6 PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM SỢI FNA1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SO SÁNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA 18S rRNA
6.4 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA
Trình tự đoạn gen 18S rRNA (534 nucleotid) của chủng FNA1 đã đƣợc xác định, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.34. Trình tự đoạn gen mã hoá 18S rRNA của chủng FNA1 đƣợc đăng ký trên Genbank với mã số GQ906535.
So sánh với các trình tự gen 18S rRNA của các chủng vi nấm đã công bố trên các ngân hàng dữ liệu Genbank, EMBL cho thấy chủng FNA1 có mức tƣơng đồng cao với các chủng vi nấm thuộc ngành nấm nang Ascomycetes,
ngành phụ Pezizomycotina, chi Aspergillus. Dựa trên cơ sở so sánh mức độ
tƣơng đồng một phần trình tự gen mã hóa 18S rRNA chủng FNA1 với một số chủng vi nấm đại diện, sử dụng phần mềm Clustal X để xây dựng cây phát sinh chủng loại để thấy rõ đƣợc mối quan hệ phát sinh chủng loại của chủng nấm sợi FNA1(Hình 3.35).
Nhƣ vậy, dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và so sánh một phần trình tự gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1 thì ch ủng này thuộc chi Aspergillus và đƣợc đặt tên là Aspergillus sp. FNA1.
GGAAGGGGTGTATTTATTAGATAATCTGTGCTCCTTCTTCGAGCTCCTTGGTGATTCATAA TAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTC GATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGA GAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCC CGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAAT GAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGG TAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGG TCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCT CATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGGACTTTTACA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
93
Hình 3.35 Cây phát sinh chủng loại của chủng Aspergillus sp. FNA1
Nấm thuộc chi Aspergillus có nhiều chủng có khả năng phân hủy DDT hay các chất có cấu trúc tƣơng tự. Aspergillus conicus làm biến đổi
55,1% bis(4-chlorophenyl)acetic acid (DDA) thành các sản phẩm hòa tan trong nƣớc chƣa xác định và chƣa chiết tách đƣợc. Aspergillus niger và
Penicillium brefeldianum chuyển hóa lần lƣợt 12,4 và 24,6% DDT thành
các sản phẩm không xác định và hòa tan trong nƣớc. Aspergillus niger
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
94
phân hủy 4, 4’-dichlorobenzophenone (DBP) thành 4-chlorobenzophenone và methylated 4-chlorobenzophenone [47]. Các minh chứng trên cho thấy vai trò rất qua n trọng của nấm sợi , đặc biệt là các đại diện của chi
Aspergillus trong phân hủy sinh học DDT và các sản phẩm trong chu trình
khoáng hóa DDT.
Trên cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng Aspergillus sp. FNA1 có quan hệ gần gũi với một số chủng nhƣ Aspergillus sp. FNA4, Aspergillus sp. FNA33, Aspergillus sp. FBH11, đây đều là các chủng có
khả năng phân hủy các chất thuộc POPs. Đặc biệt 2 chủng Aspergillus sp. FNA4, Aspergillus sp. FNA33 là 2 chủng đƣợc phân lập cùng địa điểm ô nhiễm với chủng FNA1, các chủng này có khả năng phân hủy lần lƣợt 94,48 % hỗn hợp DDT trong 14 ngày và 88 % HCH, trong khi chủng FNA1 phân hủy 97,23 % DDT; 97,19 DDD; và 92,69 % DDE trong 7 ngày nuôi cấy. Cả 3 chủng FNA4, FNA33 và FBH11 đều đƣợc mô tả là có khả năng sinh laccase, chủng FNA4 sinh laccase với hoạt tính 15,4 U/l, chủng FNA33 là 4,3 U/l [3,4,5], chủng FBH11 có độ tƣơng đồng 98 % đƣợc phân lập từ đất ô nhiễm thuốc diệt cỏ/dioxin sinh laccase với hoạt tính cao. Một số chủng nấm sợi thu ộc chi Aspergillus đƣợc công bố là có khả năng sinh
enzyme ngoại bào là Aspergillus terreus LD-1 và Aspergillus nidulans.
Chủng Aspergillus tereus sinh ra hai loại enzyme ngo ại bào là MnP và Laccase trong điều kiện kiềm (pH từ 11 đến 12.5), hoạt tính enzyme trung bình của hai loại enzyme này là 0,384 U/mg [40].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
95
KẾT LUẬN
1.Dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và so sánh một phần trình tự gen mã hóa 18S rRNA, chủng nấm sợi FNA1 đƣợc xác định thuộc chi Aspergillus và đƣợc đặt tên là Aspergillus sp. FNA1. Trình tự đoạn gen
mã hóa 18S rRNA của chủng Aspergillus sp. FNA1 đƣợc đăng ký trên
Genbank với mã số GQ906535.
2.Cả 3 chủng FNA1, FNA2 và FNA3 đều có khả năng sinh laccase và MnP, chủng FNA1 không sinh LiP. Trên môi trƣờng sàng lọc, hoạt tính laccase lần lƣợt là 5,4; 2,9; 3,3 (U/l), hoạt tính MnP lần lƣợt là 26,9; 6,05; 13,4 (U/l), hoạt tính LiP của FNA2 và FNA3 là 4,15 và 2,07 (U/l).
3. Aspergillus sp. FNA1 phân hủy DDT theo cơ chế đồng trao đổi chất, sau 7 ngày nuôi cấy chủng này loại bỏ DDE, DDD và DDT lần lƣợt là 92,69 %, 97,19 % và 97,23 % so với mẫu đối chứng.
4. Aspergillus sp. FNA1 phát triển tốt nhất ở 37oC, pH 5, nồng độ NaCl 0,1 %, nồng độ DDT 200 ppm, ngoài ra còn phát triển tốt trên môi trƣờng chứa 2,4-D, 2,4,5-T, pyren, phenanthren, anthracene và dịch chiết. Chủng FNA1 không phát triển trên nguồn carbon là lactose và cellulose, phát triển yếu trên nguồn nitơ là urê.
5.Aspergillus sp. FNA1 sinh tổng hợp laccase trong điều kiện 30oC, pH 5, nồng độ NaCl 0,1 %, glucose 0,1 %, CuSO4 1 mM và nguồn chất ô nhiễm là DDT, nguồn carbon là saccharose, nguồn nitơ là NaNO3 và KNO3.
6.Môi trƣờng thích hợp nhất để Aspergillus sp. FNA1 sinh tổng hợp laccase
là môi trƣờng Czapek nghèo có bổ sung Tween 80 0,2 %, hoạt tính laccase đạt 2608,3 U/l sau 1 ngày nuôi cấy.
7.Laccase từ chủng FNA1 có pH tối ƣu 1,5, nhiệt độ tối ƣu 50oC, bền trong khoảng pH 4 – 5 và nhiệt độ dƣới 50 oC.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
96
KIẾN NGHỊ
1.Nghiên cứu các gen chức năng tham gia quá trình phân hủy DDT và gen mã hóa laccase.
2.Nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học các loại thuốc trừ sâu khác của chủng FNA1, đồng thời nghiên cứu khả năng sử dụng enzyme ngoại bào trong việc loại bỏ thuốc nhuộm màu và phân hủy các chất ô nhiễm.
3.Tối ƣu các điều kiện lên men để sản xuất laccase với lƣợng lớn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
97