thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến khả năng phát triển cũng như sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học của vi khuẩn. Để đánh giá được ảnh hưởng của thời gian tới khả năng tổng hợp bacteriocin, vi khuẩn BL1 được nuôi trong môi trường LB với các thời gian 12h, 24h, 36h và 48h. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1
Thời gian 12h 24h 36h 48h VK chỉ thị D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) E. coli 10 0,7 11 1,5 15 1,8 15 1,8 B. cereus 11 12 18 18 S. aureus 8 8 9 9 Salmonell a 10 10 14 15
Hình 4.1. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn BL1
Từ bảng 4.2 và biểu đồ 4.1 cho thấy, thời gian ảnh hưởng rõ đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cũng như tốc độ phát triển của chủng lactic BL1. Thời gian từ 12h - 36h sự sinh trưởng của vi khuẩn BL1 tăng OD610 tăng từ 0,7 - 1,5 sau 36h thì chuyển sang pha cân bằng OD610 = 1,8, sự sinh tổng hợp bacteriocin ở 12h nuôi cấy khả năng kháng khuẩn yếu hàm lượng bacteriocin có trong môi trường nuôi cấy thấp, đến 24h nuôi cấy vẫn duy trì ở mức thấp. Đạt hàm lượng cao nhất vào 36h kích thước vòng kháng khuẩn đạt 9 - 18mm và đến 48h nuôi cấy hàm lượng bacteriocin trong dịch nuôi cấy vẫn giữ nguyên không đổi.
Vì vậy dựa vào kết quả trên thời gian thích hợp cho vi khuẩn BL1 sự sinh tổng hợp bacteriocin là 36h.
4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1
Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học của vi khuẩn. Để đánh giá được ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tổng hợp bacteriocin, vi khuẩn BL1 được nuôi trong môi trường LB với các nhiệt độ 30, 37 và 44oC. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1 Nhiệt độ (oC) 30 37 44 VK chỉ thị D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) E. coli 12 1,3 15 1,8 9 0,8 B. cereus 15 18 9 S. aureus 9 9 8 Salmonella 12 14 8
Ghi chú: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm); OD: độ đục dịch nuôi cấy
Hình 4.2. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1
Từ bảng 4.3 và biểu đồ 4.2 cho thấy, nhiệt độ ảnh hưởng rõ đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cũng như tốc độ phát triển của chủng lactic BL1. Khi nhiệt độ tăng từ 30 đến 37oC sự sinh tổng hợp bacteriocin và tốc độ sinh trưởng tăng dần. Khi nhiệt độ từ 37 đến 44oC sự sinh tổng hợp giảm nhanh và tốc độ phát triển giảm mạnh. Tại nhiệt độ 37oC sự sinh tổng hợp bacteriocin và sự sinh trưởng đạt mức cao nhất OD610 = 1,8 và khả năng kháng các vi khuẩn chỉ thị mạnh, kích thước vòng phân giải đối với các chủng từ 9-18mm.
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Suranjita Mitra et al, 2005 và nghiên cứu của L.G. Stoyanova et al., 2005, nhiệt độ 37oC là thích hợp nhất cho chủng Lactococcus lactis nuôi cấy trong môi trường TGE (trypton – glucose – yeast axtract) phát triển và sinh tổng hợp bacteriocin mạnh nhất.
Với kết quả nghiên cứu trên, nhiệt độ 37oC được chọn và sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
pH của môi trường nuôi cấy cũng là một nhân tố quyết định quá trình sinh tổng hợp các hoạt chất của vi sinh vật. Vì vậy để đánh giá được ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1, vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có pH ban đầu thay đổi từ 6,0; 6,5; 7,0; 7,5. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4.4.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp bacteriocin
Ph 6,0 6,5 7,0 7,5 VK chỉ thị D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) E. coli 13 1,3 16 1,5 16 1,8 15 1,6 B. cereus 13 17 18 18 S. aureus 8 9 9 9 Salmonella 10 14 15 14
Hình 4.3. Biểu đồ ảnh hưởng pH tới khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn BL1
Từ bảng 4.4 và biểu đồ 4.3 cho thấy, pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng lactic phân lập. Tại pH = 6,0 thì sự sinh trưởng của chủng BL1 đạt OD610 = 1,3 còn sự ức chế các vi khuẩn chỉ thị đạt kích thước vòng kháng khuẩn từ 8 – 13 mm, ở pH = 6,5 sự sinh trưởng có chiều hướng tăng OD610 = 1,5, kích thước vòng kháng khuẩn là 9 -16 mm . Tại thời pH = 7,0 sự sinh tổng hợp bacteriocin cũng như tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn BL1 mạnh nhất, kích thước vòng kháng Bacillus cereus là 18mm và OD610 nm là 1,8. Ở pH = 7,5 thì sự sinh trưởng giảm so với pH = 7 OD610 = 1,6, còn sự sinh tổng hợp bactẻiocin không giảm vẫn giữ nguyên.
Vì vậy pH thích hợp cho vi khuẩn BL1 sinh tổng hợp bacteriocin là pH = 7.
4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1
Theo nghiên cứu của Neysens và cộng sự năm 2003 [30] thì NaCl có ảnh hưởng đáng kể tới sự tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus amylovorus DCE 471. Để đánh giá ảnh hưởng của NaCl tới sự phát triển và khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị, vi khuẩn BL1 được nuôi cấy trên môi trường LB có NaCl ở 4 nồng độ 0; 0,5; 1,0; 1,5. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4.5.
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của NaCl tới khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1 NaCl(%) 0 0,5 1,0 1,5 VK chỉ thị D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) D (mm) OD (610nm) E. coli 10 1,1 16 1,8 17 1,5 10 0,9 B. cereus 10 18 19 18 S. aureus 8 9 9 9
Salmonell
a 9 14 15 14
Hình 4.4. Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sinh tổng
hợp bacteriocin của BL1
Kết quả trong bảng 4.5 và biểu đồ 4.4 cho thấy NaCl ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn BL1. Ở nồng độ 0,5%, vi khuẩn BL1 phát triển tốt nhất OD610 = 1,8 tuy nhiên khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị không phải là tốt nhất kích thước vòng kháng khuẩn đạt 9 – 16 mm , ở nồng độ 1% thì sự phát triển không phải là tốt nhất OD610 = 1,5 nhưng khả năng ức chế các vi khuẩn chỉ thị lại cao kích thước vòng kháng khuẩn đạt 9 – 18 mm. Khả năng kháng khuẩn và sinh trưởng của chủng BL1 giảm mạnh nếu không bổ sung NaCl vào môi trường, còn khi tăng nồng độ NaCl lên 1,5% thì sự sinh tổng hợp bacteriocin và sự sinh trưởng giảm OD610 = 0,9 kích thước vòng kháng khuẩn là 9 – 18 mm.
PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
Trong 5 chủng vi khuẩn lactic thì có chủng BL1 có khả năng ức chế cả 4 chủng chỉ thị.
Thời gian để chủng BL1 sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất là 36h. Nhiệt độ thích hợp nhất cho chủng sinh bactteriocin là 37oC
pH thích hợp nhất cho chủng sinh bactteriocin là 7,0.
Nồng độ NaCl thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp bacteriocin là 1%.
5.2. Kiến nghị
Để đề tài hoàn thiện hơn cần nghiên cứu bổ sung sau: Nghiên cứu định danh chủng BL1.
Nghiên cứu tách, chiết bacteriocin và xác định loại bacteriocin do vi khuẩn BL1 tổng hợp. Đưa vào ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly và Huỳnh Xuân Phong (2011), “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn”, Tạp chí Khoa học, 19a, p. 176-184.
2. Huỳnh Thị Dung, Nguyễn Thị Kim Hoa (2007), Bảo quản chế biến, rau, trái cây và hoa màu, Nxb Hà Nội.
3. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Muộn, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, Nxb khoa học kĩ thuật Hà Nội.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục.
5. Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập II, Nxb Sư phạm. 6. Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh,
Nguyễn Thị Giang (2008), “Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn thành phố Hà Nội”, Tạp chí khoa học ĐHQGHN, Khoa học tự nhiên và công nghệ, 24, p. 221-226.
7. Phạm Thị Ngọc Lân (2006), Vật liệu polyme phân hủy sinh học, Nxb Bách Khoa- Hà Nội.
8. Trần Vân Khánh (2007), Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic thích hợp cho probiotic chất lượng cao, Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
9. Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền (2010), “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại ”, Di truyền học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học, 6.
10. Nguyễn Đức Lượng (2002), Vi sinh vật công nghiệp, tâp 2, Nxb Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
11.Trần Linh Thước (2007), Phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục.
Tài liệu tiếng anh
12. chen H. Hoover D.G (2003).” Bacteriocin and their food application”
Compre. Rev. Foood Scien Food Safety2(3).pp.82-100.
13. Cleveland J.. Montville T.J..Nes L.F. and Hernandez P.E. (2001), “Bacteriocin: safe, nutnural antimicrobials of Lactic Acid Bacteria”.
14. Davidson P.M, Hoover D.G. (1993), “ Antimicrobial components from lactic acid bacteria”. In Salmimem, A Von Wright, A(Eds), Lactic acid bacteria, Chapman &Hall, New York.
15. El-Ziney M.G., Debevere J., Jakosen M. (2000), Reuterin, In: Naidu, A.S(Ed), Natural Food Antimicrobial Systerms, CRC Press, London.
16. European Cormmission (2002), Enterococci in foods functional and safety aspects, Programme ang Book of Abstracts, Berlin- Germany
17. FAO/WHO (2012), Evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria, FAO of the UN and WHO Expert Consultation Report, Cordoba.
18. Gaslvez A., Abriouel H., López R,L., Omar N.B (2007), “Bacteriocin- based strategies for food biopreservation”, Int, J, Food Microbiol.
19. Gert N.Moll, Wil N.Konings, Arnold J.M.Driessen (1999). “Bacteriocin: mechanism of membrane insertion and pore formation”. Antonie van Leeuwenhoek, 76, 185 – 198.
20. Harranz C., Chen Y., Chung H.J., Cintas L.M., hermandez P.E., Montville t.j., Chikindas M.L. (2001), “Enterocin P selectively dissipates the membrane potential ò Enterococcus faecium T136” Appl, Environ, Microbiol.
21. H.chen, D.G.Hoover (2003). “Bacteriocin and their food applications”. Comprehensive review in food sience and food safety. 2, 82 – 85.
22. Hühne K, Axelsson L, Holck A, Kröckel L (1996). “Analysis of the sakacin P gene cluster from Lactobacillus sake Lb674 and its expression in sakacin-negative Lb. sake strains". Microbiology (Reading, Engl.) 142(6): 1437–48. PMID 8704983
23. Joerger MC, Klaenhammer TR (1986). “Characterization and purification of helveticin J and evidence for a chromosomally determined bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481”. J.Bacteriol, 1986 Aug167(2):439-46.
24. Jofres A, Garriga M, Aymerich T (2007). “Inhibition of Listeria monocytogenes in cooked ham through active packaging with natural antimicrobials and high-pressure processing”. J. Food Prot, 70 (11): 2498- 502, PMID 18044426.
25. Juan C. Oscáriz, Antonio G. Pisabarro (2001). “Classification and mode of action of membrane-active bacteriocin produced by gram positive bacteria”. Int. Microbiol (2001) 4: 13-19, DOI 10.1007/s101230100003, published online 25 August 2001.
26. Katla T, Møretrø T, Sveen I, Aasen IM, Axelsson L, Rørvik LM, Naterstad K (2002). “Inhibition of Listeria monocytogenes in chicken cold cuts by addition of sakacin P and sakacin P-producing Lactobacillus sakei”. J.Appl. Microbiol 93 (2): 191-196, DOI : 10.1046/j.1365- 2672.2002.01675.x PMID 12147066.
27. Klaenhammer T.R.(1993), “Genetics of bacteriocin produced by lactic acid bacteria” FEMS Microbiol. Rev.
28. Lukassova J., Sustackova A.(2003), “Enterococci and antibiotic resistance”, Acta. Vet. Brno.
29. Monthon Lertcannawanichakul and Songtham Sawangnop (2008). A comparison of two methods used for measuring the antagonistic activity of
30. Neysens, P; Messens, W; De Vuyst, L.(2003). Effect of sodium chloride on growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471. INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, Volume 88, Number 1, p.29-39.
31. Parente, E. & Hill, C (1992), “A comparison of factors affecting the production of two bacteriocins from lactic acid bacteria”, Journal of Applied Microbiology, 73, p. 290 – 298.
32. Riley M.A., Wertz J.E. (2002), “Bacteriocin: evolution, ecology, and application”, Annu, Rev, Microbiol.
33. Vesterlund S, Paltta J, Lauková A, Karp M, Ouwehand AC (2004). “Rapid screening method for the detection of antimicrobial substances” J.Microbiol Methods, 2004 , Apr;57(1):23-31.
PHỤ LỤC