5.1 pH tối ưu và độ bền pH 5.1.1 pH tối ưu 5.1.1 pH tối ưu
Đô pH môi trƣờng ảnh hƣớng rất lớn đến vận tốc phản ứng enzyme. Bởi pH ảnh hƣởng đến trạng thái ion hóa các gốc R của các gốc axit amin trong phân tử enzyme, ion hóa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động và ion hóa cơ chất. Để tìm ra khoảng pH tối ƣu cho hoạt động của laccase từ chủng FNA1 hoạt tính enzyme đã đƣợc xác định thông qua việc sử dụng dịch lên men chủng FNA1 trong môi trƣờng Czapek nghèo có bổ sung 0,2 % Tween 80 và các đệm có pH khác nhau. Trên hình 3.23 thể hiện kết quả định tính, hoạt tính laccase đƣợc thể hiện thông qua mức độ xanh đậm hay nhạt của sản phẩm tạo thành do ABTS bị oxy hóa. Enzyme do FNA1 sinh ra hoạt động
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
83
xúc tác phản ứng mạnh nhất trong khoảng pH rất thấp từ pH 1 – 2. Kết quả xác định hoạt tính trong hình 3.24 thể hiện rõ hơn kết luận trên, laccase này hoạt động ở khoảng pH 1,5 là thích hợp nhất, tại đây hoạt tính laccase đo đƣợc lên đến 2802,8 U/l. Laccase của chủng FNA1 có thể hoạt động trong khoảng pH thấp nhƣ trên là một đặc tính rất quý vì trong công nghệ xử lý môi trƣờng có rất nhiều nguồn ô nhiễm có điều kiện khắc nghiệt nhƣ pH rất thấp hoặc rất cao. pH hoạt động tối ƣu của laccase từ chủng này là thấp hơn so với một số chủng nấm khác nhƣ Trametes trogii, Trametes versicolor, Melacarpus albomyces, Marasmius quercophilus .v.v, pH hoạt động tối ƣu của laccase từ các chủng nói trên lần lƣợt là pH 2; 3; 3,5 và 4,5 [39].
pH 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
84
Hình 3.24 Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính của laccase từ chủng FNA1
5.1.2 Độ bền pH
Do pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến độ bền của protein cho nên việc xác định độ bền pH của enzyme có ý nghĩa quan trọng trong quá trình thu nhận, tinh sạch, nghiên cứu và bảo quản enzyme. Laccase thô của FNA1 bền ở khoảng pH 4 – 5 (Hình 3.25), khoảng pH bền này khá thấp so với một số chủng nấm đảm khác nhƣ nấm đảm Sclerotium rolfsii chỉ còn 50 % hoạt tính
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
85
Hình 3.25 Độ bền pH của laccase từ chủng FNA1
5.2 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase và độ bền nhiệt 5.2.1 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase 5.2.1 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase
Nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của laccase đƣợc xác định qua việc đo hoạt độ enzyme ở các nhiệt độ phản ứng khác nhau từ nhiệt độ phòng (32oC) đến 90 o
C. Kết quả trên hình 3.26 cho thấy khi nhiệt độ tăng dần từ 32 oC đến 50 oC hoạt tính laccase cũng tăng dần từ 53,4 % (1354,2 U/l) đến 100%, nhiệt độ thích hợp nhất cho laccase hoạt động khoảng 50 o
C (2732 U/l) và giảm nhẹ khi nhiệt độ tăng lên 60 oC. Ở 90 oC enzyme vẫn còn khả năng hoạt động nhƣng hoạt tính giảm mạnh chỉ còn 35,7 % (905,1 U/l). Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase từ nấm sợi FNA1 thấp hơn so với 1 số chủng nấm đảm khác nhƣ Pycnoporus sanguineus là 55 oC, 3 loại laccase của C. micaceus là pool 1; pool 2; pool 3 tƣơng ứng là 65, 60, 65 oC [33].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
86
Hình 3.26 Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính laccase từ chủng FNA1
5.2.2 Độ bền nhiệt
Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên dƣới ảnh hƣởng của nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và ảnh hƣởng tới hoạt độ, mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào nhiệt độ và thời gian ủ enzyme. Để xác định khoảng nhiệt độ bền của laccase từ FNA1 dịch enzyme thô đƣợc ủ ở các nhiệt độ 50, 60, 80, và 90 oC, hoạt tính enzyme đƣợc xác định sau các khoảng thời gian nhất định. Laccase thô của FNA1 bền nhiệt ở khoảng nhiệt độ dƣới 50 oC. Khi xử lý enzyme ở 60 oC sau 40 phút hoạt tính laccase giảm còn một nửa so với ban đầu (Hình 3.27), thời gian này là 200 phút đối với laccase của P. sanguineus và dƣới 5 phút đối với các laccase của C. micaceus khi xử lý ở 65
o
C. Xử lý ở nhiệt độ cao 80 và 90 oC hoạt tính enzyme sau 10 phút đã giảm mạnh xuống khoảng 50 % hoạt tính ban đầu và duy trì ổn định trong thời gian ủ tiếp theo [33].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
87
Hình 3.27 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền laccase từ FNA1