ Qui trình chuyển nạp gen:

- Do artemisinin được tổng hợp và tích trữ hầu hết ở lá cây thanh hao nên lá được sử dụng làm nguồn vật liệu cho chuyển gen tạo rễ tơ để sản xuất artemisinin

- Lá trưởng thành từ cây gieo hạt in vitro được cắt nhỏ 0,3x0,3cm để tạo

vết thương

- Gây nhiễm mẫu mô lá với vi khuẩn trong thời gian 30 phút Vớt mẫu ra thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc Nuôi chung các mảnh lá với vi khuẩn trong môi trường B5 có bổ sung acetosyringone (AS) 100µM trong 2

ngày Rửa sạch vi khuẩn bằng nước cất vô trùng Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các mảnh lá trên môi trường B5 có bổ sung 500mg/l cefotaxime để diệt các vi khuẩn còn sót lại Thời gian nuôi cấy chu kỳ 3 tuần đổi qua môi trường mới, lập lại 3 lần Quan sát sự tạo rễ từ mẫu mô lá chuyển nạp

- Đánh giá khả năng loại bỏ agrobacterium bằng phương pháp ELISA bột

rễ khô

8 Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trên môi trường agar

- Rễ chuyển gen dòng chọn lọc TC1.8 được sử dụng trong nghiên cứu

- Môi trường khoáng cơ bản được sử dụng: B5 (Gamborg, 1968)

- Có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng: IAA, IBA, NAA, BA, 2iP

- Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 28+2oC, RH=65%, cường độ ánh sáng 22,2 µmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày,

- Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, lập lại 3 lần, mỗi lần 4 bình tam giác (50 ml môi trường nuôi cấy), mỗi bình tam giác cấy 500 mg mẫu rễ Số liệu được phân tích bằng chương trình thống

kê MSTATC (p=0,05)

9 Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trong môi trường lỏng

- Rễ chuyển gen dòng chọn lọc TC1.8 được sử dụng trong nghiên cứu

- Môi trường khoáng cơ bản được sử dụng: B5 (Gamborg, 1968), MS (Murashige-Skoog, 1962), LV (Litvay, 1985)

- Có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng: NAA (0,5mg/l)

- Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 28+2oC, RH=65%, cường độ ánh sáng 22,2µmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày,

- Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, lập lại 3 lần, mỗi lần 3 bình tam giác (50ml môi trường lỏng nuôi cấy), mỗi bình tam giác cấy 100mg mẫu rễ Số liệu được ghi nhận sau 21 ngày nuôi cấy

Số liệu được phân tích bằng chương trình thống kê MSTATC (p=0,05)

10 Nuôi cấy rễ tơ thanh hao trong bioreactor bán chìm nổi

- Rễ chuyển gen dòng chọn lọc TC1.8 được sử dụng trong nghiên cứu

- Môi trường khóang cơ bản được sử dụng: MS (Murashige-Skoog, 1962)

- Có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng: NAA (0,5mg/l)

- Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 28+2oC, RH=65%, cường độ ánh sáng 22,2µmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày,

- Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, lập lại 3 lần, mỗi lần 1 bioreactor bán chìm nổi (200ml môi trường lỏng nuôi cấy), mỗi bioreactor nuôi cấy 4g rễ Số liệu được ghi nhận sau 21 ngày nuôi cấy

Số liệu được phân tích bằng chương trình thống kê MSTATC (p=0.05)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

I CHỌN DÒNG THANH HAO TRÊN ĐỒNG RUỘNG VÀ IN VITRO

Artemisinin được chiết xuất từ những cây Thanh hao trồng trọt có hàm lượng 0,01%-0,5% và tập trung ở lá (Laughlin, 2001) Đạm (80-120 kgN/ha) ảnh hưởng lớn đến hàm lượng artemisinin trong lá (Özgüven và

cs, 2007) Thời vụ trồng Thanh hao đạt hiệu suất artemisinin cao nhất 1,2% so với trọng lượng khô) là tháng 5- tháng 9 (Gupta và cs, 2002) Chlomequat đã được sử dụng để nâng cao hàm lượng artemisinin (Liersch

(0,8-và cs, 2006) Tuy nhiên, rào cản đầu tiên là chọn dòng Thanh hao cao sản trên đồng ruộng (Bilia và cs, 2006)

Chọn dòng trên đồng ruộng đã được khảo nghiệm (Jain và cs, 1996) dựa trên hình thái: thấp và ra hoa sớm, cao và ra hoa sớm, cao và ra hoa muộn, thấp và ra hoa muộn Hầu hết cả bốn kiểu hình thái đều cho artemisinin, trong đó dòng ra hoa muộn cho hàm lượng artemisinin và tinh dầu cao Miền Bắc Việt Nam đã nuôi cấy mô cây Thanh hao và trồng khảo nghiệm trong điều kiện nhiệt đới cho thấy sinh trưởng 18-20 tuần, thân cây cao 100cm, ra hoa sau 14 tuần, hàm lượng artemisinin ở lá thứ 12 (0,13-0,31%) và lá thứ 13 (0,12-0,39%) Khảo sát với nhiều dòng chia ra ba nhóm: cao sản (0,41-0,42%), trung bình (0,25-0,26%) và thấp (0,13%) (Chan và cs, 2006) Lai tạo và chọn dòng trên đồng ruộng là con đường phát hiện các dòng Thanh hao cao sản, có khả năng đạt đến 1,4% artemisinin (Delabays và cs, 2004) Do đó, chọn dòng Thanh hao trên đồng ruộng là rào cản đầu tiên

Phương pháp vi nhân giống đã được sử dụng trong dòng hóa cây Thanh hao từ hạt hay từ cây thực sinh được chọn lọc trên đồng ruộng dựa vào đặc điểm sinh trưởng và hình thái Dòng Thanh hao có hàm lượng artemisinin cao có biểu hiện hình thái bên ngoài như sinh trưởng nhanh, lóng thân dài, nhánh xòa, nhiều lá và thân dày (El-Hag và cs, 1990) Theo Pras và cs (1991) dòng cho năng suất cao trong in vitro sẽ cho năng suất

cao trên đồng ruộng Hoàn thiện kỹ thuật nhân nhanh in vitro dòng Thanh hao chọn lọc trên đồng ruộng là tiền đề sản xuất nguồn nguyên liệu sản xuất mô sẹo và dịch huyền phù tế bào (Nair và cs, 1986)

tụ artemisinin cao Do đó, phương pháp so sánh sinh trưởng trên đồng ruộng trong điều kiện nhiệt đới có thể chọn được những dòng tích tụ artemisinin cao

Chiều dài nhánh 2 (cm)

Hàm lượng máy chạy (ppm)

Hàm lượng art/gDW (ppm)

Hàm lượng (%)

TL khô TC1.1 54 38 37 4894,279 3670,70 0,367 TC1.2 48 24 30 2857,022 2142,76 0,214 TC1.3 45 22 28 2636,430 1977,32 0,197 TC1.4 46 21 26 2680,872 2010,65 0,201 TC1.5 50 25 32 3654,280 2740,71 0,274 TC1.6 46 22 30 2856,825 2142,61 0,214 TC1.7 48 26 30 3148,144 2361,10 0,236 TC1.8 60 42 40 5976,088 4482,06 0,448

TC1.9 52 26 34 3642,544 2731,90 0,273 TC1.10 40 20 24 2256,221 1692,16 0,169 TC2.1 66 44 45 5450,609 4087,95 0,408

TC2.2 60 40 42 5089,981 3817,48 0,381 TC2.3 64 42 44 5164,506 3873,37 0,387 TC2.4 65 45 46 5246,356 3934,76 0,393 TC2.5 58 39 35 4565,022 3423,76 0,342 TC2.6 50 28 32 3659,422 2744,56 0,274 TC2.7 46 25 28 2578,264 1933,69 0,193 TC2.8 46 26 26 2742,522 2056,89 0,205 TC2.9 48 26 30 3487,242 2615,43 0,261 TC2.10 62 41 40 4856,312 3642,23 0,364

Thí nghiệm 1.2: Chọn dòng tại Đà Lạt (vụ tháng 20/1-20/6/2009)

Chiều cao thân đạt (48-65cm), số nhánh cấp 1 (24-45 nhánh), chiều dài nhánh (thứ 2 từ gốc) (32-46cm), thời gian ra hoa sau trồng 14 tuần Kết quả qua bảng 2 hàm lượng artemisinin đạt cao nhất ở lá (1,47% dòng TC1.136 và 1.297 dòng TC2.29) Qua bảng 1, chiều cao, số nhánh cấp I, chiều dài nhánh dài nhất biến động không theo quy luật thể hiện hình thái bên ngoài cho giống năng suất cao ở cả 3 dòng đưa vào thực nghiệm Khả năng tích tụ artemisinin phụ thuộc vào đặc điểm di truyền của từng cá thể của từng dòng đưa vào nghiên cứu Tuy nhiên, artemisinin tích tụ cao nhất thuộc vào nhóm dòng TC1, có đặc điểm thấp cây khi trồng ở vùng thấp

Bảng 1.2: Chọn dòng ở Đà Lạt (vụ tháng 20/1-20/6/2009)

Dòng Chiều

cao thân (cm)

Số nhánh cấp I (số nhánh)

Chiều dài nhánh 2 (cm)

Hàm lượng máy chạy (ppm)

Hàm lượng art/gDW (ppm)

Hàm lượng (%)

TL khô TC1.95 265 49 210 1100,2 11002 1,1002 TC1.105 241 72 179 962,5 9625 0,9625 TC1.106 253 63 187 1165,4 11654 1,1654 TC1.121 243 90 189 1121,3 11213 1,1213 TC1.130 291 93 217 1290,6 12906 1,2906 TC1.131 241 77 198 1350,0 13500 1,3500 TC1.133 241 65 191 810,8 8108 0,8100 TC1.136 275 87 192 1470,0 14700 1,4700

TC1.143 254 56 217 876,0 8760 0,8760 TC1.144 251 53 207 1056,0 10560 1,0560 TC2.4 260 70 190 1116,6 11166 1,1166 TC2.15 275 82 192 1033,6 10336 1,0336 TC2.18 271 63 217 1048,6 10486 1,0486 TC2.19 294 73 146 1136,6 11366 1,1366 TC2.22 263 92 224 946,0 9460 0,9460 TC2.25 261 64 245 1211,0 12110 1,2110 TC2.29 267 58 231 1297,7 12977 1,2977

TC2.35 270 67 180 1010,9 10109 1,0109 TC2.37 270 87 242 941,6 9416 0,9416 TC2.44 157 67 130 1102,7 11027 1,1027 ĐL.80 180 50 130 1091,9 10919 1,0919

ĐL.92 121 57 183 1197,8 11978 1,1978

ĐL.134 180 49 184 841,4 8414 0,8414 ĐL.135 212 63 210 971,2 9712 0,9712

Kết luận

Trong điều kiện nhiệt đới (TPHCM), trồng thử nghiệm vào tháng 2/1-20/4/2008 (ngày ngắn), đã chọn được hai dòng TC1.8 và TC2.1 có hàm lượng artemisinin tương ứng là 0,448% và 0,408% Trong điều kiện vùng cao (Đà Lạt), trồng thử nghiệm vào tháng 20/1-30/6/2009 (ngày ngắn), đã chọn lọc được hai dòng TC1.136 và TC2.29 có hàm lượng artemisinin tương ứng 1,470% và 1,297%

2 CHỌN DÒNG THANH HAO IN VITRO

Thí nghiệm 2.1: Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy

Kết quả khử trùng được ghi nhận ở đồ thị 2.1 cho thấy với nồng độ hypoclorite-Na 5% ở thời gian 5 phút là thích hợp nhất để vô trùng chồi Thanh hao Chồi vô trùng thu được sẽ là nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo

0.000

4.67 7.000

2.670 8.33

0.330

5.330 3.33

0 2 4 6 8

5%

Đồ thị 2.1: Tỉ lệ chồi sống và không nhiễm sau 3 tuần khử trùng

Thí nghiệm 2.2: Nhân giống cây Thanh hao in vitro

Để xác định môi trường khoáng thích hợp nuôi cấy cây Thanh hao in

vitro, các chồi non vô trùng được đưa vào nuôi cấy trên hai môi trường

khoáng MS và LV Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả nghiên cứu cho thấy: trên môi trường LV lá cây mọc to hơn, vươn thẳng, xanh tốt

Những chồi Thanh hao vô trùng được nuôi cấy nhân giống in vitro trên môi trường LV bổ sung BA (0-0,1-0,3-0,5-0,7 mg/l), chúng tôi nhận thấy với nồng độ BA thấp (0,3 mg/l) chồi phát triển cả về chiều cao và số lượng (8,3 chồi), chồi xanh tốt, thân chồi vươn thẳng, lá to Trong khi ở môi trường BA (0,5 mg/l) và BA (0,7 mg/l), mặc dù số chồi được tạo thành nhiều hơn 11,7 và 13,6 chồi, nhưng chồi phát triển không bình thường, thân