Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
40
Phƣơng pháp phân loại cổ điển sử dụng hình thức kết hợp những đặc điểm hình dạng bên ngoài và các đặc điểm sinh lý để phân loại. Các đặc điểm hình thái nhƣ hình dạng, kích thƣớc tế bào, màu sắc của khuẩn lạc, kích cỡ của tế bào vi sinh vật, khả năng bắt màu khi nhuộm Gram, các đặc điểm vi cấu trúc, cách thức chuyển động của tế bào, hình thức sinh sản, hình dạng và vị trí của nội bào tử trong tế bào, hình thái và vị trí bào tử trong tế bào mẹ v.v. Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất nhƣ nguồn cacbon và nitơ đƣợc sử dụng, nguồn năng lƣợng, cơ chế chuyển hóa năng lƣợng, kiểu dinh dƣỡng, các sản phẩm trao đổi chất, giới hạn về nhiệt độ và nhiệt độ tối thích cho sinh trƣởng, các hợp phần cấu tạo thành tế bào, giới hạn về pH tối thích cho sinh trƣởng, các sắc tố quang hợp, các chất dự trữ, tính mẫn cảm với chất ức chế sinh trƣởng v.v. Ngoài ra còn rất nhiều phƣơng pháp phổ biến khác nữa nhƣ kiểm tra phản ứng sinh hóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau, các phản ứng miễn dịch của các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào nhƣ kháng nguyên O của lipopolysaccharid hay của bao nhày thƣờng đƣợc sử dụng để phân biệt các chủng của một loài.
7.2 Phân loại bằng phƣơng pháp xác định và so sánh trình tự gene mã hóa 18S rRNA hóa 18S rRNA
7.2.1 Một số phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử
Từ cuối thế kỉ XX đặc biệt là những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới cho việc phân loại vi sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là thời gian đòi hỏi ngắn và tính chính xác cao. Phƣơng pháp này cho phép phát hiện, mô tả và giải thích đƣợc tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
41
Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gene trong hệ gene nhân, hệ gene của các bào quan (ti thể và lạp thể) hoặc các sản phẩm của gene (protein, enzyme). Mỗi loại gene, sản phẩm của gene lại phù hợp với từng đối tƣợng và mục đích nghiên cứu khác nhau. Do đó, việc lựa chọn gene nào, loại protein nào có ý nghĩa lớn đối với sự thành công của mỗi hƣớng nghiên cứu. Từ các nghiên cứu này, các nhà phân loại học có cơ sở chính xác hơn trong việc đƣa ra các kết luận về phân loại học. Một số phƣơng pháp kĩ thuật phân loại hiện đại đƣợc mô tả trong phụ lục 5 [1].
7.2.2 Phân loại dựa vào trình tự gene mã hoá 18S rRNA
Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phƣơng pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy nhiên dựa vào sự khác nhau này, ngƣời ta có thể đánh giá đƣợc mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật.
Trong tế bào, riboxom có thể tồn tại trong tế bào chất, trên mạng lƣới nội sinh chất, hay trong ty thể và lục lạp. Riboxom có cấu trúc gồm hai tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị gồm có 2 thành phần riêng rẽ về rRNA và protein. Vi sinh vật nhân thật có hằng số lắng 80S gồm hai tiểu đơn vị 60S và 40S, tiểu đơn vị 60S chứa các loại 5S; 5,8S và 28S rRNA, tiểu đơn vị 40S có chứa 18S rRNA. Trong 4 loại rRNA của sinh vật nhân thật (5S; 5,8S; 18S; 28S) thì gene mã hóa cho 18S rRNA (kích thƣớc khoảng 1900 nucleotit) là phù hợp nhất cho các nghiên cứu phân loại nấm. Sở dĩ nhƣ vậy là do gene mã hóa cho 5S và 5,8S rRNA có kích thƣớc khoảng 120 và 160 nucleotit dễ xác định và so sánh trình tự nhƣng lại quá ngắn để có thể phân biệt một cách chi tiết giữa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
42
các chủng. Còn gene mã hóa cho 28S rRNA có kích thƣớc khoảng 4200 nucleotit, quá lớn, gây khó khăn cho tách dòng , xác định và so sánh trình tự của cơ thể đa bào. Chỉ có gene mã hóa cho 18S rRNA với kích thƣớc khoảng 1900 nucleotit là phù hợp cho việc phân loại và không gây khó khăn trong nghiên cứu.
Vùng đệm 18S – 5,8S có thể thay đổi đƣợc kích thƣớc và trình tự ngay ở cả những nhóm phân loại có quan hệ họ hàng gần nhau. Phần kích thƣớc này có thể đƣợc sử dụng để xác định tập đoàn và trình tự khác biệt rộng cho phép khám phá ra những đơn vị giống nhƣ loài rất chính xác bằng PCR, lai v.v. Giữa các đơn vị gene có các đoạn ITS – 2 và ITS – 2. Ở đầu 5’ của phân tử rRNA đƣợc phiên mã có một ETS. Nói chung, các đơn vị gene bảo thủ hơn các đoạn ITS, các ITS lại bảo thủ hơn đoạn ETS.
Gene mã hóa cho cấu trúc 18S rRNA của sinh vật nhân thật đã đƣợc nghiên cứu kỹ cùng với nhiều cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gene này lên bằng kỹ thuật PCR. Nấm sợi là sinh vật nhân thật, hiện nay đã có nhiều tác giả sử dụng phƣơng pháp phân loại dựa vào gene mã hóa 18S rRNA để phân loại nấm nói chung và nấm sợi nói riêng [30].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
43