Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu, khả năng phân hủy sinh học hydrocacbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại quảng ninh

Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu, khả năng phân hủy sinh học hydrocacbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại quảng ninh

CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN

ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái nguyên - 2008

CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN

ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS NGHIÊM NGỌC MINH

Thái nguyên - 2008

Nghiêm Ngọc Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là KS Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn Bá Hữu những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để hoàn thành bản luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Sư Phạm - Đại Học Thái Nguyên

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà nội, tháng 9 năm 2008 Học viên

Lê Tiến Mạnh

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác

Tác giả

Lê Tiến Mạnh

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC CÁC BẢNG 2

DANH MỤC CÁC HÌNH 3

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 8

1.1.1 Tính chất hóa lý 8

1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hưởng của nó tới môi trường sống 10

1.2 Nguồn gốc phát sinh PAH .13

1.2.1 Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam 13

1.2.2 Nguồn gốc phát sinh 14

1.3 Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH 15

1.3.1 Phương pháp hóa lý 16

1.3.2 Phương pháp phân hủy sinh học 16

1.4 Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật 19

1.4.1 Vi sinh vật phân hủy PAH 19

1.4.2 Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV 21

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 25

1.6 Các phương pháp phân loại vi sinh vật 29

1.6.1 Phương pháp phân loại truyền thống 29

1.6.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử .30

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 33

2.2 Môi trường nuôi cấy 33

2.3 Máy móc và thiết bị nghiên cứu 34

2.4 Phương pháp nghiên cứu 34

2.4.1 Phân lập vi sinh vật trên mẫu nước nhiễm dầu 34

2.4.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn 35

2.4.3 Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn 36

2.4.4 Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3-dioxygenase 36

2.4.4.1 Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo phương pháp của Sambrook, Russell 36

2.4.4.2 Nhân đoạn gen bằng phương pháp PCR 37

2.4.4.3 Quy trình biến nạp và chọn dòng 38

2.4.4.4 Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động 40

2.4.4.5 Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại 41

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường chứa PAH 42

3.2 Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 44

3.3 Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn BQN31 45

3.4 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 49

3.4.2 Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 .50 3.4.3 Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc

thích hợp 52 3.4.4 Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 54 3.5 Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng

BQN31 57 IV KẾT LUẬN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

bp Base pair (cặp bazơ)

USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ)

PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) POP Persistent Organic Pollutant

DNA Deoxyribonucleic acid

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH 9

Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH 20

Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 30 Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên mô i trường khoáng

đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế 56

Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3

dioxygenase của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công

bố trên ngân hàng gen quốc tế 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocacbon thơm đa nhân

(PAH) 8

Hình 1.2: Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật 21

Hình 1.3: Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn và nấm 22

Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 43

Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31 45

Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 45

Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 53

Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng vi khuẩn BQN31 53

Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 54

Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000 nucleotide so sánh 55

Hình 3.12: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol

2,3-dioxygenaza từ DNA tổng số chủng BQN31 và cặp mồi C23OF

và C23OR 58

Hình 3.13: Trình tự nucleotide và trình tự axít amin suy diễn đoạn

gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng

Sphingomonas sp BQN31 58

Hình 3.14: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen

mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng Sphingomonas

sp BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện Thước đo thể hiện

một nucleotide khác nhau trên 100 nucleotide so sánh 59

MỞ ĐẦU

Trong thời đại ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về nguyên liệu và nhiên liệu của con người ngày càng tăng, đã kéo theo sự mở rộng các ngành công nghiệp khai thác, chế biến như: công nghiệp dầu mỏ, khai thác chế biến than, công nghiệp sản xuất sơn, sản xuất các hóa chất tẩy rửa

Quảng Ninh là một tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm Bắc Bộ, có tốc độ tăng trưởng kinh tế cao so với bình quân chung của cả nước Trong những năm gần đây, các ngành công nghiệp và dịch vụ chiếm một tỷ trọng lớn, khoảng trên 80% GDP của tỉnh Các ngành công nghiệp khai thác và chế biến than, xi măng, đóng tàu, nhiệt điện, sản xuất vật liệu xây dựng đang có tốc độ phát triển nhanh Quảng Ninh là một trong những điểm trung chuyển xăng dầu lớn nhất cả nước Hoạt động vận tải đường bộ, đường thủy; các hoạt động du lịch, vận tải khách du lịch….diễn ra hết sức sôi động Các hoạt động trên đã tạo ra một bộ mặt kinh tế rất đa dạng của Quảng Ninh Tuy nhiên, các hoạt động đó cũng đã gây ra những hậu quả không nhỏ về môi trường, đặc biệt là các hoạt động vận chuyển và khai thác than, chế biến và sử dụng vật liệu nổ, các hoạt động vận tải, trung chuyển xăng dầu… ở Quảng Ninh

PAH là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai hay nhiều vòng thơm Chúng có mặt khắp nơi trong môi trường (đất, không khí, các nguồn nước và các lớp trầm tích) và là một trong các thành phần có trong các sản phẩm của dầu mỏ [16] Một số PAH có khả năng gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và là chất gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã xếp PAH vào nhóm những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành kiểm soát sự có mặt của PAH trong các hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn [16], [50]

Trong nước thải tại nhiều cơ sở sản xuất công nghiệp ở Quảng Ninh, ngoài một số hợp chất hữu cơ, vô cơ (NH4NO3) thì sự có mặt của dầu và một số các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) đang là vấn đề lớn đặt ra đòi hỏi các cấp chính quyền địa phương cần phải quan tâm xử lý triệt để Hiện nay để khắc phục hậu quả này có nhiều phương pháp có thể áp dụng như sử dụng hóa chất, hấp phụ, lắng đọng… Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp

Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn rất cao và thân thiện với môi trường Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu về điều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả năng phân hủy PAH của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật Các gen tham gia quá trình phân hủy sinh học PAH cũng được quan trắc trong quá trình xử lý, của các tập đoàn VSV bản địa và trong các nghiên cứu phân hủy PAH ở điều kiện phòng thí nghiệm Catechol là một trong các sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm, do vậy các gen mã hóa các enzym chuyển hóa catechol được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm

Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọn nghiên

cứu và thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng

phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh”

Mục tiêu nghiên cứu:

Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm

Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:

1 Phân lập và tuyển chọn một số loại vi khuẩn có khả năng phân h ủy PAH

2 Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập

3 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH

4 Phân loại định tên đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH dựa trên việc xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân

1.1.1 Tính chất hóa lý

Các PAH có mặt khắp nơi trong môi trường, những hợp chất này có 2- 6 vòng benzen kết hợp với nhau Trọng lượng phân tử vào khoảng 128 – 278 g/mol (Hình 1.1)

PAH là những chất kỵ nước Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước [16], [48] Đặc điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng phân tán của chúng trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon thơm đa nhân (PAH)

Số lượng vòng benzen trong cấu trúc hóa học của các PAH quyết định khả năng hòa tan của các PAH trong nước PAH giảm khả năng hòa tan trong nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzen tăng [54] Khả năng hòa tan của các PAH rất biến động, từ những chất khó hòa tan nhất là benzo(b)perylen có chỉ số hòa tan là 0,003 mg/l cho đến chất dễ hòa tan nhất là naphthalen có chỉ số hòa tan tới 31 mg/l Nếu khả năng hòa tan trong nước của PAH thấp, hay hệ số hấp phụ cao sẽ dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích, do đó ảnh hưởng rất nhiều tới khả năng chúng bị phân hủy sinh học bởi vi sinh vật [10] Ngược lại, khả năng hòa tan trong nước của PAH cao thì khả năng bị phân hủy bởi vi sinh vật cũng cao Điều đó cho thấy khả năng hòa tan trong nước của các PAH có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học PAH

Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH [31]

* Kpd= [octanol]/ [nước]

Trong các tính chất vật lý của PAH, hệ số Kpd

phản ánh khả năng hấp phụ lên bề mặt vật liệu rắn Nếu hệ số Kpd

cao, các PAH có xu hướng tăng

vòng thơm

Nhiệt độ nóng chảy

(oC)

Nhiệt độ sôi (oC)

Độ tan trong

nước (mg/l)

Áp suất hơi ở

20oC (torr)

khả năng hấp phụ lên bề mặt các vật liệu rắn, đồng nghĩa với sự giảm khả năng phân hủy sinh học

Áp suất hơi và nhiệt độ sôi của các PAH cũng có vai trò quan trọng trong quá trình xử lý loại bỏ PAH khỏi các vùng bị ô nhiễm do nó ảnh hưởng đến khả năng hóa hơi của mỗi PAH Khi áp suất hơi tăng, khả năng bay hơi của các PAH cũng tăng, mà sự bay hơi cũng là một con đường để loại bỏ PAH khỏi nguồn ô nhiễm Khả năng bay hơi của các PAH cũng phụ thuộc vào kích thước và khối lượng phân tử Naphthalene có kích thước nhỏ nhất nên có khả năng bay hơi đến 89%, trong khi đó benzo[a]pyrene (BaP) là hợp chất có kích thước lớn, chỉ có khả năng bay hơi 1% Phenanthrene là đồng phân của anthracene có độ bay hơi thấp hơn do cấu trúc phân tử chứa các vòng thơm không thẳng hàng như trong cấu trúc của anthracene (Hình 1.1 và Bảng 1.1)

PAH còn bị phân hủy dưới ánh sáng tử ngoại từ bức xạ mặt trời Trong khí quyển, PAH có thể phản ứng với những chất ô nhiễm như nitrogen oxid, sulfur oxid tạo thành các dạng dione, nitro và dinitro PAH và sulfonic acid

1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hưởng của nó tới môi trường sống

Tính độc của PAH đã được người ta biết đến từ những năm 30 của thế kỷ XX, khi Hieger và Cook cùng những cộng sự khác nghiên cứu và thấy tinh thể benzo(a)pyrene màu vàng gây khối u ở động vật thí nghiệm [17] Với con người, PAH có thể là tác nhân gây đột biến và dẫn đến ung thư [16], [31], [11], [27] Ở quy mô phòng thí nghiệm, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, quá trình gây ung thư bởi PAH là một quá trình phức tạp, đa giai đoạn và phụ thuộc vào nhiều yếu tố : kích thước phân tử PAH, độ phân cực trong phân tử, hóa học lập thể và các phản ứng xảy ra trong quá trình trao đổi chất, các nguyên tố mang điện tích mà có ảnh hưởng đến sự gắn kết của các sản phẩm trao đổi chất với các đại phân tử là DNA, RNA Một số nghiên cứu

khác đã đưa ra kết luận: các PAH có khối lượng phân tử nhỏ, cấu tạo phân tử chỉ có một, hai, ba vòng thơm là rất độc, trong khi các PAH có khối lượng phân tử lớn lại có thể gây độc ở mức độ gen, hoặc gây ra đột biến, bởi chúng có khả năng gắn vào các phân tử DNA, RNA, hoặc protein, gây nên những biến đổi ở mức phân tử [16], [42]

Naphthalene là một chất ô nhiễm thuộc nhóm PAH gây ảnh hưởng tới một loạt các cơ quan như phổi, thận và kìm hãm quá trình hô hấp Nhiễm độc naphthalene ở người dẫn tới bệnh thiếu máu và viêm thận Ngoài ra, sự thay đổi về da và mắt ở những người bị phơi nhiễm naphthalen cũng đã được công nhận Phenanthrene được biết như chất cảm quang với da người, chất gây dị ứng với động vật, đột biến tới hệ thống vi khuẩn trong các điều kiện đặc biệt Chất này gây yếu các nhiễm sắc thể tương đồng và kìm hãm sự nối liền các kẽ hở gian bào Ngoài ra, các PAH khác như acenaphthalene, fluoranthene, fluorene đều gây độc cho động và thực vật Độc tính của benzo(a)pyrene, benzo(a)anthracene, benzo(b)fluoranthrene, benzo(k)fluoranthrene, dibenzen (a,h)anthracene và indenol(1,2,3-c,d)pyrene đã được nghiên cứu chứng minh gây ung thư cho người Trong tự nhiên hiếm khi bắt gặp các PAH đơn lẻ mà chỉ gặp chúng ở dạng hỗn hợp nhiều PAH, do đó độc tính của chúng càng được tăng cường [53]

PAH thâm nhập gián tiếp vào cơ thể con người thông qua chuỗi thức ăn, đường hô hấp hoặc qua sự tiếp xúc trực tiếp với nguồn ô nhiễm, gây ung thư, đột biến gen Rất nhiều PAH có chứa “vùng bay” và vùng tương tự nó “vùng K” Cả hai vùng này đều cho phép trao đổi chất, tạo ra dạng liên kết “epoxit-vùng bay” và “epoxit- vùng K” có khả năng hoạt động cao và một số chúng là nguyên nhân gây ra ung thư [53]

Khi xâm nhập vào cơ thể, PAH nhanh chóng xâm nhập vào các mô mỡ và tiếp tục di chuyển đến những cơ quan khác Tùy từng loại PAH với liều

lượng và thời gian tác động mà mức độ ảnh hưởng đến cơ thể khác nhau Chẳng hạn, với naphthalene, nếu tiếp xúc trong thời gian ngắn, nồng độ thấp, nó có thể gây dị ứng, viêm tấy da, mắt Khi xâm nhập vào hệ tiêu hóa, naphthalene sẽ gây bệnh thiếu máu do chúng phá vỡ các tế bào hồng cầu Nếu tiếp xúc với naphthalene trong thời gian dài với nồng độ lớn hơn 10 ppm sẽ dẫn tới các bệnh kinh niên, gây ung thư da phổi và có thể làm giảm khả năng thụ thai ở phụ nữ và có thể làm nguy hiểm tới sự phát triển của thai nhi [31]

Trong số các PAH, người ta đặc biệt chú ý đến benzo[a]pyrene vì tính độc hại của nó Benzo[a]pyrene (BaP) là một thành phần có trong khói thuốc lá, và là một trong những nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi [16], [31] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh BaP có thể chuyển hóa thành các loại oxid với sự xúc tác của phức hệ cytochrome P450, mà những oxid này có thể phản ứng với các DNA gây đột biến BaP cũng được xác định là nguyên nhân gây ung thư cho con người và động vật [16], [31], [55]

Một vài nghiên cứu trên đối tượng động, thực vật cho thấy, động vật nếu tiếp xúc với naphthalene ở nồng độ cao, thì chỉ trong thời gian ngắn cũng có thể gây mờ mắt, gây độc ở mức độ vừa phải Hiệu ứng mạnh hơn, naphthalene có thể gây chậm phát triển, thậm chí gây chết với động thực vật Nghiên cứu ngưỡng độc của naphthalene đối với loài cá vược, người ta đã xác định LC50 là 240 g/l (LC50 là liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm) Bằng việc thử nghiệm với một nhóm chuột cho sử dụng anthracene với lượng 1,8 µg/l, người ta thấy rằng, sau 2 tuần gây nhiễm, tỷ lệ chuột xuất hiện khối u là 40% [31]

Sự tồn tại của các hợp chất PAH trong môi trường vùng bờ biển có thể đe dọa tới sức khỏe con người và môi trường biển thông qua các tác động trực tiếp hoặc qua các chuỗi thức ăn trong chu trình vật chất [61]

Do tính độc hại như vậy, cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã xếp PAH vào danh sách một trong những chất ô nhiễm điển hình và đã tiến hành kiểm định sự có mặt của PAH trong hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn [16], [53]

1.2 Nguồn gốc phát sinh PAH

1.2.1 Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam

Các hydrocarbon thơm đa nhân đã được tìm thấy ở nhiều môi trường sinh thái khác nhau, kể cả môi trường không khí Trong môi trường nước, PAH phân bố rộng rãi Người ta ước tính, hàng năm có khoảng 2,3x105

tấn các hợp chất này đã xâm nhập vào các hệ sinh thái dưới nước Đặc biệt, với hệ sinh thái bị ô nhiễm PAH vùng ven bờ biển thường có nguồn gốc từ phế thải và công nghiệp hóa dầu, công nghiệp khai thác và vận chuyển dầu mỏ, nước thải công nghiệp và sinh hoạt, cháy rừng và cháy đồng cỏ [61] Người ta đã định lượng được nồng độ BaP trong nước uống là 0,0002 đến 0,024 g/l Trong 90 mẫu nước kiểm tra ở Mỹ cho thấy nồng độ của 6 PAH từ 0,001 đến 0,01 g/l, 1% mẫu nước kiểm tra cho thấy nồng độ trung bình lớn hơn 0,1

g/l [31]

Nhiều công trình nghiên cứu còn cho thấy, sự có mặt của PAH trong các mẫu trầm tích với nồng độ đáng kể Một số nơi có mức độ ô nhiễm PAH rất cao: nồng độ các hợp chất PAH ở vịnh Boston (Mỹ) có thể lên tới 100.000 ng/g Nguyên nhân chủ yếu là do trong môi trường biển hầu hết các hợp chất PAH hòa tan kém trong nước đã dẫn đến việc chúng được tích lũy trong các lớp trầm tích [31]

Trong không khí cũng chứa một lượng đáng kể PAH Đã có hơn 500 PAH và các hợp chất liên quan được phát hiện trong không khí, đặc biệt là BaP chiếm tỷ lệ cao nhất Vào những năm 1970, ở Mỹ, nồng độ BaP trong không khí trung bình là 1- 5 ng/m3 Trong 30 năm trở lại đây, nồng độ BaP có

xu hướng giảm, tuy nhiên con số này hiện nay vẫn còn cao, khoảng 4 ng/m3

ở Copenhagen (Đan Mạch) Ở Trung Quốc, việc đốt than trong các hộ gia đình tạo ra một lượng BaP khoảng 14,7 g/m3

, ở Ấn Độ là 4 g/m3

[31]

Người ta cũng tìm thấy hydrocarbon thơm đa nhân nhiều trong đất bề mặt Nồng độ của PAH trong đất rừng rất dao động (từ 5 - 100 g/kg), mà nguồn chủ yếu là từ xác thực vật do quá trình cháy, hay hấp phụ PAH từ không khí Với đất nông nghiệp, mức độ ô nhiễm PAH từ 10 đến 100 g/kg, chủ yếu do mưa làm ngưng tụ các hợp chất PAH từ khí quyển và đi vào đất Nếu tính cho cả đất rừng và đất nông nghiệp, lượng ô nhiễm trung bình là 1000 g/kg Đối với đất bị nhiễm dầu, nồng độ ô nhiễm lớn hơn nhiều so với vùng đất rừng và đất nông nghiệp, bởi PAH là một thành phần chính có trong dầu mỏ [55]

Trong đất ở thành thị, nồng độ PAH khoảng 600 – 3000 g/kg, và có thể cao hơn nữa ở những vùng có các hoạt động vận tải và sản xuất công nghiệp [55]

1.2.2 Nguồn gốc phát sinh

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh của PAH, nhưng chúng đều có bản chất chung là do các quá trình đốt cháy không hoàn toàn các vật liệu hữu cơ trong tự nhiên hay cho hoạt động sản xuất của con người Trong tự nhiên, PAH được phát sinh là từ các quá trình địa chất tự nhiên, hóa lỏng khí than, các vụ cháy đồng cỏ, cháy rừng thậm chí trong các trận mưa [16], [28], [31], [38]

Con người cũng có thể gián tiếp hay trực tiếp làm phát sinh PAH vào môi trường từ việc đốt nhiên liệu (than đá, dầu diesen, ) trong sinh hoạt hay trong sản xuất (đốt nhiên liệu cho các phương tiện máy móc có động cơ, quá trình đốt rác tại các nhà lò đốt) Các vụ tràn dầu do sự cố hay trong quá trình vận chuyển cũng làm phát sinh một lượng đáng kể PAH vào môi trường [31]

Tại các nước công nghiệp phát triển, các hoạt động có liên quan đến đốt cháy tạo ra một lượng lớn PAH Các PAH này được tích tụ lại trong đất và làm tăng nồng độ PAH nhanh chóng trong vòng 100 -150 năm trở lại đây [31]

PAH là nhóm hợp chất độc, nhưng chúng lại khá quan trọng trong công nghiệp, đặc biệt trong các ngành công nghiệp dược, nhuộm, sản xuất đồ nhựa và sản xuất thuốc trừ sâu [31]: naphthalene, anthracene, phenanthrene thường được sử dụng trong công nghiệp sản xuất thuốc nhuộm Naphthalene cũng được dùng như thuốc xông diệt bướm trong các gia đình Đặc biệt, phenanthrene cũng được ứng dụng trong công nghiệp dược dùng để sản xuất thuốc ngủ Ở New York (Mỹ), hỗn hợp phenanthrene và anthracene được sử dụng để chống rỉ cho những thiết bị trữ nước [31] Benzo[a]pyrene được sử dụng để hạn chế muội và khói, trong công nghệ quét hắc ín, hay còn sử dụng để liên kết các phần tích điện lại với nhau Người ta cũng có thể tìm thấy trong hợp chất Creosote, một chất hóa học được sử dụng làm chất bảo quản gỗ (PAH chiếm đến 85% khối lượng của creosote) [20], [31] BaP cũng được sử dụng là tác nhân gây đột biến lên động vật thí nghiệm, để kiểm tra đặc tính gây ung thư của nó trong thời gian ngắn [31]

1.3 Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH

Tính chất độc hại và cấu trúc khó bị phân hủy trong tự nhiên của PAH đã trở thành một vấn đề cấp bách đang được chú ý Người ta đã và đang nghiên cứu nhiều biện pháp hóa học, lý học, sinh học v.v…nhằm phân hủy PAH Việc làm thay đổi cấu trúc hóa học của chất độc nhằm tạo ra các sản phẩm ít độc hoặc không độc cho môi trường và con người đang là một thách thức đối với các nhà khoa học và công nghệ Để giảm độc tính của các chất này, người ta hay phá vỡ cấu trúc phân tử của chúng bằng cách sử dụng enzyme cắt vòng Đến nay, trên thế giới, người ta đã đưa ra một số phương

pháp tiêu độc như: cô lập, chôn lấp, xử lý hóa học, đốt ở nhiệt độ cao, lý học, sinh học v.v

1.3.1 Phương pháp hóa lý

Trong cấu tạo hóa học của PAH, do có cấu trúc vòng thơm, PAH tương đối khó phân hủy trong tự nhiên Phương pháp chôn lấp hay được áp dụng đối với nhiều chất thải, rác thải, kể cả các chất thải nguy hại trong đó có chất độc hóa học [22] Ưu điểm của phương pháp này là không tốn kém nhưng nhược điểm là các chất độc vẫn nằm trong đất chứ không được phân hủy, các chất độc hóa học này sẽ là nguồn tiềm tàng gây ô nhiễm cho môi trường

Công nghệ thiêu đốt cũng đã được sử dụng trên thế giới, phương pháp xử lý này tương đối triệt để song giá thành lại cao và có khả năng gây ô nhiễm thứ cấp bởi các sản phẩm phụ tạo trong quá trình vận hành Các phương pháp hóa học như declo hóa, oxy hóa, phương pháp vật lý như quang hóa, sử dụng tia bức xạ, tia cực tím, hay áp suất cao cũng mang lại hiệu quả nhất định Theo Draper và cộng sự (1987), xử lý bằng phương pháp quang hóa, 80% chất độc bị phân hủy dưới tác động của chùm tia cực tím cường độ 20 W/cm3 ở nhiệt độ 20oC trong thời gian 3 ngày [25] Tuy nhiên, những phương pháp trên có nhược điểm là không có tác dụng với lớp đất có độ sâu dưới vài milimet, do đó chỉ xử lý được lớp đất rất mỏng trên bề mặt [49]

Mặc dù làm sạch PAH có thể được tiến hành bằng nhiều biện pháp lý hóa đã nêu ở trên, nhưng các phương pháp này có nhược điểm là gây ô nhiễm thứ cấp nên không an toàn và không xử lý triệt để Mặt khác, giá thành của việc sử dụng các phương pháp đó lại cao nên xu hướng sử dụng chúng ngày càng giảm

1.3.2 Phương pháp phân hủy sinh học

Hiện nay, phương pháp sinh học đang bắt đầu được quan tâm bởi tính an toàn và hiệu quả không những về mặt công nghệ mà còn về kinh tế Chìa

khóa của công nghệ phân hủy sinh học là thúc đẩy tập đoàn vi sinh vật bản địa tham gia vào quá trình phân hủy ở mức cao nhất Các nghiên cứu cơ bản đều nhằm mục đích thúc đẩy hiệu quả quá trình tẩy độc thông qua việc kích thích tập đoàn vi sinh vật trong các điều kiện phân hủy khác nhau tạo ra kết quả cuối cùng là các sản phẩm ít độc hoặc hoàn toàn không độc Chính vì vậy, công nghệ phân hủy sinh học đã trở thành công nghệ thân thiện với môi trường

Phương pháp phân hủy sinh học đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đã đạt được khá nhiều thành tựu Công nghệ sinh học đảm bảo an toàn cho môi trường hơn tất cả các công nghệ khác Đặc biệt, trong điều kiện sinh thái đa hệ, việc áp dụng công nghệ phân hủy sinh học PAH nói riêng và các nguồn chất độc nói chung sẽ mang lại hiệu quả kinh tế xã hội cao nhất [59], [61]

Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị khí Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể được tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác, sau vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể được hoàn toàn loại bỏ Phương pháp phân hủy sinh học không đòi hỏi các điều kiện phức tạp (nhiệt độ cao, áp suất lớn, quá trình xúc tác…) không gây ra ô nhiễm thứ cấp, thân thiện với môi trường, chi phí thấp, do đó rất phù hợp với điều kiện ở nước ta Tuy nhiên, phương pháp sinh học thường diễn ra với tốc độ chậm, thời gian xử lý kéo dài Đây chính là một nhược điểm cơ bản của nó, đòi hỏi có lời giải đáp từ phía các nhà khoa học

Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp sinh học có thể được tiến hành theo hai hướng chính: tăng cường sinh học và kích thích sinh học Tăng cường sinh học là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh

vật đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các môi trường bị ô nhiễm Tuy nhiên, vẫn còn có những khó khăn trong việc bổ sung vi sinh vật vào các nơi bị ô nhiễm do chi phí lớn; hiệu quả phân hủy nhiều khi không cao do nhiều nguyên nhân (sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường; sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần thiết cho hoạt động phân hủy của vi sinh vật) [26]

Kích thích sinh học là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại thông qua việc điều chỉnh các yếu tố môi trường như độ pH, độ ẩm, nồng độ O2, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v

Kích thích sinh học hiện là khuynh hướng được sử dụng rộng rãi trong xử lý ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học [26] Trong hoạt động sống, vi sinh vật cần nguyên tố N, P, một số chất dinh dưỡng khác và các điều kiện sống thích hợp Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phân lập những chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng PAH, nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu của chúng từ đó ứng dụng cho việc kích thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa trong việc phân hủy sinh học PAH tại vùng ô nhiễm Để tăng cường quá trình phân hủy sinh học, việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng như nguồn cacbon, nitơ, photpho theo phải theo tỷ lệ nhất định đã đề cập ở phần trên là C:N:P = 100:10:1 Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng cần điều chỉnh thích hợp, đảm bảo cho tốc độ phân hủy ở mức ổn định và đạt hiệu quả cao nhất

Đôi khi người ta cũng kết hợp cả hai biện pháp để có thể tăng cường sự phân hủy sinh học Có nghĩa là vừa bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có khả năng phân hủy chất ô nhiễm, đồng thời cũng tạo điều kiện tối ưu cho tập đoàn vi sinh vật bản địa hoạt động Như vậy, hoạt động của tập đoàn vi sinh

vật bản địa cùng với hoạt động của vi sinh vật ngoại lai sẽ tăng cường hiệu quả của quá trình xử lý [26]

Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện với các quy mô khác nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác Sau khoảng thời gian nhất định (vài tháng hoặc vài năm), các chất ô nhiễm có thể được loại bỏ hoàn toàn [23], [32]

Để bảo vệ sự đa dạng vi sinh vật và an toàn đối với môi trường, cần có sự giám sát chặt chẽ khi đưa các vi sinh vật từ nơi này sang nơi khác để xử lý ô nhiễm, nhất là với các vi sinh vật đã được chuyển gen Để quá trình bổ sung vi sinh vật đạt hiệu quả, cần phải bổ sung ở thời điểm mới bị ô nhiễm và với lượng lớn vi sinh vật ở trạng thái sinh trưởng tốt trước khi các vi sinh vật bản địa kịp thích nghi, tấn công và làm thay đổi cấu trúc cơ chất Tuy nhiên, việc lên men vi sinh vật với khối lượng lớn là điều không dễ dàng và vô cùng tốn kém, mặt khác cũng không đảm bảo vi sinh vật giữ nguyên được các đặc tính phân hủy ô nhiễm [26], [27]

1.4 Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật

1.4.1 Vi sinh vật phân hủy PAH

Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về khả năng của vi sinh vật sử dụng các PAH có trọng lượng phân tử thấp như naphthalene, phenanthrene và anthracene Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về tiềm năng phân hủy các PAH có trọng lượng phân tử cao như chrysene và benzo[a]pyrene [16]

Vi sinh vật phân hủy PAH phân bố rộng rãi trong tự nhiên Số lượng các vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn so với các vùng không ô nhiễm Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu hướng thích nghi, bằng cách thay đổi cấu trúc di truyền để hướng đến việc phân hủy PAH Vi khuẩn có vai trò quan trọng trong tham gia phân hủy sinh

học PAH trong nước và trầm tích, trong khi đó, nấm sợi và xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng phân hủy PAH và các chất ô nhiễm trong môi trường đất [27]

Thống kê ở bảng 1.2 cho thấy, vi sinh vật phân hủy PAH thuộc nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau [3], [6], [11], [27], [33], [42], [51], [60], [58],

[61], [62] Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa PAH phần lớn thuộc vi

khuẩn, vi khuẩn lam và một số vi tảo [16], [38], [58], [39], [60]

Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH

Vi khuẩn Vi khuẩn lam Vi nấm

Acinetobacter sp Aeromonas sp Alcaligenes denitrificans Arthobacter sp Bacillus cereus Beijerinckia sp Cycloclasticus

Corinebacterium renale Flavobacterium sp Micrococcus sp Mycobacterium sp Staphylococcus auriculans

Pseudomonas stuzeri Rhodococcus sp Sphingomonas sp Staphylococcus auriculans

Agmenellum quadruplicatum Anabena sp CA Amphora sp Aphanocapsa sp Chlorella autotrophica Chlamydomonas

angulosa

Coccochloris elabens Cylindrotheca sp Dunaliella tertiolecta Microcoleus

chthonoplastes Navicula sp Nostoc sp Phorphyridium Scapricomutum Synedar sp

Ulva fasciata

Aspergillus sp FVX5 Basidiobolus ranarum Bjerkandera adusta Candida maltosa Chrysosporium pannorum

Claviceps paspali Gliocladium sp Helicostylum catenoides

Linderina pennispora Mucor hiemalis Penicillium chrysogenum Phycomyces blakesleeanus Ramaria sp

Rhizopus stononife Sordaria fimicola Trchoderma viride

Trong một thông báo tổng quan gần đây về các phân hủy sinh học PAH

của Johnsen (2005) cho thấy Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas và Mycobacteria là các vi khuẩn chiếm ưu thế [36]

1.4.2 Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV

Phân hủy sinh học các PAH có thể diễn ra theo hai cơ chế trao đổi chất và đồng trao đổi chất Quá trình chuyển hóa PAH bởi vi sinh vật có thể phân hủy thành các dạng không độc hoặc chuyển hóa hoàn toàn thành CO2 Cerniglia cho rằng quá trình phân hủy PAH có thể theo ba chiều hướng: phân hủy hoàn toàn, đồng phân hủy và oxi hóa không đặc hiệu [16]

Cerniglia (1993) đã tóm lược phân hủy PAH bởi vi sinh vật theo 3 nhóm chính (hình 1.2) Theo Cerniglia, catechol là chất trung gian của phân hủy sinh học PAH bởi vi khuẩn và tảo, tiếp theo catechol lại được cắt vòng ở

C¾t

Lignin peroxidase, laccase

Suntherland (1995) cũng đưa ra sơ đồ tương tự về các con đường phân hủy PAH bởi vi khuẩn và nấm (Hình 1.3)[51] Cụ thể, các PAH được phân hủy bởi vi sinh vật như:

- Chuyển hóa PAH đến cis-dihydrodiol, phenol và các sản phẩm cắt

vòng bởi vi khuẩn và vi khuẩn lam

- Chuyển hóa PAH đến phenol bởi vi khuẩn nhóm methylotrophic

- Chuyển hóa PAH đến trans-dihydrodiol bởi vi nấm, vi khuẩn, và vi

khuẩn lam

- Chuyển hóa PAH đến quinon bởi nấm mục trắng (white-rot fungi)

Hình 1.3 Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn và nấm

Chuyển hóa PAH đến trans-dihydrodiol bởi vi nấm, vi khuẩn và vi

khuẩn lam Hiện nay người ta đã biết đến các enzyme cytochrome P450 monooxygenase được sinh ra bởi một loài vi nấm, vi khuẩn và vi khuẩn lam

Các enzyme này tham gia chuyển hóa PAH đến dạng aren oxit, sau đó dạng hợp chất trung gian này được hydrat hóa bởi enzyme epoxyt hydrolase đến

dạng trans-dihydrodiols hoặc được tái sắp xếp không có sự tham gia của

enzyme tạo thành dạng phenol Trong trường hợp các vi sinh vật chỉ có thể thực hiện theo cách chuyển hóa này, thì chúng sẽ không sử dụng PAH như nguồn cacbon mà chỉ có thể loại bỏ tính độc của PAH [16], [51]

Chuyển hóa PAH đến quinon bởi nấm trắng (white- rot fungi): Một số nấm trắng phân hủy lignin và cellulo (có trong gỗ) sẽ chuyển hóa PAH đến

quinon và các chất khác mà không qua cis-dihydrodiol hoặc

trans-dihydrodiol, trong một số trường hợp quá trình chuyển hóa này có sự tham gia của lignin peroxydase [16], [51]

Nhiều nghiên cứu cho thấy, trong vi khuẩn, các gen mã hóa các enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa PAH có thể nằm trên plasmid hoặc chromosome [29] Trong hai thập kỷ vừa qua, một nhóm các gen bảo thủ cao

dị hóa PAH (các gen giống nah) từ các loài Pseudomonas đã được điều tra

đầy đủ bao gồm cả quan hệ chức năng-cấu trúc và tiến hóa của các gen này [29] Tuy nhiên, gần đây các gen dị hóa PAH mà có sự khác nhau về tiến hóa

đối với gen giống nah đã được nghiên cứu ở các vi khuẩn Gram âm khác và

cả vi khuẩn Gram dương [29]

Theo Wikstrom (1996), bước đầu tiên của phân hủy sinh học hiếu khí PAH phụ thuộc có sự tham gia của hệ enzyme đa thành phần xúc tác sự

hydroxyl hóa các hợp chất PAH và tạo ra dạng cis-dihydrodiol [56] Một số

tác giả khác cho rằng, các con đường phân hủy hydrocarbon thơm trong điều kiện hiếu khí đều xảy ra qua các bước cắt vòng thơm, loại vòng theo con đường ở phần trên cùng (upper pathway) và tạo thành catechol [56], [46], [44] Tiếp theo, quá trình cắt vòng của catechol bởi enzyme dioxygenase có

thể xảy ra tại các vị trí meta và ortho Cắt vòng catechol ở vị trí ortho được

thực hiện bởi enzym catechol 1,2-dioxygenase để tạo ra cis, cis-muconic acid, chất này sau đó được phân hủy theo con đường β-ketoadipate [34] Cắt vòng tại vị trí meta của catechol được thực hiện bởi enzyme catechol 2,3-

dioxygenase (C23O) tạo ra 2-hydroxymucomic semialdehyde [34], đây được coi là quá trình phổ biến nhất ở các giai đoạn tiếp sau ở con đường phía dưới (lower pathway) của quá trình phân hủy các PAH [56], [45], [44] Enzyme catechol 2,3-dioxygenase là thành viên của liên họ enzyme Extradiol dioxygenase Các enzyme extradiol dioxygenase được xem như là các enzyme chìa khóa trong rất nhiều con đường phân hủy các hợp chất thơm bởi vi khuẩn cũng như các phản ứng được xúc tác bởi các enzyme này [46] Do vị trí quan trọng và trung tâm của catechol nên gen mã hóa cho enzyme catechol 2,3- dioxygenase được quan tâm đặc biệt trong các nghiên cứu đánh giá cũng như phát hiện ra khả năng phân hủy PAH của các chủng vi sinh vật, tập đoàn vi sinh vật tại các điểm ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ [45] Đã có rất nhiều nghiên cứu khai thác các giá trị tiềm tàng ứng dụng và lý thuyết của C23O trong bảo vệ môi trường và trong các lĩnh vực khác Các enzyme extradiol dioxygenase có hoạt tính tốt sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sự gia tăng các hoạt động đồng hóa PAH Tính đến năm 2004 đã có trên 30 enzym C23O và nhiều trình tự nucleotide của các gen mã hóa C23O đã được xác định [34] Hiện nay, các nhà nghiên cứu vẫn đang khai thác các khía cạnh ứng dụng và học thuyết của C23O và gen mã hóa C23O trong các chủng đơn, tập đoàn và trong quá trình phân hủy các chất vòng thơm ở tự nhiên và trong xử lý làm sạch bằng phân hủy sinh học

PAH là các chât gây ô nhiễm quan trọng trong nước ngầm Các PAH có 2 và 3 vòng được quan tâm đặc biệt do khả năng hòa tan cao hơn trong nước và dễ di chuyển vào nước ngầm [43] Hiện nay, có rất ít công bố về chuyển hóa PAH bởi vi khuẩn kỵ khí Mặc dù naphthalene và acenaphthalene

đã được loại bỏ (rất ít) bởi hỗn hợp vi khuẩn khử nitrat, tuy nhiên cơ chế trao đổi chất của quá trình chưa được sáng tỏ Gần đây, Coates và cộng sự đã công bố về khả năng oxy hóa PAH đến CO2 dưới điều kiện khử sulphat của các mẫu tràm tích vịnh San Diego [18] Tuy nhiên quá trình này đòi hỏi nhiều thời gian và tốc độ rất chậm [16]

Phân hủy kỵ khí PAH đã được nghiên cứu với NO3-, ion Fe hoặc SO4

2-như là các chất nhận điện tử và dưới các điều kiện sinh methan Các con đường phân hủy sinh hóa đã được nghiên cứu với các tập đoàn vi khuẩn hoặc chủng sạch phân hủy napthalene và cho thấy, 2-naphthoic acid là chất trao đổi chất trung gian Naphthalene được họat hóa bởi bổ sung đơn vị C1 để tạo ra 2-naphthoic acid, trong khi đó methylnaphthalene được hoạt hóa bởi bổ sung fumarate đối với nhóm methyl và được phân hủy tiếp thành 2-naphthoic acid Phân hủy 2-naphthoic acid được thực hiện qua khử và cắt vòng để tạo ra 5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthoic acid Sản phẩm trung gian cắt vòng như là 2-carboxyclohexylacetic acid cho thấy sự phân hủy diễn ra qua các dẫn xuất cyclohexan chứ không qua các hợp chất thơm Phân hủy kỵ khí PAH cũng đã được chứng minh trong môi trường nước nhiễm bằng xác định các hợp chất trao đổi chất đặc hiệu và nghiên cứu đồng vị phóng xạ Các sản phẩm trao đổi chất đặc hiệu phân hủy kỵ khí PAH như naphthyl-2-methylsuccinate đã được phát hiện chứng tỏ sự phân hủy kỵ khí của 2-methylnaphthalene, trong khi đó 2-naphthoic acid là dấu hiệu của phân hủy kỵ khí naphthalene và 2-methylnaphthalene [43]

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân

Sự phân hủy sinh học PAH phụ thuộc rất nhiều yếu tố Ngoài các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, dinh dưỡng, độ ẩm của đất, nồng độ oxy, nó còn

phụ thuộc vào tính chất vật lý, hóa học của các PAH, sự có mặt đồng thời hay riêng rẽ của các PAH trong môi trường Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào bản thân các vi sinh vật, phương thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua màng tế bào Thường những phân tử tan có thể được vận chuyển qua màng tế bào và có khả năng phân hủy sinh học tốt hơn [16], [51], [31], [42], [61]

Các yếu tố môi trường tại nơi mà vi sinh vật được phân lập ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của chúng Do vậy, trong quá trình xử lý làm sạch môi trường, vấn đề này đóng vai trò quan trọng và quyết định hiệu quả của việc xử lý Quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân bởi các vi sinh vật thường xảy ra với tốc độ chậm, do vậy việc tạo điều kiện thích hợp cho tập đoàn vi sinh vật phát triển tốt nhất, có hiệu quả phân hủy sinh học cao có thể coi là chìa khóa của công nghệ phân hủy sinh học

Theo Yuan và cộng sự (2000), điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các hydrocarbon thơm đa nhân của đối tượng mà tác giả nghiên cứu là 30oC, pH

7 Hai chủng vi khuẩn Alcaligenes eutrophus JMP134 và Pseudomonas cepacia AC1100 phát triển tốt nhất ở 29oC [30] Một số nghiên cứu khác cho

thấy chủng Streptomyces danangensis XKDN19 có khả năng phát triển tốt

nhất ở 32oC, pH 6, nồng độ NaCl 0 - 3% [9]; chủng Streptomyces danangensis XKDN11 ở 30oC, pH 7, nồng độ NaCl 0,5% [1]; chủng nấm sợi FDN20 ở 28oC, pH 6, nồng độ NaCl 3% [3] Các yếu tố khác như nguồn nitơ, photpho, cacbon và các khoáng khác cũng ảnh hưởng đến sự phát triển và phân hủy chất độc của các vi sinh vật

Nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và cộng sự (2002) về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa

nhân của một số chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, Sphingomonas phân

lập từ đất nhiễm dầu cho thấy các chủng này có khả năng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30o

C, pH 7 - 7,8 và nồng độ muối NaCl từ 0% đến 3% [4] Một số

tác giả khác cũng phát hiện điều kiện tối ưu cho phân hủy sinh học PAH ở 30oC và pH 7 [31], [51], [61] Trên đây là những kết quả quan trọng trong việc kích thích tập đoàn vi sinh vật bản địa trong đó có vi khuẩn để tiến tới xử lý vùng đất nhiễm độc hóa học

Trong tự nhiên, thường không tồn tại một loại hydrocarbon thơm đa nhân mà thường tồn tại dưới dạng hỗn hợp Do đó việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp các PAH là điều cần thiết để xem ảnh hưởng qua lại của chúng trong hỗn hợp cũng như nồng độ của chúng Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học, nồng độ của PAH cao sẽ làm giảm quá trình phân hủy sinh học và gây độc cho vi sinh vật Các PAH có trọng lượng phân tử thấp, cấu trúc đơn giản dễ dàng phân hủy hơn so với các PAH có trọng lượng phân tử cao và có cấu trúc phức tạp Theo Yuan, điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các hydrocarbon thơm đa nhân đối với đối tượng tác giả nghiên cứu là tại nhiệt độ 30o

C, pH 7 [52] Tác giả Zaidi cùng các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phân hủy phenanthrene và nhận thấy tại pH từ 6 đến 7 thì không ảnh hưởng mạnh đến khả năng phân hủy, nhưng tại pH 10 thì gây ức chế khả năng phân hủy phenanthrene của vi sinh vật [14],[61]

Bên cạnh các yếu tố quan trọng kể trên phải kể đến các yếu tố dinh dưỡng Đó là nguồn nitơ, phốt pho, các nguồn cacbon có thể bổ sung như cao men, glucoza, axetat, pyruvat.v.v Đây cũng sẽ là những nghiên cứu rất cần thiết phục vụ cho quá trình tạo các yếu tố công nghệ thích hợp trong xử lý tẩy độc [37]

Sự phân hủy sinh học các hydrocarbon thơm đa nhân riêng rẽ trong mẫu thí nghiệm đã không ngừng được nghiên cứu và ngày càng thu được nhiều kết luận có giá trị [16], [42], [58] Các PAH có cấu trúc phân tử đơn giản, trọng lượng phân tử thấp dễ dàng phân hủy sinh học hơn so với các

PAH có trọng lượng phân tử cao và cấu trúc phức tạp [11], [16], [58], [59] Tuy nhiên, chúng ta còn ít hiểu biết về khả năng phân hủy sinh học các PAH khi chúng có mặt đồng thời trong các vùng ô nhiễm Thường trong tự nhiên không chỉ tồn tại một loại PAH mà tồn tại hỗn hợp các PAH Do đó, việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp PAH là điều cần thiết để có thể đánh giá được ảnh hưởng qua lại và tương quan nồng độ của chúng đến sự phân hủy hỗn hợp Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học [58] Yuan cùng cộng sự (2000) tiến hành nghiên cứu khả năng phân hủy đồng thời các PAH trong bùn sông có nhiễm PAH Kết quả cho thấy, tốc độ phân hủy Phenanthrene giảm khi có mặt thêm bất kì một PAH nào trong mẫu Khi 6 PAH có mặt đồng thời, tốc độ phân hủy phenanthrene, acenaphthalene giảm nhưng tốc độ phân hủy Anthracene, Fluorene và Pyrene lại tăng [58]

Ngoài ra, tốc độ phân hủy PAH cũng còn bị ảnh hưởng mạnh bởi các chất hoạt động bề mặt không phân cực như Bij 30, Bij 35, triton X100, triton N110 Các chất này gây độc và ức chế hoạt động của vi sinh vật vì chúng có khả năng tương tác với màng tế bào hay chính xác hơn là các phân tử chất hoạt động bề mặt tương tác với protein màng tế bào [40] Các chất này cũng có thể trực tiếp gây ức chế hoạt động của các enzyme liên quan tới con đường chuyển hóa PAH Có thể chúng còn liên kết với cả các enzyme hay với các cơ chất Một lí do làm giảm khả năng phân hủy sinh học các hợp chất này là chúng hạn chế sự tiếp xúc của tế bào vi sinh vật với các chất hữu cơ hòa tan trên bề mặt [61]

Tóm lại, việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân hủy sinh học các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân là rất quan trọng Có thể coi đây là cơ sở công nghệ cho quá trình xử lý ô nhiễm PAH bằng phương pháp phân

hủy sinh học (bioremediation), đảm bảo các điều kiện thuận lợi làm cho tốc độ phân hủy các hydrocarbon đa nhân có thể đạt tới mức tối đa

1.6 Các phương pháp phân loại vi sinh vật

Vi sinh vật rất đa dạng trong tự nhiên Tuy nhiên, chỉ một phần nhỏ trong số chúng là có thể nuôi cấy được ở trong điều kiện phòng thí nghiệm Do đó, việc phân loại chúng gặp nhiều khó khăn Hiện nay có nhiều phương pháp để phân loại vi sinh vật Các phương pháp cổ điển chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái cấu tạo bên ngoài để phân loại vi sinh vật, còn phương pháp hiện đại lại chú trọng nhiều đến việc nghiên cứu các phân tử axit nucleic như DNA, RNA để áp dụng trong phân loại Từ đó có thể thành lập cây phát sinh chủng loại, phản ánh mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các loài với nhau

1.6.1 Phương pháp phân loại truyền thống

Phương pháp phân loại cổ điển sử dụng hình thái kết hợp những đặc điểm hình dạng bên ngoài và các đặc điểm sinh lý để phân loại Các phương pháp cổ điển thường dùng các chỉ tiêu để phân loại là: màu sắc, kích thước của khuẩn lạc phát triển trên môi trường; các đặc điểm giống nhau về hình dạng, kích thước, có hay không có tiên mao của tế bào vi khuẩn; sự khác nhau về đặc điểm sinh hóa: phản ứng nhuộm Gram, sự kháng chất kháng sinh, sự trao đổi chất và dinh dưỡng, đối tượng vật chủ, phân tích phân tử axit teichoic

Ngoài ra, còn rất nhiều phương pháp phổ biến khác nữa như: kiểm tra các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau, các phản ứng miễn dịch của các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào như kháng nguyên O của lipopolysaccharid hay của bao nhầy thường được sử dụng để phân biệt các chủng của một loài [15]

1.6.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử

Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việc đánh giá mức phân tử axit nucleic Trên cơ sở trình tự DNA, người ta có thể có nhiều các phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại

Từ cuối thế kỷ 20, đặc biệt là những năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta đã sử dụng một phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử” Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao

Jesus và Silvia (1999) đã tóm tắt các phương pháp phân tích và khả

mức độ sử dụng trong phân loại vi sinh vật (Bảng 1.3) [35]

Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật Thành phần tế

bào Phương pháp phân tích Phạm vi phân loại

DNA nhiễm sắc thể

Thành phần bazơ (%G+C) Chi Biến tính DNA :DNA Loài Các phần DNA được cắt bằng

enzyme giới hạn Loài và dưới loài Đa hình chiều dài các đoạn giới

hạn của RNA riboxom

RNA riboxom Trình tự nucleotide Loài, chi và trên chi Lai DNA : rRNA

Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài Thành tế bào

Cấu trúc peptidoglycan

Loài và chi Polysacharid

Axit teichoic

Màng Axít béo Loài và chi Lipid phân cực

Axit mycolic Isoprenoid quinonones

Trước đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (DNA, RNA) Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài Do vậy, cần kết hợp cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác

Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật Trong 3 loại gen rRNA của vi khuẩn (5S, 16S, 23S) thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại Gen mã hóa cho 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết giữa các chủng Ngược lại, gen mã hóa 23S rRNA lại có kích thước lớn (3000) nucleotide do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánh trình tự Chỉ có gen 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không gây khó khăn trong nghiên cứu Do đó, nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vi khuẩn Gen mã hóa cho cấu trúc 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập được rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạn

chúng bằng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [35]