Bảng 3.2. Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ
Nồi hấp thanh trùng Trung Quốc Cân phân tích Anh
Tủ sấy Đức Máy khuấy từ Đức
Tủ ấm Trung Quốc Máy đo pH Nhật
Box cấy vi khuẩn Mỹ Kính hiển vi Đức
Máy ly tâm lạnh Đức Máy UV-VIS Hàn quốc
Máy lắc Hàn quốc Tủ lạnh Nhật
Máy Voxted Đức Lò vi sóng Mỹ
Các dụng cụ khác được sử dụng trong thí nghiêm bao gồm: micropipette 10-100μl, 100-1000 μl ( Đức ), đầu côn, bình tam giác, que cấy, que trang, đĩa petri, ống nghiệm, ống phancol, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm,….
3.3.3. Các chủng giống
05 chủng vi khuẩn lactic thuần khiết được cung cấp từ đề tài nghiên cứu khoa học cấp cơ sở "Nghiên cứu sản xuất đồ uống lên men từ bột ngũ cốc năm 2013" được ký hiệu lần lượt là BL1, BL2, BL3, BL4, BL5.
Các chủng vi khuẩn chỉ thị: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Bacillus cereus được cung cấp bởi Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh Thái Nguyên.
3.3.4. Các môi trường sử dụng
Môi trường LBA (Luria-Bertani Agar): Cao nấm men 5g, Tryptone 10g, NaCl 10g, Agar 20g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH 6,7.
Môi trường LB (Luria-Bertani): Cao nấm men 5g, Tryptone 10g, NaCl 10g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH=6,7.
Môi trường MPA: Cao thịt 5g, Peptone 10g, NaCl 5g, Glucose 1g, Agar 20g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH = 6,7.
Môi trường MPB: Cao thịt 5g, Peptone 10g, NaCl 5g, Glucose 1g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH = 6,7.
3.4. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát khả năng kháng khuẩn chỉ thị của 5 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ Boza.
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic.
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic.
Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic.
Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic.
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn chỉ thị của vi khuẩn nghiên cứu
[29] Tiến hành cấy ria các chủng vi khuẩn lactic lên đĩa thạch chứa môi trường LBA theo đường thẳng nằm giữa đĩa thạch. Sau 2 ngày nuôi ở nhiệt độ 37oC, các đĩa được cấy ria bổ sung các chủng chỉ thị theo các đường thẳng vuông góc với đường cấy chủng lactic. Khả năng kháng khuẩn chỉ thị của vi khuẩn lactic được đánh giá dựa trên kích thước của vùng ức chế.
Hình 3.1: Phương pháp cấy khảo sát khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị
Kết quả được đánh giá như sau: Không đối kháng (-): 0mm; Đối kháng yếu (+): >0 - <5mm; Đối kháng trung bình (++): 5-<10mm; Đối kháng mạnh (+++): >=10mm.
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn lactic được nuôi lắc trong 60ml môi trường LB trong bình tam giác 100ml ở 37oC, 150 vòng trên phút trong 48h. Cứ sau mỗi 12h hút 5ml dịch nuôi cấy, đo độ đục và ly tâm ở 6000 vòng trên phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 20 phút. Thu dịch nổi để đánh giá khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán thạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn lactic được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong 20ml môi trường LB trong bình tam giác 50ml ở các nhiệt độ: 30, 37, 44oC. Sau 36h tiến hành ly tâm ở chế độ 6000 vòng/phút, 4oC trong 20 phút. Thu dịch nổi để đánh giá khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán thạch.
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn lactic được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong 20ml môi trường LB trong bình tam giác 50ml ở 37oC. pH ban đầu của môi trường được điều chỉnh lần lượt là 6,0; 6,5; 7,0 và 7,5. Sau 36h tiến hành ly tâm ở chế độ 6000 vòng/phút, 4oC trong 20 phút. Thu dịch nổi để đánh giá khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán thạch.
3.5.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn lactic được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong 20ml môi trường LB trong bình tam giác 50ml ở 37oC. Nồng độ NaCl trong môi trường LB được điều chỉnh lần lượt là 0; 0,5; 1,0, 1,5%. Sau 36h tiến hành ly tâm ở
chế độ 6000 vòng/phút, 4oC trong 20 phút. Thu dịch nổi để đánh giá khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán thạch.
3.5.6. Phương pháp khuếch tán thạch
Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của
bacteriocinvới vi khuẩn chỉ thị của vi khuẩn acid lactic trên môi trường nuôi cấy. Bacteriocincó khả năng khuếch tán trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Vi khuẩn acid lactic sinh bacteriocin kháng được vi khuẩn chỉ thị sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.
Quy trình thực hiện:
Chuẩn bị môi trường chứa dòng chỉ thị:
Dòng chỉ thị được nuôi cấy trên đĩa 24 giờ, khuẩn lạc được cho vào nước cất vô trùng và tiến hành pha loãng dung dịch.
Trải 0,1ml dung dịch chứa dòng chỉ thị vào trên bề mặt môi trường trong đĩa Petri .
Sau khi trang đều và để khô, tạo những giếng nhỏ có đường kính 8mm với thanh kim loại vô trùng.
Chuẩn bị dịch bacteriocin thô:
Vi khuẩn acid lactic được phát triển trong môi trường LB nuôi cấy ở 37oC trong 36h.
Dung dịch được ly tâm 6.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC.
Loại bỏ phần cặn chứa xác tế bào vi khuẩn, lấy phần nước trong của dung dịch sau ly tâm ( dung dịch bacteriocin thô) và trữ lạnh ở 4oC.
Thu được dung dịch bacteriocin thô.
Lấy 0,1ml dung dịch bacteriocin thô nhỏ vào mỗi giếng của đĩa thạch đã chứa dòng chỉ thị.
Tiến hành ủ mẫu ở 4oC trong 15 phút cho dung dịch trong giếng khuếch tán.
Các đĩa được ủ ở 37oC. Sau 24 giờ thì đọc kết quả. Với số liệu thu được qua đo vòng kháng khuẩn.
3.5.7. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Giống vi sinh vật được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng ở nhiệt độ 4oC. Sau 2-3 tuần giống vi sinh vật được cấy chuyển một lần để đảm bảo sức sống và ổn định của giống vi sinh vật trong quá trình nghiên cứu.