Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập từ thực phẩm lên men

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG TẠ THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đà Nẵng - Năm 2017 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG TẠ THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán hướng dẫn: TS PHẠM THỊ MỸ Đà Nẵng – Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Sinh viên thực Tạ Thị Hương LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực khóa luận tốt nghiệp, tơi nhận nhiều giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía thầy cơ, gia đình bạn bè Nhờ mà tơi hồn thành khóa luận mong muốn, cho phép gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: Đầu tiên TS Phạm Thị Mỹ - giảng viên trực tiếp hướng dẫn đề tài Trong suốt thời gian thực hiện, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên lúc tơi gặp khó khăn Đồng thời, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học tạo môi trường thuận lợi, cung cấp đầy đủ trang thiết bị, dụng cụ cho thực đề tài cách thuận tiện Sau cùng, xin cảm ơn ủng hộ, giúp đỡ từ phía gia đình bạn bè suốt trình thực đề tài Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Chúc tất người sức khỏe thành đạt Đà Nẵng, tháng năm 2017 Sinh viên thực Tạ Thị Hương MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài .1 Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài .2 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN LACTIC 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Phân lo ại LAB 1.1.3 Quá trình lên men 1.2 BACTERIOCIN 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Sinh tổng hợp, phổ tác dụng chế tác dụng bacteriocin 11 1.2.4 Đánh giá hoạt tính bacteriocin 12 1.2.5 Chiết xuất tinh chế bacteriocin 12 1.2.6 Ứng dụng bacteriocin 14 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BACTERIOCIN TỪ LAB 16 1.3.1 Nghiên cứu nước 16 1.3.2 Nghiên cứu nước 17 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Đối tượng 19 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.2.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Phương pháp phân lập 20 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu khả sinh bacteriocin LAB 22 2.2.3 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp bacteriocin 23 2.2.4 Phương pháp khảo sát khả chiết bacteriocin bằng(NH4)2SO4 24 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP LAB TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN 25 3.1.1 Nhuộm Gram 25 3.1.2 Thử nghiệm catalase 27 3.1.3 Kiểm tra khả sinh acid lactic 29 3.1.4 Xác định kiểu lên men chủng vi khuẩn tuyển chọn 32 3.2 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN 33 3.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA CHỦNG LAB ĐƯỢC TUYỂN CHỌN 35 3.3.1 Ảnh hưởng pH 35 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 36 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian 37 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA TÁC NHÂN TỦA (NH4 )2SO4 ĐẾN CHẤT LƯỢNG BACTERIOCIN THU ĐƯỢC 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 47 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT FDA Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ) LAB Lactic Acid Bacteria (LAB) VK Vi khuẩn MRS De Man Rogosa Sharp PTN Phịng Thí Nghiệm EMP Embden-Meyerhof-Parnas SP Sản phẩm DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Sự khác biệt bacteriocin kháng sinh Bảng 1.2 Bacteriocin lớp IIc theo phân loại Klaenhammer 10 Bảng 2.1 Thành phần môi trường MRS 20 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Tổng hợp đặc tính sinh hóa 18 chủng VK phân lập Đường kính vịng kháng vi khuẩn thị chủng LAB Kích thước vòng ức chế VK thị chủng LAB (N1, D3, D5) giá trị pH khác Bảng 3.4 Kích thước vịng ức chế VK thị chủng LAB (N1, D3, D5) mức nhiệt độ Kích thước vịng ức chế VK thị chủng LAB (N1, D3, D5) thời điểm khác 30 34 35 37 38 Kích thước đường kính khảng VK thị Bảng 3.6 bacteriocin từ chủng LAB tủa nồng độ muối khác 40 DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Số hiệu hình vẽ Tên hình vẽ Trang Hình 1.1 Cấu trúc nisin Hình 1.2 Cấu trúc Leucocin A Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình ảnh ống giống 18 chủng VK phân lập từ sản phẩm lên men Quan sát tế bào 18 chủng VK phân lập kính hiển vi quang học vật kính 100X Kết thử nghiệm catalase 18 chủng VK phân lập từ sp lên men Kết kiểm tra khả sinh acid lactic 18 chủng vi khuẩn phân lập từ sản phẩm lên men Kết xác định kiểu lên men chủng LAB tuyển chọn Hoạt tính kháng vi khuẩn thị bacteriocin thu từ chủng LAB Hoạt tính bacteriocin chủng N1, D3, D5 với chủng thị E coli Pseudomonas sp 25 27 28 30 32 33 39 35 L cộng (2007), Bacteriocin LAB có khả ức chế nhiều vi khuẩn Gram (+) thường thể hoạt tính VKGram (-) [53] Như vậy, sau khảo sát khả sinh bacteriocin chủng LAB phân lập thấy có chủng D3, D5, N1 có hoạt tính bacteriocin cao chủng cịn lại Vì thế, chủng D3, D5, N1 lựa chọn cho nghiên cứu 3.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA CHỦNG LAB ĐƯỢC TUYỂN CHỌN 3.3.1.Ảnh hưởng pH pH mơi trường có tác động đáng kể vào tăng trưởng khả sinh hợp chất kháng khuẩn đặc biệt bacteriocin LAB [66] Vì thế, để xác định giá trị pH mà q trình sinh tổng hợp bacteriocin đạt tối ưu, thí nghiệm tiến hành môi trường MRS 37 0C với pH thay đổi khoảng từ – Kết ảnh hưởng pH thể thơng qua kích thước vịng ức chế chủng VKchỉ thị (E coli Pseudomonas sp.) giá trị pH (bảng 3.3.) Bảng 3.3 Kích thước vòng ức chế VK thị chủng LAB (N1, D3, D5) giá trị pH khác sp Pseudomonas E.Coli sp E.Coli sp D5 Pseudomonas pH D3 Pseudomonas N1 E.Coli Chủng 12.67 a 10.33 a 14.67 b 11.00 ab 12.67 ac 14.67 c 5.5 15.67 a 14.67 a 16.67 ab 12.67 ab 17 bc 16 ac 17.33 bd 16 d 18.33 b 12.67 b 20.33 bc 17.67 c 6.5 20.67 a 17.67 a 19.33 ab 16.67 b 22.33 c 19.33 c 16.33 a 11.33 a 13.33 b 12.33 ab 16.67 ac 16.33 c * Các mẫu tự khác biểu diễn mức độ sai khác có ý nghĩa (theo dịng) độ tin cậy 95% Kết bảng 3.3 cho thấy pH có ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng N1, D3, D5 nhiên với mức độ không nhiều Khi tăng dần giá trị pH từ đến 6.5 hoạt tính ức chế phát triển VKchỉ thị tăng 36 lên đạt giá trị cực đại pH = 6.5 với đường kính vịng kháng khuẩn tương ứng: ∆DE(N1) = 20.67amm, ∆DP (N1) = 17.67 amm, ∆DE(D3) = 19.33 abmm, ∆DP (D3) = 16.67 bmm ∆DE(D5) = 22.33 cmm, ∆DP (D5) = 19.33 cmm Tiếp tục tăng pH lên nhận thấy hoạt tính ức chế giảm Điều chứng tỏ pH = 6.5 lượng bacteriocin sinh lớn Kết nghiên cứu phù hợp với nhiều nghiên cứu nước Todorov Dicks (2005), khảo sát khả sinh bacteriocin VKL plantarum ST194BZ điều kiện pH khác cho hoạt tính bacteriocin cao với pH môi trường 6.5 [66] Theo nghiên cứu Patil cộng (2011), chủng Pediococcus acidilactici MPK1 sinh hoạt tính mạnh pH [54] Cịn chủng L plantarum SC01 (Lê Ngọc Thùy Trang Phạm Minh Nhựt, 2014) sinh hoạt tính mạnh pH [17] Thơng qua nghiên cứu thấy, thuộc nhóm LAB chủng phân lập từ nguồn mẫu khác vùng khác chúng có khả phát triển tốt giá trị pH khác 3.3.2.Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ ni cấy có ảnh hưởng quan trọng đến khả sinh hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn Trong bacteriocin sản xuất nhiều điều kiện nhiệt độ tối ưu [54] Với mục đích xác định nhiệt độ tối thích cho q trình tổng hợp bacteriocin, nhóm nghiên cứu tiến hành thí nghiệm khảo sát mơi trường MRS pH 6.5 nuôi dải nhiệt độ 25 0C, 30 0C, 37 0C, 45 C Kết ảnh hưởng nhiệt độ thể thông qua kích thước vịng ức chế chủng VKchỉ thị (E coli Pseudomonas sp.) mức nhiệt độ (bảng 3.4) 37 Bảng 3.4 Kích thước vịng ức chế VK thị chủng LAB (N1, D3, D5) mức nhiệt độ Pseudomonas sp E.Coli Pseudomonas sp D5 E.Coli D3 Pseudomonas sp N1 E.Coli Chủng 250 C 12 a 10.67 a 12.33 ab 12.33 ab 14.67 abc 12 c 300 C 17 a 16 a 15.33 b 13ab 16.67 bc 14.67 bc 370 C 20.67 a 17.67 a 19.33 ab 16.67 b 22.33 c 19.33 c 450 C 17.33 a 15.67 a 17 b 14 b 19.33 ac 17.33 c Nhiệt độ *Các mẫu tự khác biểu diễn mức độ sai khác có ý nghĩa (theo dòng) độ tin cậy 95% Dựa vào bảng 3.4, nhận thấy tăng nhiệt độ nuôi cấy, khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng VK N1, D3, D5 tăng dần đạt cực đại khoảng 37 0C với đường kính vịng kháng khuẩn tương ứng: ∆DE(N1) = 20.67 amm, ∆DP (N1) = 17.67 amm, ∆DE(D3) = 19.33 abmm, ∆DP (D3)= 16.67 bmm ∆DE(D5) = 22.33 cmm, ∆DP (D5) = 19.33 cmm, tiếp tục tăng nhiệt độ lên 45 oC khả sinh tổng hợp bacteriocin lại giảm Kết trùng khớp với nghiên cứu Todorov Dicks (2005) trước [66] Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy 37 0C nhiệt độ tối ưu để thu bacteriocin 3.3.3.Ảnh hưởng thời gian Để kiểm tra ảnh hưởng thời gian đến khả sinh bacteriocin chủng LAB, nhóm nghiên cứu tiến hành ni chủng LAB (N1, D3, D5) môi trường MRS pH 6.5, nhiệt độ 370 C thu nhận dịch VKtại thời điểm khác nhau: 24h, 48h 72h Kết đánh giá khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng LAB thời điểm khác thơng qua hoạt tính ức chế phát triển VKchỉ thị thể bảng 3.5 38 Bảng 3.5 Kích thước vịng ức chế VK thị chủng LAB (N1, D3, D5) thời điểm khác Pseudomonas sp E.Coli Pseudomonas sp D5 E.Coli D3 Pseudomonas sp N1 E.Coli Chủng 24h 8.33 a 8.33 a 6.33 b 6.33 ab 8.67 bc 8bc 48h 20.67 a 17.67 a 19.33 ab 16.67 b 22.33 c 19.33 c 72h 15.67 a 16.33 a 17 ab 14 b 18.67 ac 17.33 bc Thời gian *Các mẫu tự khác biểu diễn mức độ sai khác có ý nghĩa (theo dòng) độ tin cậy 95% Kết đo kích thước vịng ức chế chủng VK thị bảng 3.5 cho thấy, sau khoảng thời gian ni cấy khác lượng bacteriocin sinh chủng nghiên cứu khác Tại thời điểm sau 48h nuôi cấy, khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng N1, D3, D5 cho kết cao với đường kính vịng kháng khuẩn tương ứng: ∆DE(N1) = 20.67 amm, ∆DP (N1) = 17.67 amm, ∆DE(D3)= 19.33 abmm, ∆DP (D3)= 16.67 bmm ∆DE(D5) = 22.33 cmm, ∆DP (D5) = 19.33 cmm Khi tiếp tục tăng thời gian ni cấy lên 72h thấy đường kính vịng ức chế chủng VK thị giảm chứng tỏ lượng bacteriocin sinh bị Như vậy, thời điểm 48 thời điểm tối ưu để thu nhận bacteriocin Từ nghiên cứu trên, nhóm nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu để thu bacteriocin lớn chủng nghiên cứu ni chủng nghiên cứu môi trường MRS pH 6.5, nhiệt độ 37 0C thu nhận thời điểm sau 48h ni cấy Nhóm nghiên cứu tiến hành ni cấy chủng LAB N1, D3, D5 điều kiện tối ưu tiến hành khảo sát hoạt tính kháng VK thị bacteriocin sinh Kết trình bày hình 3.7 Pseudomonas E.Coli 39 Hình 3.7 Hoạt tính bacteriocin chủng N1, D3, D5 với chủng thị E coli Pseudomonas sp 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA TÁC NHÂN TỦA (NH4)2 SO4 ĐẾN CHẤT LƯỢNG BACTERIOCIN THU ĐƯỢC Muối (NH4 )2SO4 tác nhân dung để tủa protein phổ biến lợi giá thành rẻ, mức độ chọn lọc cao làm biến tính protein [1] Bacteriocin LAB có chất protein nên nghiên cứu nhóm tác giả lựa chọn muối (NH4)2SO4 làm tác nhân tủa Thí nghiệm tủa bacteriocin tiến hành với nồng độ muối khác nhau: 30%, 50%, 70%, 90% Kết thu cho thấy nồng độ muối 30% 50% không nhận thấy tạo thành kết tủa ống nghiệm Khi tăng nồng độ muối lên 70% thấy xuất kết tủa nồng độ muối 90% cho phép thu lượng kết tủa lớn Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối (NH4)2SO4 lên chất lượng bacteriocin thu thông qua đánh giá hàm hoạt tính kháng VK thị.Bacteriocin thô thu sau kết tủa nồng độ muối (NH4)2SO4 khác hòa tan lại đệm acetat tiến hành khảo sát khả 40 kháng chủng VK thị (E coli Pseudomonas sp.) Kích thước vịng kháng khuẩn trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Kích thước đường kính khảng VK thị bacteriocin từ chủng LAB tủa nồng độ muối khác E coli Pseudomonas sp 70% 90% 70% 90% N1 8.33 8.67 7.33 D3 6.67 7.67 5.67 6.67 D5 10.33 8.33 Kết khảo sát bảng 3.6 cho thấy mức độ ức chế chủng VK thị bacterioncin thu từ chủng LAB tiến hành tủa nồng độ muối (NH4)2SO4 khác Khi tăng nồng độ muối từ 70% lên 90% đường kích vòng ức chế tăng tất mẫu bacteriocin Điều chứng tỏ khả ức chế VK thị mạnh lên Như từ kết khảo sát hàm lượng protein khả kháng VK thị cho thấy với nồng độ muối (NH4)2SO4 90% thu hàm lượng bacteriocin lớn chất lượng tốt 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu trên, rút số kết luận sau:  Từ số sản phẩm lên men (nước dưa chua, rau cải muối, nem chua) phân lập 18 chủng VK có chủng VK lactic tuyển chọn chủng LAB (N1, D3, D5) có khả sinh tổng hợp bacteriocin cao  Đã tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng LAB tuyển chọn xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu lượng bacteriocin lớn nhất: môi trường MRS với pH 6,5 nuôi 37 0C thời gian 48h  Đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng tác nhân tủa (NH4)2SO4 đến chất lượng bacteriocin thua xác định với nồng độ muối (NH4)2 SO4 90% giá trị thích hợp để thu bacteriocin từ chủng LAB (N1, D3, D5) KIẾN NGHỊ Trong nghiên cứu tiếp theo, nhóm tác giả định hướng số hướng nghiên cứu sau: - Nghiên cứu phương pháp tách tinh để thu bacteriocin tinh khiết - Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm bảo quản thực phẩm từ bacteriocin thu quy mơ phịng thí nghiệm 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt1 Nguyễn Thị Hiền cộng (2012), Công nghệ sản xuất enzym, protein ứng dụng, Nhà xuất giáo dục Việt Nam Y tế Việt Nam Bộ (2016), BÁO CÁO CHUNG TỔNG QUAN NGÀNH Y TẾ NĂM 2015, Tập 9, Nhà xuất Y học Hà Nội, tr.95 -98 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly Huỳnh Xuân Phong (2011), "Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả sinh chất kháng khuẩn", Tạp chí khoa học 2011,Trường Đại học Cần Thơ(19a), tr 176-184 Nguyễn Thành Đạt Nguyễn Duy Thảo (1996), Vi sinh vật học, Nxb Giao dục, tr.133-138 Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú Lê Thanh Bình (2008), "Một số tính chất bacteriocin tổng hợp vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bị ", Tạp chí khoa học - Cơng nghệ 46(6), tr 33 - 41 Hoàng Thị Diễm (2006), Phân lập, xác định khảo sát số đặc điểm probiotic Lactobacillus điều kiện invitro, Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công Nghệ Sinh học, Đại học Khoa học Tự Nhiên TP HCM Nguyễn Lân Dũng cộng (1972, 1976, 1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, II, III, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Duy Lưu Thị Thúy (2012), "Sự sinh trưởng sản sinh bacteriocin vi khuẩn lactic T13 mơi trường ni cấy cá giị ngun liệu tươi", Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thuỷ sản 4, tr 15 - 19 10 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiện vi sinh vật học, tập 2, ed, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 11 Huỳnh Thị Yến Ly (2010), Phân lập định danh vi khuẩn acid lactic có khả sinh chất kháng khuẩn từ men tiêu hóa thực phẩm lên men, Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại học Cần Thơ 12 Lê Văn Việt Mẫn Lại Mai Hương (2006), Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 13 Trần Bích Ngọc (2011), Đánh giá ảnh hưởng dịch bacteriocin từ vi khuẩn lactic đến chất lượng cá giò tươi, Luận văn tốt nghiệp, Viện công nghệ sinh học môi trường - Trường Đại học Nha Trang 14 Trần Ngọc Tân cộng (2008), "Tổng hợp biểu gen mã hóa enterocin vịng AS-48 vi khuẩn Enterococcus faecalis tế bào Escherichia coli", Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(3), tr 367-373 15 Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm, mỹ phẩm , Nhà xuất Giáo dục 43 Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh, Nhà xuất Giáo dục Thành phố Hồ Chí Minh 17 Lê Ngọc Thùy Trang Phạm Minh Nhựt (2014), "Phân lập khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sản sinh hợp chất kháng khuẩn lactobacillus plantarum", Tạp Chí Sinh Học 36(1se), tr 97-106 18 Nguyễn Thị Thảo Trang (2012), Nghiên cứu đặc điểm phân loại vi sinh vật có khả sinh bacteriocin phân lập từ tôm hùm Khánh Hịa, Viện Cơng nghệ sinh học Mơi trường, Trường Đại học Nha Trang 19 Lê Thị Hồng Tuyết (2004), Một số đặc tính bacteriocin sản xuất vi khuẩn Lactobacillu, Luận văn thạc sĩ khoa học Vi sinh, Đại học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh 20 Phạm Văn Ty Vũ Nguyên Thành (2009), Công nghệ sinh học - Tập 5: Công nghệ vi sinh môi trường, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, Hà Nội 21 Abee cộng (1999), Food fermentation part 1, Department of Food Technology and Nutritional Sciences, , Wageningen Agriculture University 22 Brand A.M., De Kwaadsteniet M Dicks L.M.T (2010), "The ability of nisin F to control Staphylococcus aureus infection in the peritoneal cavity, as studied in mice", Letters in applied microbiology 51(6), tr 645-649 23 Brink B.T cộng (1994), "Antimicrobial activity of lactobacilli: preliminary characterization and optimization of production of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus M46", Journal of Applied Microbiology 77(2), tr 140-148 24 Broadbent JR cộng (1989), "Ninsin inhitbits several gram – positive, mastitis–causing pathogens", J.Dairy Sci 72(12) 25 Brötz H Sahl H-G (2000), "New insights into the mechanism of action of lantibiotics—diverse biological effects by binding to the same molecular target", Journal of Antimicrobial Chemotherapy 46(1), tr 1-6 26 Cheigh C.I cộng (2004), "Simple one-step purification of nisin Z from unclarified culture broth of Lactococcus lactis subsp lactis A164 using expanded bed ion exchange chromatography", Biotechnology letters 26(17), tr 1341-1345 27 Cintas L.M cộng (2001), "Review: bacteriocins of lactic acid bacteria", Food Science and Technology International 7(4), tr 281-305 28 Cotter P.D., Hill C Ross R.P (2005), "Bacteriocins: developing innate immunity for food ", Nature Reviews Microbiology 3(10), tr 777-788 29 Coventry M.J cộng (1996), "A food-grade process for isolation and partial purification of bacteriocins of lactic acid bacteria that uses diatomite calcium silicate", Applied and environmental microbiology 62(5), tr 1764-1769 16 44 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 De Vuyst L Leroy F (2007), "Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications", Journal of molecular microbiology and biotechnology 13(4), tr 194-199 Desriac F cộng (2010), "Bacteriocin as weapons in the marine animal-associated bacteria warfare: inventory and potential applications as an aquaculture probiotic", Marine drugs 8(4), tr 1153-1177 Dobson A cộng (2012), "Bacteriocin production: a probiotic trait", Applied and environmental microbiology 78(1), tr 1-6 Fredericq P cộng (1949), "Recherche des germes producteurs de colicines dans les selles de malades atteints de fièvre paratyphoïde B", CR Soc Biol 143, tr 556-559 Garrity G cộng (2009), " Bergey‟s mannual of Systematic Bacteriology", second edition, volume 3: The Firmicutes,Springer, tr 1-10 Gratia A (1925), "Sur un remarquable exemple d'antagonisme entre deux souches de colibacille", CR Soc Biol 93, tr 1040-1041 Heng N.C cộng (2007), "The diversity of bacteriocins in Grampositive bacteria", Bacteriocins: Ecology and Evolution, tr 45-92 Herna´ndez, D.E Cardell V [U2] Za´rate (2004), "Antimicrobial activity of acid lactic bacteria isolated from Tenerife cheese: initial characterization of plantaricin TF711, a bacteriocin-like substance produced by Lactobacillus plantarum TF711", Journal of Applied Microbiology 99, tr 77-84 Hoover D.G Chen H (2005), Bacteriocins with potential for use in foods, Antimicrobials in food,Third Edition, tr.389-428 Hühne K cộng (1996), "Analysis of the sakacin P gene cluster from Lactobacillus sake Lb674 and its expression in sakacin-negative Lb sake strains", Microbiology (Reading, Engl.) 142(6), tr 1437-1448 James GC Natalie S (2002), Microbiology - A Labaratory Manual, th Edition Jansen E.F Hirschmann D.J (1944), "Subtilin, an antibacterial product of Bacillus subtilis: culturing conditions and properties", Archives of Biochemistry 4, tr 297-304 Jofré A, Garriga M Aymerich T (2007), " Inhibition of Listeria monocytogenes in cooked ham through active packaging with natural antimicrobials and high-pressure processing", J Food Prot 70(11), tr 24982502 Juan C Oscáriz Antonio G Pisabarro (2001), "Classification and mode of action of membrane-active bacteriocin produced by gram positive bacteria", Int Microbiol 4, tr 13-19 M Kacem, K.H Zadi N.E Karam (2004), " Isolation of lactic aid bacteria for its possible use in the fermentation of green algerian olives ", Grasas y Aceites 55 Fasc 4, tr 385-393 45 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 Kimura H cộng (1997), "A bacteriocin of strain Pediococcus sp ISK-1 isolated from Nukadoko, bed of fermented rice bran", Bioscience, biotechnology, and biochemistry 61(6), tr 1049-1051 Klaenhammer T.R (1988), "Bacteriocins of lactic acid bacteria", Biochimie 70(3), tr 337-349 Lee KH cộng (2007), "Characterization of paraplantaricin C7, a novel bacteriocin produced by Lactobacillusparaplantarum C7 isolated from kim chi", J Microbiol Biotechnol 17(2), tr 287- 296 Martin Dworkin, Stanley Falknow Eugene Rosenberg (2006), The Prokaryote, A Handbook on the biology of bacteria , third Edition, 320- 403 Mota-Meira M., Morency H Lavoie M.C (2005), "In vivo activity of mutacin B-Ny266", Journal of Antimicrobial Chemotherapy 56(5), tr 869871 Mugochi T cộng (2001), "Bioassay for the rapid detection of bacteriocins in fermentation broth", Biotechnology letters 23(15), tr 12431247 Nes I.F cộng (1996), "Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria", Antonie van Leeuwenhoek 70(2-4), tr 113-128 Nishie M., Nagao J.I Sonomoto K (2012), "Antibacterial peptides bacteriocins: an overview of their diverse characteristics and applications", Biocontrol science 17(1), tr 1-16 Parada J.L cộng (2007), "Bacteriocins from lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives", Brazilian Archives of Biology and Technology 50(3), tr 521-542 Patil M M cộng (2011), "Optimization of bacteriocin production by Pediococcus acidilactici MPK1 using response surface methodology", International Journal of environmental Sciences 2(2), tr 678 - 685 Pineiro M Stanton C (2007), "Probiotic bacteria: legislative framework requirements to evidence basis", The Journal of nutrition 137(3), tr 850S853S Pingitore E.V cộng (2007), "Different strategies for purification of antimicrobial peptides from Lactic Acid Bacteria (LAB)", Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology 1, tr 557-568 Rea M C cộng (2011), "Effect of broad-and narrow-spectrum antimicrobials on Clostridium difficile and microbial diversity in a model of the distal colon", Proceedings of the National Academy of Sciences 108(Supplement 1), tr 4639-4644 Reeves Peter (1965), The bacteriocins, Springer verlag, Berlin Heidelberg - New york Riley M.A Wertz J.E (2002), "Bacteriocins: evolution, ecology and application", Annual Reviews in Microbiology 56(1), tr 117-137 46 Samar Lasta cộng (2012), "Lacticin LC14, a New Bacteriocin Produced by Lactococcus lactis BMG6.14: Isolation, Purification and Partial Characterization", Infectious Disorders – Drug Targets 12(4), tr 316-325 61 Satish Kumar, Ramraj Venkatesan Arul (2009), "Purification and characterization of phocaecin PI80: an anti-listerial bacteriocin produced by Streptococcus phocae PI80 Isolated from the gut of Peneaus indicus (Indian white shrimp)", J Microbiol Biotechnol 19(11), tr 1393-1400 62 A Savadogo cộng (2006), " Bacteriocins and lactic acid bacteria", African Journal of Biotechnology 5(9), tr 678-683 63 Suárez A.M cộng (1997), "One-step purification of nisin A by immunoaffinity chromatography", Applied and environmental microbiology 63(12), tr 4990-4992 64 Svetoslav D Todorov Leon M.T Dicks (2007), "Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus ST712BZ isolated from boza", Brazilian Journal of Microbiology 38(1) 65 Tagg J.R., Dajani A.S Wannamaker L.W (1976), "Bacteriocins of grampositive bacteria", Bacteriological reviews 40(3), tr 722-756 66 Todorov S.D Dicks L.M.T (2005), "Effect of growth medium on bacteriocin production by Lactobacillus plantarum ST194BZ, a strain isolated from Boza", Food Technology and Biotechnology 43(2), tr 165 173 67 Todorov SD1, van Reenen CA Dicks LM (2004 ), "Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus plantarum ST13BR, a strain isolated from barley beer.", J Gen Appl Microbiol 50(3), tr 149-57 68 Vesterlund S cộng (2004), "Rapid screening method for the detection of antimicrobial substances", J.Microbiol Methods 57(1), tr 23-31 69 Wood B J (1998), Microbiology of Fermented Foods second, Tập 1, Elsevier applied science publishers London and New yerle, 852 70 Yang R., Johnson M.C Ray B (1992), "Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria", Applied and Environmental Microbiology 58(10), tr 3355-3359 71 Yuan Kun Lee cộng (1999), "Handbook of probiotics", John Wiley & Sons inc 72 AH Soore , T Masud Kiran Anwaar (2002 ), "Role of Lacid acid Bacteria (LAB) in food preservation and human Heath." 1(1), tr 20 -24 60 a 47 PHỤ LỤC Hóa chất sử dụng khóa luận - Cao nấm men, cao thịt, tween 80 (Đức), Glucose, saccharose, lactose, galactose, maltose, dextrin, sorbitol, pepton - MnSO4, NaCl, CaCO3, KOH, phenol, acid lactic, phenolphtalein, NaOH, gentian violet, KI - MgSO4.7H20, FeCl3, K2HPO4, KH2PO4, fuchsin kiềm, FeSO4, (NH4)3C6H3O7 - Agar, CH3 COONa, cồn • Thuốc thử Catalase Dung dịch 3% H2O2 (hydrogen peroxide) • Thuốc thử Uffelmann Phenol 5% 10 ml FeCl3 5% ml Nước cất 25 ml • Thuốc nhuộm Gram Dung dịch tím gentian: nồng độ 1/10 10 ml cồn ethylic 95 độ + ml acid phenic + 100 ml nước cất, lắc đều, lọc qua giấy lọc Dung dịch lugol: g iod + 2g KI + 5ml nước cất, nghiều cối xứ thêm nước cất đủ 200 ml Dung dịch fuchsin kiềm: nồng độ 1/10 10 ml cồn ethylic 95 độ + ml acid phenic + 100 ml nước cất, lắc đều, lọc qua giấy lọc Cồn 90 độ, nước cất  Thuốc thử Folin-Ciocalteu’s phenol Công thức mơi trường sử dụng khóa luận  Môi trường MRS (De Man-Rogosa-Sharp) Dùng để nuôi cấy, giữ giống nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa, bao gồm: mơi trường MRS – agar (thạch) môi trường MRS – both (dịch thể) 48 Bảng 2.1 Thành phần môi trường MRS Đường glucoza 20,0g K2HPO4 2,0g CaCO3 5,0g CH3COONa 5,0g Cao thịt 10,0g Triamoni citrate 2,0g Pepton 10,0g MgSO4.7H2O 0,58g Cao nấm men 5,0g MnSO4.4H2O 0,28g Tween 80 ml Nước cất đủ 1000 ml Agar 15,0g pH= 6,0; khử trùng 121 o C/20 phút - Môi trường dịch thể không bỏ thạch CaCO3  Môi trường LB Bacto-Tryptone 10g NaCl 10g Cao nấm men 5g Nước cất vừa đủ pH= 7,0; khử trùng 121 o C/20 phút 1000 ml 49 Một số hình ảnh bổ sung Hình Mẫu sản phẩm lên thu để phân lập Hình Dịch vi khuẩn chủng LAB sau 48h nuôi mơi trường MRS Hình Lượng bacteriocin thơ thu sau tiến hành tủa (NH4)2SO4 nồng độ 70% 90% ... vào nghiên cứu bacteriocin vi khuẩn lactic Vi? ??t Nam, định thực đề tài ? ?Nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn lactic phân lập từ thực phẩm lên men? ?? nhằm mục đích ứng dụng bảo quản thực. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG TẠ THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán hướng dẫn: TS... màu sắc Từ rút kết luận rằng, có 9/18 chủng VK phân lập có khả sinh acid lactic Từ kết nghiên cứu đây, nhóm nghiên cứu tổng hợp đặc tính sinh hóa 18 chủng VK phân lập từ sản phẩm lên men (bảng