Nghiên cứu phân loại khả năng phân hủy ddt và sinh laccase của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Đào Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI, KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT VÀ SINH LACCASE CỦA CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

Ô NHIỄM HỖN HỢP THUỐC TRỪ SÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2009

Trang 2

Đào Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI, KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT VÀ SINH LACCASE CỦA CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ô NHIỄM HỖN HỢP THUỐC TRỪ SÂU

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà

Thái Nguyên - 2009

Trang 3

sâu sắc đến sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà,

và các anh chị trong nhóm nghiên cứu Công nghệ sinh học xử lý khử độc các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy, phòng Công nghệ Sinh học Môi trường,

đặc biệt là Ths Nguyên Bá Hữu, KS Đàm Thúy Hằng, KS.Nguyễn Nguyên

Quang, KS Nguyễn Quang Huy

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Khoa sau đại học, Khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình dạy dỗ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn này

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2009

Trang 4

2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)

DDE Dichlorodiphenyldichloroethylene DDD Dichlorodiphenyldichloroethane DDT Dichloro - Trichloroethane Diphenyl

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase

Trang 5

1

MỤC LỤC

5.1.2 Khoáng hoá DDT bởi nấm thủy phân lignin 22 5.1.3 Phân hủy DDT bởi vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí 23

5.2 Các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến phân hủy sinh học DDT và

7.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gene mã hóa

Trang 6

2.5 Khảo sát các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng phát triển

2.7 Phân loại nấm sợi dựa vào xác định và so sánh trình tự gen mã hóa

2.7.3 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ và biến nạp vào E.coli 53

2.7.5 Kiểm tra plasmit mang sản phẩm PCR mong muốn 54

2.6.7 Xác định trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA 55

1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC VÀ CUỐNG SINH

4 CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LACCASE CỦA CHỦNG FNA1 64

4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl 64

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ DDT và nồng độ glucose 68

Trang 7

3

4.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitơ và môi trường thay thế 76

6 PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM SỢI FNA1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO

6.3 Tách dòng gen 18S rRNA trong vectơ pTZ57R/T 88 6.4 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1 91

Trang 8

4

MỞ ĐẦU

DDT (Dichloro - Trichloroethane Diphenyl) là một trong những thuốc trừ sâu tổng hợp được biết đến nhiều nhất DDT được tổng hợp đầu tiên vào năm 1874, nhưng thuộc tính thuốc trừ sâu của DDT thì cho đến 1939 mới được khám phá Vào những năm đầu của Chiến tranh Thế giới thứ II, DDT được sử dụng với lượng lớn để kiểm soát muỗi truyền bệnh sốt rét, bệnh sốt phát ban, và các bệnh do côn trùng khác trong cả quân đội lẫn dân cư DDT trở thành loại thuốc trừ sâu phổ biến sử dụng trong nông nghiệp Chúng có mặt ở khắp mọi nơi, trong không khí, đất, nước do một lượng lớn đã được giải phóng ra khi phun trên các cánh đồng và rừng để diệt muỗi và côn trùng

Ngày nay DDT đã bị cấm sử dụng do tính độc của nó như có khả năng gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Để bảo vệ môi trường và sức khỏe con người, cần phải xử lý khử độc DDT trong môi trường đất cũng như trong các môi trường khác DDT ở trong đất có thể giảm đi do sự bay hơi, sự xói mòn đất, sự hấp thu của động vật, thực vật và sự phân hủy sinh học của các vi sinh vật có sẵn trong đất nhưng với thời gian tương đối lâu

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đã có một số phương pháp khử độc khác nhau được nghiên cứu và áp dụng Trong đó phương pháp xử lý sinh học nhờ các vi sinh vật và hệ enzyme do chúng tiết ra là một hướng đi mới có nhiều triển vọng Hệ enzyme sử dụng trong xử lý sinh học chủ yếu là các enzyme ngoại bào, chúng có khả năng phá vỡ các liên kết trong các hợp chất hữu cơ hoặc xúc tác chuyển hóa chúng thành các chất ít độc hơn và các dạng dễ bị phân hủy hơn Nhóm enzyme có vai trò lớn trong quá trình phân hủy DDT cũng như các chất thuộc POPs khác gồm có laccase (Lac), mangan

Trang 9

tên là: “Nghiên cứu phân loại, khả năng phân hủy DDT và sinh laccase

của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu” Nội dung bao gồm:

1 Phân loại và định tên chủng nấm sợi dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự đoạn gene mã hoá 18S rRNA

2 Nghiên cứu khả năng phân hủy DDT của chủng nấm sợi FNA1 3 Nghiên cứu khả năng sinh laccase của chủng nấm sợi FNA1

Trang 10

6

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA DDT 1.1 Cấu trúc của DDT

DDT là một trong các thuốc diệt côn trùng, chúng là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai vòng thơm và có chứa Clo, bao gồm 14 hợp chất hữu cơ, trong đó: 71% là p,p,

- DDT, 14.9% là o,p,- DDT, 0.3%p,p,- DDD, 0.1% là o,p,-DDD, 4% là p,p,- DDE, 0.1% là o,p,-DDE, sản phẩm khác là 3.5% (Hình 1.1)

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của một số đồng phân DDT

1.2 Tính chất lý hóa của DDT

Tất cả các đồng phân của DDT đều là dạng tinh thể màu trắng, không mùi, không vị, có công thức tổng quát là C14H9Cl5, khối lượng phân tử là 354.5 Nhiệt độ nóng chảy khoảng 108.5 - 1090C, áp suất bay hơi là 2.53 x10-5

Pa (1.9 x10 -7mmHg) tại 200C DDT tan ít trong nước (1g/l) nhưng có khả năng giữ nước, tan tốt trong các hợp chất hữu cơ đặc biệt là mỡ động vật Khả

Trang 11

7

năng hoà tan của DDT trong nước là thấp (hệ số hấp phụ cao) nên DDT có xu hướng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá, trầm tích Điều này có vai trò đặc biệt trong phân hủy sinh học DDT Một số đặc tính cơ bản của DDT và các đồng phân được trình bày ở phụ lục 1 [59]

2 ẢNH HƯỚNG ĐẾN MÔI TRƯỜNG VÀ SỨC KHỎE CON NGƯỜI CỦA DDT

2.1 Ảnh hưởng đến môi trường

DDT [ 1,1,1-trichloro-2,2-bis-(p-chlorophenyl)ethane] đã được tổng hợp vào năm 1874, nhưng mãi đến 1930, Bác sĩ Paul Muller (Thụy Sĩ ) mới xác nhận DDT là một hóa chất hữu hiệu trong việc trừ sâu rầy và từ đó được xem như là một thần dược và không biết có ảnh hưởng nguy hại đến con người Khám phá trên mang lại cho ông giải Nobel về y khoa năm 1948 và DDT đã được sử dụng rộng rãi khắp thế giới cho việc khử trùng và kiểm soát mầm mống gây bệnh sốt rét Nhưng chỉ hai thập niên sau đó, một số chuyên gia thế giới đã khám phá ra tác hại của DDT trên môi trường và sức khỏe người dân Do đó, tại Hoa Kỳ từ năm 1972 DDT đã bị cấm sử dụng hẳn DDT bị nhiễm vào môi trường không khí, nước, đất trong suốt quá trình sử dụng, DDT có mặt ở nhiều vị trí ô nhiễm khác nhau, sau đó có thể tiếp tục bị lan truyền và gây ô nhiễm môi trường Đặc biệt trong đất, nó giữ nước thành các phần tử rắn và trở thành dạng bền vững (EPA 1986) và được EPA Hoa Kỳ xếp vào danh sách các loại hóa chất phải kiểm soát vì có nguy cơ tạo ra ung thư cho người và động vật [59] DDT, DDE (1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlrophenyl)ethylene), DDD (1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlrophenyl)ethylene) cũng có thể được thải vào không khí khi chúng bay hơi từ đất và nước nhiễm độc Một lượng lớn DDT đã được thải vào môi trường như đi vào không khí,

Trang 12

8

đất và nước thông qua quá trình tưới, phun trên các diện tích sản xuất nông nghiệp và rừng để diệt côn trùng và muỗi [59].DDT và các đồng phân bị ngấm vào mạch nước ngầm khi nó được sử dụng để diệt côn trùng ở gần các cửa sông v.v Trong đất, DDT có thể suy giảm nhờ quá trình bốc hơi, quá trình quang phân và quá trình phân hủy sinh học (hiếu khí và kị khí) nhưng những quá trình này xảy ra rất chậm tạo ra sản phẩm là DDD và DDE có độ bền tương tự như DDT DDD cũng được sử dụng như là một loại thuốc trừ sâu, còn DDE chỉ được tìm thấy trong môi trường nhiễm bẩn do sự phân hủy sinh học của DDT

Quá trình bốc hơi, phân hủy DDT, DDD, DDE có thể được lặp lại nhiều lần và kết quả là DDT, DDD, DDE được tìm thấy ở cả những nơi rất xa Những hợp chất hóa học này có thể được phát hiện ở đầm lầy, tuyết và động vật ở vùng Bắc Cực & Nam Cực, rất xa so với nơi chúng được sử dụng, DDT, DDD, DDE cuối cùng ở trong đất một thời gian dài, hầu hết bị phân hủy chậm thành DDD và DDE thường là bởi hoạt động của các vi sinh vật Chu kỳ bán hủy của những hợp chất này trong khí quyển khi bay hơi được ước tính 1,5- 3 ngày DDT ở trong đất phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ, loại đất, độ ẩm v.v ở những vùng nhiệt đới DDT bay hơi dễ hơn và vi sinh vật cũng phân hủy nó nhanh hơn DDT ở đất ẩm bị phân hủy nhanh hơn ở đất khô Chúng làm giảm giá trị của đất và khi bị phân hủy DDT được chuyển thành DDE trong cả điều kiện hiếu khí và kị khí Những hợp chất này có thể bốc hơi trong không khí hoặc lắng đọng lại ở các vị trí khác nhau và có độc tính rất cao Chúng ở sâu trong đất, thấm qua đất và vào các mạch nước ngầm Trên bề mặt nước, DDT sẽ liên kết các phần tử ở trong nước, lắng xuống và có thể lắng đọng trong các trầm tích

Trang 13

9

Gần đây DDT là một trong 12 hoá chất được các nhà khoa học thế giới xếp vào hạng chất ô nhiễm khó phân hủy (POPs) Năm 1998, đại diện của hơn 92 quốc gia trên thế giới đã tụ họp tại Montreal đã bàn thảo về các biện pháp nhằm cấm sản xuất và sử dụng các hoá chất trên vì lý do tác hại của chúng do sự tích luỹ lâu dài trong không khí, lòng đất và nguồn nước, kết tụ vào các mô động vật- nguồn thực phẩm chính của loài người [7] DDT tích trữ một lượng lớn ở trong cá và các động vật biển (ví dụ: hải cẩu, cá heo) Tính độc của DDT đã được biết đến thông qua các nghiên cứu rất kỹ lưỡng ở trên các vi sinh vật, động vật không xương sống ở dưới nước, cá, lưỡng cư, động vật không xương sống ở trên cạn và các loài động vật có vú khác (chuột hang, thỏ v.v.) Trong các động vật này, DDT được tìm thấy một lượng lớn trong các mô mỡ và sẽ tiếp tục di chuyển đến những cơ quan khác Ngưỡng độc của DDT và các đồng phân của nó đã xác định thông qua chỉ số LC50 (LC50 là liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm) ở một số loài động vật thí nghiêm là: LD50 ở lợn khoảng 1.000mg DDT/kg [12], LD50 ở thỏ là 300mg DDT/kg và 4.000-5.000 mg DDD/kg [12] DDT ở trong đất cũng có thể được hấp thụ bởi một số thực vật hoặc trong cơ thể con người khi ăn các thực vật đó [57]

2.2 Ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Những nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra được tác hại của DDT và các hợp chất có liên quan tới một số loài và việc sử dụng nó đã bị cấm hoặc giảm trên nhiều nước do những hậu quả độc hại của nó Nhưng các số liệu về ảnh hưởng trên con người vẫn chưa được biết đến nhiều Các nghiên cứu về sự ảnh hưởng trên người được nghiên cứu trên các công nhân làm việc trong các nhà máy có sản xuất DDT Các nghiên cứu khác cũng cho những kết quả có

Trang 14

Nguồn lây nhiễm DDT chính là ở trong thịt, cá, gia cầm và các sản phẩm từ sữa Nếu người ăn các loại lương thực thực phẩm được phun DDT và ăn kéo dài thì có nhiều nguy cơ dẫn tới ngộ độc mãn tính, sinh con quái thai Mức độ tối thiểu mà con người có thể chịu đựng và không gây hại là 285 mg/kg DDT có tác động rõ rệt lên hệ thống thần kinh ngoại biên, gây nên sự rối loạn hệ thống thần kinh, ức chế các enzyme chức năng đòi hỏi sự dịch chuyển các ion dẫn đến tê liệt Những người bị nhiễm một lượng lớn gây ngộ độc cấp tính, dễ bị kích động, bị rùng mình và gây tai biến mạch máu não Chúng cũng gây nên sự đổ mồ hôi, đau đầu, buồn nôn, chóng mặt Những ảnh hưởng như trên cũng có thể xuất hiện khi hít DDT ở trong không khí hoặc hấp thụ một lượng lớn qua da [59]

Đối với những người bị nhiễm DDT ở mức độ thấp (20 mg/ngày) - ví dụ như những người làm việc trong các nhà máy sản xuất DDT, sẽ xuất hiện những biến đổi nồng độ enzyme có trong gan và trong máu Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng DDT, DDE, DDD có thể gây bệnh ung thư, mà trước tiên là ung thư gan, cũng có thể là ung thư vú, ung thư tuỷ [59] Những nghiên cứu của Garabrant và cộng sự 1992 ở một nhóm công nhân của các nhà máy sản xuất thuốc hóa học giữa năm 1948 đến năm 1971 đã phát hiện ra DDT có thể

Trang 15

11

gây ung thư tủy và dẫn đến tử vong vào năm 1953- 1988 [59] Bên cạnh đó nó cũng gây nên một số bệnh ung thư khác nhưng vẫn chưa được nghiên cứu kỹ như: ung thư tuyến tiền liệt, ung thư tinh hoàn, ung thư máu, ung thư dạ con v.v

Trẻ con bú sữa mẹ hay sữa tươi bị nhiễm độc DDT trực tiếp qua sự hiện diện của DDT trong sữa tươi hay gián tiếp vì thức ăn của người mẹ Tệ hại hơn nữa, nhiều bà mẹ đã bị sảy thai trong vùng ảnh hưởng của DDT Ở nước ta, đã có một số công trình nghiên cứu và rút ra nhận xét là tất cả các bà mẹ dù có tiếp xúc hay không tiếp xúc trực tiếp với DDT đều có lượng DDT trong sữa mẹ rất cao Vì DDT xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường tiêu hóa, cao hơn rất nhiều lần so với liều lượng cho phép của OMS (0.05ppm), của Liên Xô (0.14ppm) và của Hungari (0.13ppm) [53]

3 TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM DDT 3.1 Nguồn gốc phát sinh

DDT (1,1,1-trichloro-2,2-bis (p-chlorophenyl) ethane) đã được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1873 bởi nhà khoa học người Đức Othmar Ziedler Tuy nhiên, phải đến 1939 nhà hoá học Thuỵ Sỹ- Paul Hermann Muller mới khám phá các đặc tính để diệt trừ côn trùng của DDT, chúng có thể phá huỷ nhanh chóng hệ thần kinh của côn trùng Năm 1948, Paul Muller đã được trao giải thưởng Nobel về sinh - y học về khám phá này DDT có hiệu quả chống lại rận, bọ chét, và muỗi mang các mầm bệnh sốt phát ban, dịch hạch, sốt rét, và sốt vàng v.v DDT đã được dùng rất rộng rãi hơn 20 năm và được xem là nhân tố chính trong việc gia tăng sản lượng lương thực thế giới và ngăn chặn bệnh tật từ côn trùng

Trang 16

12

DDT được tạo thành từ phản ứng của trichloroethanol với chlorobenzen (Hình 1.2) Tên thương mại hoặc các tên khác của DDT bao gồm Anofex,

dichlorodiphenyltrichloroethane, Dinocide, Didimac, Digmar, ENT 1506, Genitox, Guesapon, Guesarol, Gexarex, Gyrol, Hildit, Ixodex, Kopsol, Neocid, OMS 16, Micro DDT 75, Pentachlorin, Rukseam, R50 và Zerdane

Hình 1.2 Tổng hợp DDT từ trichloroethanol và chlorobenzen

DDT là loại thuốc hóa học diệt côn trùng được sử dụng rộng rãi từ chiến tranh thế giới lần thứ II trên khắp thế giới và hàng triệu tấn được sản xuất, sử dụng trước đây hiện đang còn lưu giữ trong đất và sẽ tiếp tục phân tán trong môi trường Một lượng lớn DDT đã được giải phóng vào không khí, đất và nước khi sử dụng để diệt côn trùng, muỗi ở các địa điểm nhạy cảm như cửa sông [59]

Đầu năm 1960, nhà hoạt động người Mỹ Rachel Carson đã xuất bản cuốn sách Silent Spring khẳng định DDT là nguyên nhân của bệnh ung thư và nguy hại đến sinh sản của chim do làm mỏng lớp vỏ trứng Cuốn sách đã gây ra sự phản đối kịch liệt của công chúng và sự kiện này đã dẫn đến lệnh cấm sử dụng DDT trong nông nghiệp ở Mỹ Tiếp theo trong những năm 1970 và 1980, DDT đã bị cấm sử dụng trong nông nghiệp ở hầu hết các nước phát triển do ảnh hưởng nguy hại của nó đối với môi trường Mặc dầu vậy, DDT vẫn được sử dụng rộng rãi trong một số quốc gia đang phát triển

Trang 17

13

3.2 Tình trạng ô nhiễm DDT trên thế giới

Do tác hại của DDT trên môi trường và sức khỏe người dân tại Hoa Kỳ từ năm 1972 DDT đã bị cấm sử dụng hẳn Tuy nhiên, đến nay hóa chất này vẫn còn gây tác hại ở những vùng nông nghiệp đã sử dụng và những vùng quanh nơi sản xuất ra DDT trước đây Hiện tại DDT vẫn còn ngưng tụ nơi thềm lục địa vùng Palos Verdas (ngoài khơi vùng biển Los Angeles) vì nhà máy sản xuất ra DDT Montrose Chemical.co tại Torrance đã thải DDT vào hệ thống cống rãnh thành phố vào năm 1971 Việc xử lý ô nhiễm DDT cho vùng này ước tính vào khoảng 300 triệu USD [7]

Cho đến nay ở Mỹ do lợi ích về kinh tế nên vẫn sản xuất DDT để xuất cảng qua Phi châu và các nước Á châu trong đó có Việt Nam DDT là một loại thuốc sát trùng công hiệu mạnh, đặc biệt quan trọng trong việc kiểm soát bệnh sốt rét nên vẫn được sử dụng rộng rãi ở các nước đang phát triển bất chấp nguy cơ gây hại tiềm tàng và lâu dài của nó.

Sự tích tụ nhiều nhất của DDT và các hợp chất có liên quan ở biển phía Tây của Trung Quốc ở các bờ biển khác, lượng tích tụ của DDT cũng rất lớn như: vịnh Bengal, biển Arabian, biển bắc Trung Quốc v.v.Từ năm 1980-1983, có rất nhiều phân tích về sự tích tụ DDT ở trong các trầm tích biển ở EPA [54] Hàm lượng trung bình của DDT, DDE, DDD là: 0.1, 0.1, 0.2 g/kg (trọng lượng khô) Hàm lượng DDT và các sản phẩm chuyển hóa của các mẫu trầm tích được phân tích ở đáy sông ở vịnh River tại Washington: 0.1-234 g/kg Sự tích trữ của DDT, DDE, DDD và tổng lượng DDT ở đáy trầm tích từ sông San Joaquen và các nhánh sông của nó ở California-1992 lần lượt là:1.4 - 115, 0.7 - 14, 0.4 - 39, 2.2 - 170 (ng/l) [45] Trong đó Orestinba Creat có hàm lượng DDT cao hơn hẳn so với các vị trí khác Ở Canada, tổng lượng DDT lắng đọng trên bề mặt trầm tích ở 8 hồ khác dọc ngang lục địa vào

Trang 18

14

khoảng 9.7g/kg Iwata et al (1993) đã thu thập và phân tích 68 ví dụ về hàm lượng DDT ở nước bề mặt từ một vài đại dương (18 khu vực) đã nêu lên những ảnh hưởng chủ yếu do sự lắng đọng khí quyển từ tháng 4/1989-8/1990 Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của DDT trong các mẫu trầm tích với nồng độ cao do DDT được vận chuyển từ khu vực bị ô nhiễm đến Bắc cực và Nam cực Tổng lượng DDT ở đại dương New Zealand và Ross Iland, Antarctica giữa tháng 1 và tháng 3 (1990) là: 0.40 và 0.81 pg/m3 [14, 33] Vùng Gulf của Mexico (1977) chứa trung bình 34pg/m3 DDT với tỉ lệ 10-78pg/m3

[13] Lượng DDT cao nhất được tìm thấy ở gần khu vực nơi mà DDT vẫn được sử dụng, ví dụ ở bờ biển Arabian của ấn Độ Các khu vực mà lượng DDT trong không khí cao là eo biển Malacca, bờ biển phía nam Trung Quốc, vịnh Mexico

3.3 Tình trạng ô nhiễm DDT ở Việt Nam

DDT được dùng lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1949 để phòng ngừa bệnh sốt rét Tuy nhiên, số lượng thuốc DDT được dùng chỉ có 315 tấn trong năm 1961 và giảm xuống còn 22 tấn trong năm 1974 Từ năm 1957 đến 1990, tổng số lượng thuốc DDT nhập cảng chỉ có 240.422 tấn Mặc dù việc sử dụng thuốc DDT đã bị cộng đồng quốc tế ngăn cấm từ năm 1992, việc nhập cảng và sử dụng DDT ở Việt Nam vẫn tiếp tục cho đến năm 1994 Trong khoảng từ năm 1992 đến năm 1994, số lượng thuốc DDT nhập cảng từ Nga lên đến 423.358 tấn Tuy không có số liệu chính xác về số lượng DDT đang được sử dụng ở Việt Nam, nhưng tin tức trong nước cho biết thuốc này vẫn còn đang được sử dụng rộng rãi đặc biệt ở vùng châu thổ sông Cửu Long vì là vùng có nhiều sông rạch và nhiều muỗi mồng [8]

Trang 19

15

Tại một kho dã chiến chứa DDT những năm 1967 – 1968 ở Hà Tĩnh vẫn còn một lượng tồn dư lớn hóa chất này Khối lượng thuốc DDT ở kho này ước tính khoảng 4- 5 tấn Hiện nay số thuốc DDT đã nằm phơi lộ trên mặt đất, một phần thuốc có thể bị phân hủy song phần lớn vẫn còn đó, chúng có thể khuếch tán vào không khí gây ô nhiễm môi trường và phân rã ngấm vào đất và các mạch nước ngầm gây ô nhiễm đất và nước trong khu vực Nghệ An là một trong những tỉnh còn tồn lưu một lượng tương đối lớn hóa chất bảo vệ thực vật, hiện tại tỉnh có 25 điểm tồn lưu hóa chất chất bảo vệ thực, trong đó mới có 5 điểm được xử lý Phần lớn những điểm tồn lưu hóa chất chất bảo vệ thực đều nằm gần, hoặc nguy hiểm hơn là nằm lọt trong khu dân cư Một kết quả điều tra khác ở tỉnh Nghệ An cho thấy, DDT vẫn còn trong một nhà kho từ năm 1965 đến năm 1985 Nồng độ của DDT thay đổi từ 3.38 đến 960.6 mg/kg trong các mẫu đất và từ 0.00012 đến 0.00168 mg/l trong các mẫu nước Trong nhiều năm liên tiếp, mùi thuốc DDT nồng nặc bay xa đến 600 mét Đã có 25 người chết vì ung thư, và 22 trường hợp dị thai được ghi nhận [8]

Do sự nguy hiểm của các chất POP nói chung và hóa chất bảo vệ thực vật nói riêng đối với sức khỏe con người và môi trường, các nước trên thế giới cũng như Việt Nam đã và đang tích cực tiến tới loại trừ và cấm sử dụng hoàn toàn các chất POP Cụ thể là Công ước Stockholm về các chất hữu cơ ô nhiễm khó phân hủy ra đời và 172 quốc gia đã tham gia ký kết, trong đó có Việt Nam Ở nước ta công ước Stockholm chính thức có hiệu lực kể từ ngày 14/5/2004 Tham gia công ước này, Việt Nam sẽ xây dựng và hoàn thiện hệ thống pháp luật để quản lý an toàn hóa chất, giảm thiểu và tiến tới loại bỏ các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân huỷ Đồng thời, phòng ngừa, kiểm soát và xử lý an toàn đối với các chất này, tiến tới kiểm soát, xử lý và tiêu hủy hoàn toàn

Trang 20

Tùy điều kiện địa hình, tính chất, quy mô của vùng ô nhiễm; tùy điều kiện kinh phí để áp dụng các quy trình xử lý khác nhau, có thể xử dụng các phương pháp như phương pháp hóa lý; phương pháp bao vây, cô lập nguồn ô nhiễm; hay phương pháp sinh học v.v

4.1 Các phương pháp cơ, hóa lý

Có rất nhiều phương pháp hóa lý được sử dụng để loại bỏ các chất ô nhiễm khó phân hủy Đối với ô nhiễm DDT thì các phương pháp thường được sử dụng là chôn lấp, cô lập; phân hủy bằng kiềm nóng và phương pháp đốt có xúc tác

Trang 21

17

4.1.1 Phương pháp chôn lấp, cô lập

Với cấu trúc vòng thơm, DDT rất khó phân hủy trong tự nhiên nên biện pháp chôn lấp chất thải nguy hại được áp dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới Một số nước sử dụng biện pháp chôn lấp cô lập và xi măng hóa chất thải có độc tính cao ở dạng lỏng hoặc rắn Phương pháp này đòi hỏi phải chuẩn bị hố chôn lấp đảm bảo kỹ thuật, không bị rò rỉ, bền vững trong thời gian dài, địa điểm chôn lấp phải xa khu dân cư, không gần mạch nước ngầm

4.1.2 Phương pháp đốt có xúc tác

Đây là phương pháp vô cơ hoá chuyển clo hữu cơ thành CO2, H2O và Cl- Clo hữu cơ nếu tiếp xúc với kim loại đồng nung đỏ đều bị đồng lấy mất clo (tạo thành CuCl2) và chúng bị phân huỷ tiếp theo thành CO2 và nước cùng với các dẫn xuất khác không độc, hoặc ít độc hơn (Hình 1.3)

DDT CO2 + H2O + CuCl2

Hình 1.3 Phương pháp đốt có xúc tác

Công nghệ thiêu đốt cũng đã được sử dụng trên thế giới, phương pháp xử lý này tương đối triệt để song giá thành lại cao và có khả năng gây ô nhiễm thứ cấp bởi các sản phẩm phụ tạo trong quá trình vận hành

Các phương pháp vật lý khác như sử dụng tia bức xạ, tia cực tím, hay áp suất cao cũng mang lại hiệu quả nhất định trong xử lý ô nhiêm DDT

4.1.3 Phương pháp phân hủy bằng kiềm nóng

Cu / 600-7000C

O2 (không khí)

Trang 22

18

Khi xử lý DDT với dung dịch NaOH 20% nóng, xảy ra phản ứng

dehydroclorua hoá tạo nên một olefin Olefin được sinh ra bị polime hoá cho sản phẩm rắn Sản phẩm rắn này được tách ra dễ dàng và cho vào bao nilon

rồi chôn vùi dưới đất

Mặc dù làm sạch DDT có thể được tiến hành bằng nhiều biện pháp như đã nêu ở trên, nhưng nhược điểm của các công nghệ đốt và hóa học là gây ô nhiễm thứ cấp Chính vì vậy mà xu hướng sử dụng các phương pháp hóa lý ngày càng giảm

4.2 Phương pháp phân hủy sinh học

Ngày nay do có những hiểu biết sâu sắc về tác hại của DDT nên các nhà khoa học và công nghệ Việt Nam đang nghiên cứu tìm ra các giải pháp để có thể làm giảm lượng DDT còn sót lại trong đó biện pháp xử lý sinh học đang được quan tâm nhiều bởi tính ưu việt của nó là không tạo ra ô nhiễm thứ cấp cho môi trường Phân hủy sinh học đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đạt được khá nhiều thành tựu [63]

Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác nhau, có thể sử dụng thực vật hay vi sinh vật và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị khí Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể được tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác, sau vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể được hoàn toàn loại bỏ.

Phân hủy sinh học (Bioremediation) thường bao gồm các phương pháp sau: Kích thích sinh học (augmentation) và làm giàu sinh học (stimulation).

+ Kích thích sinh học (Biostimulation): là quá trình thúc đẩy sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng

Trang 23

+ Sử dụng thực vật (phytoremediation): sử dụng thực vật, hệ enzyme của thực vật và các quá trình phức tạp khác nhằm hấp thu hoặc chuyển hóa các chất ô nhiễm

Kích thích sinh học hiện là khuynh hướng được sử dụng rộng rãi trong xử lý ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học Đôi khi người ta cũng kết hợp hai biện pháp để có thể tăng cường sự phân hủy sinh học Song song với việc bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có khả năng phân hủy chất ô nhiễm, người ta cũng tạo điều kiện tối ưu cho tập đoàn vi sinh vật hoạt động Như vậy, cùng với hoạt động của tập đoàn vi sinh vật bản địa và hoạt động của vi sinh vật ngoại lai sẽ tăng cường hiệu quả của quá trình xử lý

Hiện nay, tại Viện Công nghệ Sinh học đã tiến hành một số nghiên cứu về khả năng phân hủy dầu, các chất độc hại khác như dioxin, 2,4-D, hydrocacbon thơm đa nhân (PAH) v.v bằng công nghệ phân hủy sinh học và đã mang lại những hiệu quả khả quan [2] Đối với DDT, những nghiên cứu bước đầu về khả năng phân hủy bằng vi sinh vật cũng đang bắt đầu được nghiên cứu để góp phần khử độc DDT ở một số địa phương bị ô nhiễm [5]

Ngoài ra trên thế giới việc ứng dụng hệ enzyme ngoại bào của vi sinh vật vào xử lý ô nhiêm đã có nhiều nghiên cứu, đây cũng là hướng có nhiều triển vọng do rút ngắn được thời gian xử lý và hiệu quả xử lý cao hơn so với khử độc bằng phân hủy sinh học thông thường Những nghiên cứu bước đầu

Trang 24

20

về hệ enzyme ngoại bào ứng dụng vào xử lý khử độc đã được tiến hành tạo cơ sở cho việc thiết kế công nghệ xử lý các chất ô nhiễm hóa học trong tương lai [4,5,6] Hệ enzyme ngoại bào được quan tâm là hệ enzyme xúc tác với các đại diện là laccase (oxidoreductase), mangan peroxidase và lignin peroxidase (peroxidase) Đây là những enzyme có khả năng phân hủy nhiều loại chất ô nhiễm hữu cơ có cấu trúc đa vòng thơm khác nhau do tính đặc hiệu cơ chất không cao Trong đó laccase được tập trung nghiên cứu, enzyme này xúc tác quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic mạnh nhất trong nhóm enzyme phân hủy lignocellucose, laccase được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ tẩy độc các hợp chất phenol, các dẫn xuất clo biphenyl, các loại thuốc nhuộm và các loại nước thải v.v.

5 PHÂN HỦY SINH HỌC DDT

5.1 Khả năng phân hủy DDT bởi vi sinh vật

Các nhà khoa học cũng đã phân lập và nghiên cứu nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy DDT và các sản phẩm chuyển hóa của nó Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng số lượng các vi sinh vật có khả năng phân hủy DDT tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn so với các vùng không ô nhiễm Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu hướng thích nghi, sau đó thay đổi cấu trúc về di truyền để hướng đến việc phân hủy DDT Các vi sinh vật tiềm năng tham gia vào quá trình phân huỷ sinh học DDT chủ yếu là vi khuẩn, vi nấm Các vi sinh vật này chuyển hoá DDT thông qua quá trình khử loại clo, vi nấm thủy phân và vi khuẩn phân huỷ chlorobiphenyl thực hiện cắt vòng DDT trong điều kiện hiếu khí Ngoài ra vi sinh vật phân huỷ DDT có thể được thiết kế chuyển gene dựa trên các kỹ thuật di truyền phân tử và đưa vào vùng đất nhiễm Hiện nay, có tới hơn 300 loài vi sinh vật có khả năng phân hủy DDT

Trang 25

-DDT, p,p,-DDT) thành dạng bớt độc hơn, không độc hoặc chuyển hóa hoàn toàn thành CO2 Các cơ chế tấn công DDT bởi vi sinh vật đã được công bố cho thấy DDT được loại clo bởi quá trình khử dẫn đến DDD Vi khuẩn và nấm sợi phân huỷ DDT chủ yếu theo cơ chế này Một con đường khác phân huỷ sinh học ở điều kiện hiếu khí đã được mô tả có sự tham gia của vi khuẩn phân huỷ chlorobiphenyl [15, 42]

5.1.1 Loại clo bởi quá trình khử

Dưới các điều kiện khử, quá trình loại clo bởi quá trình khử là cơ chế chủ yếu của quá trình chuyển hoá sinh học các đồng phân o,p´-DDT và p,p´- DDT của DDT thành DDD (Fries 1969) Phản ứng diễn ra bởi sự thay thế chlorin mạch thẳng bằng nguyên tử hydro Một số vi sinh vật chuyển hoá

DDT thành DDD đã được công bố bao gồm Escheria coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Bacillus sp., “Hydrogenomonas” và một số nấm như Saccharomyces cerevisiae, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma [29,48] Rochkind-Dubinsky và cộng sự đã phát triển các điều

kiện khử loại trong các bình nuôi cấy Các cơ chế khử loại clo với sự chuyển tiếp các kim loại và phức kim loại đóng vai trò chất khử (Hollinger & Schraa 1994) Trong hầu hết các trường hợp các quá trình có sự tham gia của vận chuyển điện tử đơn, loại ion clo, và tạo gốc alkyl Sự chuyển tiếp phức hệ kim loại trong vi sinh vật có kết hợp với các trung tâm hoạt động của các phân tử

Trang 26

22

vận chuyển điện tử Ở E coli, khử loại clo của DDT cần FAD và các điều kiện kỵ khí, trong khi đó ở E aerogenes là cytochrom oxidaza [29]

 Con đường chuyển hoá DDT bởi vi khuẩn theo cơ chế loại khử clo

Trước tiên DDT bị phân hủy tạo DDMS, quá trình phân hủy tiếp theo sẽ là quá trình loại Cl tạo DDNU,sau đó sẽ là quá trình oxy hoá tạo DDOH, DDOH bị oxy hoá tiếp thành DDA và loại carbon thành DDM, DDM có thể được chuyển hoá tạo DBP hoặc tách một vòng thơm tạo p-chlorophenylaxetic acid (PCPA) Trong điều kiện kị khí DBP không thể chuyển hóa xa hơn nữa (Hình 1.4) [29]

Hình 1.4 Con đường chuyển hoá DDT bởi vi khuẩn trong điều kiện kị khí theo cơ chế loại khử clo

5.1.2 Khoáng hoá DDT bởi nấm thủy phân lignin

Nấm thủy phân lignin có khả năng phân huỷ nhiều loại chất hữu cơ bền vững trong môi trường tự nhiên trong đó có DDT Aust 1990 chỉ ra rằng

Trang 27

23

khoáng hoá DDT xảy ra đồng thời với quá trình sinh ligninaza Khi DDT được bổ sung vào giống nấm thủy phân lignin quá trình khoáng hoá bắt đầu ngay lập tức nhưng nếu thí nghiệm bắt đầu từ giống là bào tử thì sự phân huỷ và hoạt tính thủy phân lignin xảy ra đồng thời sau 4 ngày

 Con đường phân hủy DDT bởi loài nấm trắng Phanerochaete chrysosporium

Sự phân hủy DDT bởi nấm đảm trắng P chrysosporium được biết đến trong công trình nghiên cứu của Aust và cộng sự [15] Bumpus và Aust đã

miêu tả sự phân hủy của DDT sau 30 ngày nuôi cấy (trong điều kiện thiếu N), có khoảng 50% DDT đã đựơc chuyển hoá, trong đó 10% được khoáng hoá, phần còn lại được chuyển hoá thành dicofol, FW-152 và bị phân hủy tạo DBP Tiếp đó là phản ứng phá vòng tạo CO2 Quá trình này được điều khiển bởi hệ enzyme ligninase Dicofol được tạo thành sau pha lag, DDD được tạo thành sau pha suy tàn trên đó sẽ bị phân hủy bởi hệ enzyme ligninase khác Trong trường hợp này DDE không được phát hiện Trong quá trình khoáng hoá DDT thì tinh bột và cenlulose là nguồn C tốt hơn so với nguồn C khác (muối cacbornate) kể cả đường (Hình 1.5)

5.1.3 Phân hủy DDT bởi vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí

Kỹ thuật làm giàu vi sinh vật đã được sử dụng trong đó một hợp chất có cấu trúc tương tự đã được dùng thay thế DDT Một số chủng vi khuẩn đã thể hiện khả năng phân huỷ DDT theo các cơ chế mới Chủng B-206 sinh ra các chất trung gian phenol từ DDT, DDD, và DDE, tuy nhiên không có sản phẩm

cắt vòng nào được tạo ra [42] Nadeau 1994 thông báo về chủng Alcaligenes eutrophus A5 chuyển hoá các đồng phân o,p´-và p,p´-DDT Aiskable 1997 đãphân lập được vi khuẩn Gram dương từ đất nhiễm DDT ở New Zealand theo

Trang 28

24

phương pháp làm giàu trên môi trường khoáng chứa biphenyl, DDT, DDD và DDE như là nguồn cacbon [42].

Hình 1.5 Con đường phân hủy DDT bởi loài nấm trắng P chrysosporium

Một trong các con đường phân hủy DDT được nghiên cứu khá kỹ trên

đối tượng vi khuẩn Alcaligenes eutrophus A5, dưới đây là cơ chế phân hủy thực hiện bởi vi khuẩn này

Trang 29

25

 Con đường phân hủy DDT bởi vi khuẩn Alcaligenes eutrophus A5

Chủng Alcaligenes eutrophus A5 có khả năng chuyển hoá cả o,p,- và p,p,-DDT DDT bị oxy hoá bởi enzym dioxygenase tạo ra một dẫn xuất

dihydrodiol- DDT và trải qua qúa trình phá vỡ vòng ở vị trí meta Tiếp đó là

một loạt các phản ứng trung gian tạo sản phẩm cuối cùng là 4- chlorobenzoic acid (Hình 1.6)

Hình 1.6 Con đường phân hủy DDT bởi Alcaligenes eutrophus A5

Sản phẩm cắt vòng màu vàng

Trang 30

Trong tự nhiên không chỉ tồn tại một loại chất ô nhiễm thuộc hydrocacbon thơm đa nhân mà thường chúng tồn tại dưới dạng hỗn hợp Do đó việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp DDT là điều cần thiết để xem ảnh hưởng qua lại của chúng trong hỗn hợp cũng như nồng độ hỗn hợp của các chất ô nhiễm Sự tồn tại của DDT có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học hoặc gây độc cho vi sinh vật

Các yếu tố quan trọng khác là nguồn dinh dưỡng bao gồm C, N, P có sẵn trong môi trường hay bổ sung thêm Việc bổ sung các chất thêm như nguồn cacbon cũng tạo điều kiện tăng khả năng phân hủy sinh học của các chủng vi sinh vật phân hủy chất độc theo cơ chế đồng trao đổi chất, một số

Trang 31

27

chất thường được bổ sung nhằm kích thích thêm quá trình phân hủy chất độc có thể kể đến glucose, acetate, pyruvate Các muối N đóng một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình xử lý bằng phương pháp phân hủy sinh học, việc bổ sung nguồn muối này đã làm tăng tốc độ phân hủy DDT Nguồn N có thể thêm vào cả dạng vô cơ và hữu cơ [23] Phốtpho cũng là một nguồn dinh dưỡng cần thiết để tăng cường quá trình phân hủy sinh học các chất ô nhiễm Nó được sử dụng để tăng sinh khối tế bào, thường bổ sung muối gốc PO43- Nitơ và Phốtpho thường bổ sung dưới dạng muối (NH4)2HPO4 Hơn nữa, phốtpho như là một chất đệm pH để tạo pH thích hợp cho hoạt động của vi sinh vật nhằm tăng hoạt tính sinh học của chúng, do vậy làm tăng khả năng sống sót của vi sinh vật trong các môi trường có điều kiện khác nhau.

Ngoài ra tốc độ phân hủy các hợp chất hydrocacbon thơm đa nhân còn bị ảnh hưởng mạnh bởi các chất hoạt động bề mặt Chất hoạt động là một sản phẩm rất có giá trị đối với công nghệ sinh học và nó đã được ứng dụng rất rộng rãi đối với nhiều ngành công nghiệp khác nhau Đối với đất bị nhiễm độc, các chất hoạt động bề mặt có thể làm tăng khả năng phân hủy, nó phụ thuộc vào thời gian phân hủy và số lần các chất hoạt động bề mặt bám vào bề mặt chất độc [36]

Bên cạnh đó quá trình phân hủy sinh học của vi sinh vật còn phụ thuộc vào bản thân các vi sinh vật, phương thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua màng tế bào Ngoài cơ chế phân hủy DDT và dẫn xuất của DDT bởi các enzyme nội bào tức là phải chuyển các chất độc qua màng tế bào thì cơ chế xúc tác phân hủy DDT bằng các enzyme ngoại bào cũng đã được quan tâm Trong đó ba enzyme ngoại bào LiP, MnP thuộc nhóm peroxidase và Lac thuộc nhóm oxidoreductase hiện nay được quan tấm nhiều nhất

Trang 32

28

6 LACCASE 6.1 Định nghĩa

Laccase (p- benzenediol:oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenol oxidase Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có phổ cơ chất rất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, dioxin và cả các hợp chất vô cơ như iot Các loại enzyme laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử và tính chất động học [35]

6.2 Cấu trúc phân tử của laccase

Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozyme này khác nhau về trình tự acid amine và một số tính chất về động học xúc tác Nấm có thể tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức

độ glycosyl hóa và cả thành phần các gốc carbonhydrate Trametes versicolor

có 5 dạng isozyme chỉ khác nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrate của chúng thay đổi từ 10 – 45% so với khối lượng của thành phần protein Phân tử laccase thường là monomeric protein, chỉ một số là oligomeric protein, có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 – 90kD Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lượng carbonhydrate chiếm khoảng 10 – 25% [34]

Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng Những nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp phụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3

Trang 33

Trang 34

30

Hình 1.7 Hình ảnh không gian ba chiều của laccase từ M albomyces

Tiểu phần A, B, C đƣợc kí hiệu đỏ, xanh lục và xanh lá cây

Hình 1.8 Trung tâm hoạt động của laccase

Trang 35

31

6.3 Cơ chế xúc tác của laccase

Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn các loại enzyme khác, laccase có phổ đặc hiệu cơ chất khá rộng Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme Các đại lượng này phụ thuộc cấu trúc hóa học của cơ chất Thế oxy hóa khử của

laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V [9] Cơ chất khử bị mất một

điện tử nhờ xúc tác laccase thường tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme như hydrate hóa, phân ly hoặc polymer

hóa

Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa cơ chất Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+) Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước (Hình 1.9)

Trang 36

32

Hình 1.9 Cơ chế xúc tác của laccase

Ngoài ra cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau Cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của phân tử laccase Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian (mediator) Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do [52] Sau đó mediator ở dạng oxy hoá nhận một điện tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xác tác Ngược lại, laccase sau khi cho mediator một điện tử thì trở thành dạng khử, và sau đó bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo (Hình 1.10) Các mediator thường phù hợp cho laccase là 3-Hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), N-hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid ( VLA) v.v [52] Sự tham gia của mediator đã làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của laccase

Trang 37

33

Hình 1.10 Các kiểu xúc tác của laccase

A Chu kỳ xúc tác không có sự tham gia của các mediator B Chu kỳ xúc tác với sự tham gia của các mediator

Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azide, cyanide, fluoride Các ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên và cản trở các dòng điện tử đi đến các nguyên tử này Các chất ức chế laccase khác là ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), acid béo, tropolone, acid kojic và acid coumaric, nhưng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn Các hợp chất chứa sulfhydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acid cũng được coi là các chất ức chế laccase

6.4 Tính chất hóa sinh của laccase

Hoạt tính xúc tác của enzyme được đặc trưng bởi hằng số Michaelis - Menten (Km) Hằng số này của laccase dao động trong một giới hạn khá rộng, trong khoảng 2 – 500µM phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và cơ chất Giá trị Km thấp nhất đối với cơ chất là syringaldazine (một dạng dimer của hai phân tử 2,6-dimethoxyphenol liên kết với nhau bằng cầu nối azide) Ái lực đối với oxy thì ít phụ thuộc vào enzyme hơn và chỉ dao động trong khoảng 20 - 50µM

A

B

Trang 38

34

Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4 – 6 đối với cơ chất phenolic Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị giảm, nguyên nhân do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế laccase Mặt khác, tăng pH còn làm giảm thế oxy hóa khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn Do vậy, hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase – cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxide Đối với các cơ chất không phải phenolic như ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2 – 3 Ngược lại, tính bền của laccase cao nhất trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8 – 9

Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật Nhìn chung, laccase bền ở 30 – 50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryote ví dụ, thời gian bán hủy của laccase của

Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70oC và của protein cotA từ loài

Bacillus subtilis là 112 phút ở 80oC Thời gian bán hủy của laccase có nguồn gốc nấm thường là nhỏ hơn 1 giờ ở 70oC và dưới 10 phút ở 80o

C [9,35,43,55]

6.5 Sự phân bố và một số vi sinh vật sinh laccase

Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng được tìm thấy ở thực vật, nấm, một số vi khuẩn và côn trùng Laccase lần đầu tiên được phát

hiện đầu tiên ở cây Rhus vernicifera Việc nghiên cứu laccase trên đối tượng

thực vật và nấm đảm rất phổ biến Laccase từ nấm được nghiên cứu và khảo

sát rất kỹ đặc biệt là laccase từ nấm đảm Basidomyces Ngoài ra các các loài nấm như Ascomyces, Deuteromyces, basidomyces và các loài nấm có khả

Trang 39

35

năng phân hủy ligincellulose như Agaricus bisporus, Botrytis cinerea, Chaetomium themophilum, Coprius cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiate, Pleurotus ostrotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor [35]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này trên các đối tượng nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn lại không nhiều Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase được miêu tả ở phụ lục 3 [21,25,38,44,56,60]

6.6 Gene mã hóa laccase

Trong vài thập kỷ gần đây, gene sinh tổng hợp laccase đã bắt đầu được nghiên cứu Cho đến nay đã có hơn 100 gene sinh tổng hợp laccase được đánh giá và so sánh Các nghiên cứu chủ yếu tập trung trên đối tượng vi sinh vật Năm 1998 gene laccase đầu tiên được phân lập và giải trình tự từ nấm đảm

Neurospora crassa và nấm sợi Aspergillus nidulans Tuy nhiên các gene

tương ứng với các protein laccase hoàn chỉnh mới chỉ có khoảng 20 gene, phần lớn trong số đó là từ nấm đảm [9,32,35,44,60] ( Phụ lục 4)

Đối với nấm đảm và thực vật bậc cao, các gene laccase thường có nhiều intron Số lượng intron trong mỗi gene thường từ 8 – 13 đoạn, mỗi đoạn có kích thước khoảng 50 – 90 nucleotit Ngoài ra cũng có những gene laccase

chỉ có một intron như Neurospora crassai, ngược lại Pleurotus ostreatus lại

có đến 19 đoạn intron Các gene điển hình mã hóa protein laccase thường có kích thước khoảng 500 – 600 axit amin

Ở nhiều chủng nấm trong bộ gene chứa nhiều gene mã hóa sinh tổng

hợp laccase Trametes villosa chứa ít nhất 5 gene mã hóa cho laccase, Coprinus cinereus chứa ít nhất 8 gene và Rhizoctonia solani, Pleurotuss sajor-caju chứa ít nhất là 4 gene mã hóa laccase Tuy nhiên các gene này nằm

Trang 40

36

ở các allen khác nhau trên nhiễm sắc thể và các trình tự bảo thủ liên quan đến vị trí liên kết với các nguyên tử đồng lại đồng thời cũng có mặt trong các gene mã hóa các enzyme oxidase chứa nhiều nguyên tử đồng khác, chính những điều này đã gây khó khăn trong việc phân lập và xác định chính xác số gene mã hóa cho laccase

Sự biểu hiện của gene sinh tổng hợp laccase phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường Với mỗi chủng khác nhau thì đòi hỏi điều kiện môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp laccase khác nhau Như môi trường giàu

nitơ làm tăng quá trình sinh tổng hợp laccase ở chủng Pleurotus sajor-caju, nhưng chủng Lentinula edodes lại có khả năng sinh tổng hợp laccase t ốt hơn

trên môi trườn g có hàm lượng nitơ thấp Đồng và các ion kim loại khác như Hg2+, Mg2+, Cd2+ và một số hợp chất vòng thơm được xem là những nhân tố hoạt hóa mạnh quá trình sinh tổng hợp laccase Quá trình hoạt hóa gene sinh tổng hợp laccase bởi các ion kim loại hoặc các hợp chất phenol chứng minh là được điều khiển bởi một trình tự điều hòa của vùng promoter của gene [32,35]

Gene mã hóa sinh tổng hợp laccase đã được chuyển vào nhiều đối

tượng khác nhau như Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, A nodulan, A oryzae, cây thuốc lá v.v Trong nghiên cứu mới nhất

(2009) Xiaoshu Shao và cộng sự đã chỉ ra rằng, hoạt tính của laccase từ

Shigella dysenteriae được biểu hiện trong Escherichia coli (Wlac) tăng từ

24,4 UI/mg lên 52,9 UI/mg sau khi thay thế hai axit amin Glu 106 bằng Phe 106 trong chuỗi xoắn anpha (WlacS) Với kỹ thuật đột biến xóa đoạn trong chuỗi xoắn anpha t ừ Leu 351 đến Gly 378 (WlacD), hoạt tính enzyme tăng 3,5 lần so với laccaseWlac) Đồng thời cả hai WlacS và WlacD đều bền nhiệt hơn Wlac [60]