1 VẬT LIỆU
1.1 Nguyên liệu
Ba chủng nấm sợi đƣợc phân lập tử đất ô nhiễm hỗn h ợp DDT, DDD, DDE, Hexachlorocyclorohexane (HCH), Heptachlor, Aldrin, Diendrin, Endrin ở nồng độ cao của Nam Đàn, Nghệ An. Các chủng nấm này đƣợc đặt tên lần lƣợt là FNA1, FNA2, FNA3. Đây là 3 chủng nấm sợi trong bộ giống của phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng – Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam.
1.2 Hóa chất
Hóa chất sử dụng để nghiên cứu là các hóa chất tinh khiết, đảm bảo chất lƣợng nhƣ ABTS, Guiaiacol, DDT, 2,4,5-T v.v. đƣợc nhập ngoại từ các hãng hóa chất có uy tín Sigma, Merk v.v. Trong quá trình phân loại chủng có sử dụng bộ kit cloning của hãng Fermentas. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR là EF4f /Fung5R.
1.3 Thiết bị
Các thiết bị, máy móc đƣợc sử dụng của Viện công nghệ sinh học nói chung và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen nói riêng. Các thiết bị bao gồm: Box cấy vô trùng, máy đo quang phổ hấp thụ, kính hiển vi, cân điện tử, nồi khử trùng ƣớt, nồi khử trùng khô, tủ sấy, máy nuôi lắc ổn nhiệt, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm, máy chu trình nhiệt, máy xác định trình tự gen tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, máy điện di DNA (Bio-Rad), tủ lạnh các loại 4oC,-20oC, -80oC, và các dụng cụ thí nghiệm khác v.v.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
44
1.4. Môi trƣờng nuôi cấy
Các môi trƣờng cơ bản đƣợc sử dụng trong phân lập, nghiên cứu các đặc điểm sinh lý của nấm sợi và môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn E.coli sử dụng trong phân loại đƣợc trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các môi trƣờng nuôi cấy cơ bản
Môi trường muối khoáng dịch (g/l) Môi trường muối khoáng thạch (g/l)
KNO3 3,0 KH2PO4 0,3 MgSO4 0,4 NaH2PO4 0,4 NaCl 1,0 Nƣớc máy vừa đủ 1 lít pH 6,5 Thành phần các loại hoá chất giống nhƣ môi trƣờng khoáng dịch và có bổ sung thêm 20g agar.
Môi trường Czapek dịch (g/l) Môi trường Czapek thạch (g/l)
Saccharose 30 NaNO3 2 KH2PO4 1 KCl 0.5 FeSO4 0.01 NaCl 1 pH 7 Thành phần các loại hoá chất giống nhƣ môi trƣờng czapek dịch và có bổ sung thêm 20g agar.
Môi trường LB dịch (g/l) Môi trường LB thạch (g/l)
NaCl 10 Tryptone 10 Cao men 5,0
Thành phần các hoá chất tƣơng tự môi trƣờng LB dịch nhƣng có bổ sung thêm 15g agar.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
45 Nƣớc cất vừa đủ 1 lít
pH 7
Môi trường Czapek nghèo Nước muối sinh lý (0,85%)
Là hỗn hợp môi trƣờng muối khoáng và Czapek theo tỷ lệ 4 : 1 về thể tích.
NaCl 8,5g Nƣớc máy vừa đủ 1 lít
Môi trƣờng trƣớc khi sử dụng đƣợc khử trùng ở 121o
C, 1 atm trong 15 phút. Môi trƣờng muối khoáng và czapek đƣợc bổ sung thêm hỗn hợp vitamin, hỗn hợp vi lƣợng và nguồn cơ chất là DDT.
Thành phần các loại môi trƣờng sử dụng làm môi trƣờng thay thế nghiên cứu khả năng sinh laccase đƣợc trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Môi trƣờng thay thế
Môi trường MEG (g/l) ( Malt extract glucose)
Môi trường SG (g/l) (Soy glucose) Cao malt 6 Cao men 4 Glucose 8 MgSO4 0,5 Na2HPO4 0,6 KH2PO4 0,5 CaCO 3 0,5 Fe SO4 0,01 MnSO4 0,05 CuSO4 0,05 Glucose 5 KH2PO4 1 MgSO4 0,5 Fe SO4 0,01 NaCl 1 CaCO 3 0,5 KCl 0,5 Bột đậu tƣơng 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
46
Môi trường YS (g/l) (Yeast extract-Soluble starch)
Môi trường PG (g/l) (Potato glucose)
Cao men 2,0 Cao malt 3,0 Tinh bột tan 10
Nƣớc chiết khoai tây 500 Glucose 10 KH2PO4 0,6 NaCl 0,1 MgSO4 0,05