Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ yếu tố gây bệnh của vi khuẩn e. Coli trong hội chứng tiêu chảy ở bê nghé tại sơn la và thử nghiệm phác đồ điều trị

Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ yếu tố gây bệnh của vi khuẩn e. Coli trong hội chứng tiêu chảy ở bê nghé tại sơn la và thử nghiệm phác đồ điều trị

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LỪ VĂN TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ,

YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN E COLI

TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÊ, NGHÉ TẠI SƠN LA VÀ THỬ NGHIỆM PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

THÁI NGUYÊN - 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LỪ VĂN TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ,

YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN E COLI

TRONG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở BÊ, NGHÉ TẠI SƠN LA VÀ THỬ NGHIỆM PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ

Chuyên ngành: THÚ Y Mã số: 60.62.50

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CÙ HỮU PHÚ

THÁI NGUYÊN - 2008

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là luận văn do tôi thực hiện Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ai công bố trong bất cứ cong trình nghiên cứu nào khác.Các tài liệu tham lhaor trích dẫn đều được ghi tên tác giả và tên tài liệu trích dẫn trong phần tài liệu tham khảo

Tác giả luận văn

Lừ Văn Trường

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Nông lâm Thái nguyên, Viện Thú y, Chi cục Thú y Sơn La đã cho phép và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận văn này

Xin chân thành cảm ơn: GS.TS Cù Hữu Phú; TS Nguyễn Văn Sửu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa sau đại học trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, Bộ môn Vi trùng Viện Thú y, cùng toàn thể bạn bè đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và toàn thể cán bộ công chức Chi cục Thú y tỉnh Sơn La, đặc biệt là KS Lò Văn Tăng Chi cục trưởng Chi cục Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn trạm Thú y, cán bộ Thú y xã thuộc các huyện Thuận Châu, Mai Sơn, Yên Châu, Mộc Châu, Phù Yên và Sông Mã đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Để góp phần thực hiện thành công luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ đáng kể của gia đình và đồng nghiệp

Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với mọi sự giúp đỡ quý báu đó

Tác giả luận văn

Lừ Văn Trường

MỤC LỤC

Trang

1.1 Tình hình nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé 4

1.1.5 Ảnh hưởng của nuôi dưỡng không đúng kỹ thuật 8

1.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E coli gây tiêu chảy ở bê, nghé 8

1.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli 24

1.4.1 Các yếu tố không phải là độc tố 24

1.6 Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn gây ra ở bê, nghé 36

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 40

2.2.2 Môi trường, hoá chất, dụng cụ và động vật thí nghiệm 40

2.2.2.3 Các loại kháng huyết thanh chuẩn để định type vi khuẩn E

coli phân lập được

41

2.2.2.4 Các loại hoá chất và môi trường dùng trong phản ứng PCR 41

2.3.1 Điều tra hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé nuôi tại Sơn La 41

2.3.2 Nuôi cấy phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli gây

bệnh tiêu chảy ở bê, nghé

42

2.3.3 Xác định đặc tính sinh vật, hoá học các chủmg vi khuẩn E coli

phân lập được

42

2.3.4 Xác định serotype vi khuẩn E coli phân lập được 42

2.3.5 Xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli phân lập được 42

2.3.6 Xác định độc lực của vi khuẩn E coli phân lập được trên động

vật thí nghiệm

42

2.3.7 Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi

khuẩn E coli phân lập được

42

2.3.8 Xây dựng một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé do vi khuẩn gây ra tại Sơn La

42

2.4.1.2 Các phương pháp đo lường trong dịch tễ 42

2.4.3 Phương pháp phân lập và xác định của vi khuẩn E coli 43

2.4.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn E coli 43

2.4.3.2 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn E coli 45

2.4.3.3 Giám định một số đặc tính sinh hoá chủ yếu của các chủng E coli

phân lập được

45

2.4.3.4 Xác định type của vi khuẩn E coli phân lập được 48

2.4.3.5 Xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli phân lập được 48

2.4.4 Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn E coli phân lập

được trên động vật thí nghiệm

51

2.4.5 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của

các chủng E coli phân lập được

51

2.4.6 Thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé do

vi khuẩn E coli gây ra tại Sơn La

52

3.1 Một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé tại Sơn La

3.1.4 Bệnh tích đại thể ở bê, nghé bị chết do tiêu chảy tại Sơn La 60

3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy bê, nghé tại

3.3 Kết quả giám định đặc tính sinh vật hoá học của các chủng E

coli phân lập được

65

3.4 Kết quả xác định type vi khuẩn E coli phân lập được 66

3.5 Kết quả xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli phân

lập được

69

3.5.2 Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt và không 70

chịu nhiệt của một số chủng vi khuẩn E coli phân lập được 3.5.3 Kết quả xác định yếu tố bám dính của vi khuẩn E coli phân

3.6 Kết quả xác định độc lực vi khuẩn E coli phân lập được bằng

tiêm truyền chuột bạch

73

3.7 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng E coli phân

lập được với một số loại kháng sinh

76

3.8 Kết quả một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé do vi

khuẩn E coli gây ra tại Sơn La

77

Bảng 3.4 Bệnh tích đại thể ở bê, nghé bị chết do tiêu chảy tại Sơn La 61

Bảng 3.5 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli từ phân bê, nghé tiêu

chảy và bình thường tại Sơn La

62

Bảng 3.6 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn E coli từ một số nội tạng bê,

nghé chết do tiêu chảy tại Sơn La

64

Bảng 3.7 Kết quả xác định biến động số lượng vi khuẩn E coli ở

phân bê, nghé bị tiêu chảy và bình thường

65

Bảng 3.8 Kết quả giám định đặc tính sinh hoá các chủng vi khuẩn

E coli phân lập được tại Sơn La

66

Bảng 3.9 Kết quả xác định type vi khuẩn E coli phân lập được tại

Sơn La

68

Bảng 3.10 Kết qủ xác định khả năng gây dung huyết của vi khuẩn

E coli phân lập được tại Sơn La

69

Bảng 3.11 Kết quả xác định độc tố đường ruột các chủng vi khuẩn

E coli phân lập được tại Sơn La

70

Bảng 3.12 Kết quả xác định yếu tố bám dính vi khuẩn E coli phân 71

lập được

Bảng 3.13 Tổ hợp các yếu tố gây bệnh mang trong các chủng vi

khuẩn E coli phân lập được

Bảng 3.16 Kết quả kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng E coli

phân lập được với một số loại kháng sinh

77

Bảng 3.17 Kết quả điều trị thực nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé tại Sơn la

78

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ bê, nghé tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo lứa tuổi 56 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ bê, nghé tiêu chảy và chết do tiêu chảy theo mùa 58

Biểu đồ 3.3 So sánh kết quả xác định type vi khuẩn E coli phân lập được 67

Biểu đồ 3.4 So sánh các yêu tô gây bệnh trong các chủng vi khuẩn E

coli phân lập được

72

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Acid Deboxy nucleic

AEEC : Adhereneia Enteropathogenic E coli

AMP : Adenosine Monophosphate ATP : Adenosin Triphosphate BHI : Brai-heart infusion Colv : Colicin V

C perfrigens : Clostridium perfringens

E coli : Escherichia coli

EMB : Eosin Methylene Blue Agar EPEC : Enteropathogenic E coli

ETEC : Eneterotoxigenic E coli

ETEE : Enterotoxinic E coli

GTP : Guanosin 5-Triphosphate

LT : Heat-Labile-Toxin LTa : Heat-Labile-Toxin a LTb : Heat-Labile-Toxin b NTEC : Nectrotoxigenic E coli

PCR : Polymerase Chain Reaction TLCTLT : Tỷ lệ chết theo lứa tuổi TLTCTLT : Tỷ lệ tiêu chảy theo lứa tuổi ST : Heat-Stable-Toxin

VTEC : Verotoxigenic E coli

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Sơn La là một tỉnh miền núi, điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho việc phát triển chăn nuôi trâu, bò Tỉnh đã đưa ra mục tiêu phát triển chăn nuôi là theo hướng sản xuất hàng hoá tập trung, toàn diện vững chắc, ưu tiên những loại gia súc ăn cỏ có khả năng thích ứng cao với địa hình bãi chăn thả và nguồn thức ăn đa dạng, đặc biệt là phát triển bò sữa, bò thịt chất lượng cao, phấn đấu đến năm 2010 tỷ trọng chăn nuôi đạt từ 30-35% trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp Do có cơ chế chính sách thích hợp và việc áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong chăn nuôi số lượng đàn trâu, bò tăng bình quân hằng năm: trâu 2,9%, bò 5,8% [22] Chăn nuôi trâu, bò ngoài cung cấp thịt, sữa, sức kéo, còn đem lại nguồn thu nhập lớn cho nhiều hộ gia đình, nhiều hộ đã thoát nghèo nhờ chăn nuôi trâu bò Song song với việc phát triển đàn trâu bò, việc phòng và trị bệnh cũng luôn được coi trọng Trong khi một số các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như: lở mồm long móng, tụ huyết trùng, nhiệt thán đã được khống chế thì bệnh tiêu chảy ít được quan tâm cho nên đã gây thiệt hại không nhỏ cho người chăn nuôi trâu bò, nhất là bê, nghé Theo số liệu dịch tễ của Chi cục Thú y tỉnh từ năm 2005-2007 [1] số bê, nghé bị tiêu chảy trung bình hằng năm trên 2.000 con trong đó tỷ lệ chết là 8,30%/ năm trong số con bị mắc bệnh

Hội chứng tiêu chảy ở gia súc nói chung và ở bê, nghé nói riêng là một hiện tượng bệnh lý rất phức tạp gây ra bởi sự tác động tổng hợp của nhiều nguyên nhân, bao gồm các nhân tố điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra các stress cho cơ thể như: chăm sóc, quản lí kém, thời tiết và do bản thân con vật tạo điều kiện thuận lợi cho việc cho việc xâm nhập các vi sinh vật gây bệnh vào vật chủ, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh ở đường tiêu hoá dẫn tới

sự nhiễm khuẩn loạn khuẩn Theo Lê Minh Chí (1995) [2] thì ở bê, nghé 70 - 80% tổn thất trong thời kỳ nuôi dưỡng và 80 - 90% trong số đó là hậu quả của bệnh tiêu chảy gây ra Các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở bê,

nghé như: E coli, Salmonella, C perfringens, Streptococcus Trong đó vi khuẩn E coli đã được nhiều tác giả trên thế giới thống nhất là

một trong các nguyên nhân thường gặp và quan trọng nhất gây bệnh tiêu chảy ở bê, nghé

Vì vậy nghiên cứu xác định dịch tễ của bệnh để có một cách nhìn tổng quát về nguyên nhân gây bệnh theo mùa, tuổi có liên quan đến bệnh đồng thời đề ra những biện pháp phòng, trị bệnh đạt hiệu quả cao Mặt khác, trong những năm gần đây việc dụng sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh tiêu chảy ở bê, nghé không được hướng dẫn và quản lý chặt chẽ, phần lớn phụ vào sự chủ quan của người bán thuốc và sử dụng tuỳ tiện của người chăn nuôi dẫn tới tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn hiệu quả điều trị không cao, thậm chí còn một số thuốc không còn tác dụng Như vậy, đã có hiện tượng một số vi khuẩn chính gây bệnh trong đó có

E coli đã kháng lại kháng sinh dùng để điều trị Để góp phần hạn chế

thiệt hại bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E coli gây ra ở bê, nghé và giải

quyết yêu cầu cấp thiếp cho chăn nuôi trâu, bò ở địa phương chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ, yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli trong hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé tại Sơn La và thử nghiệm phác đồ điều trị"

2 Mục tiêu của đề tài

- Xác định một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé

- Phân lập, giám định đặc tính, vai trò gây bệnh của vi khuẩn E.coli

trong hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé tại Sơn La

- Xây dựng một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy bê, nghé do vi khuẩn

E coli gây ra trên địa bàn tỉnh Sơn La

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Đây là đề tài đầu tiên nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy do vi khuẩn

E coli gây ra ở bê, nghé trên địa bàn tỉnh Sơn La Đồng thời xác định được

nguyên nhân chính gây bệnh để có cơ sở khoa học để đưa ra các biện pháp phòng trị hội chứng tiêu chảy ở bê, nghé

- Xây dựng và áp dụng quy trình phòng chống bệnh tiêu chảy bê, nghé phù hợp với điều kiện ở Sơn La, góp phần thúc đẩy chăn nuôi trâu bò phát triển về cả số lượng và chất lượng

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy ở bê nghé

Tiêu chảy là một biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý đặc thù của đường tiêu hoá Hiện tượng lâm sàng này tuỳ theo đặc điểm, tính chất diễn biến, tuỳ theo độ tuổi mắc bệnh, tuỳ theo yếu tố được coi là nguyên nhân chính mà nó được gọi theo nhiều tên khác nhau: chứng khó tiêu, chứng rối loạn tiêu hoá, Colibacillosis…

Tuy nhiên, thực chất tiêu chảy là một hội chứng bệnh lý liên quan đến rất nhiều yếu tố như: dinh dưỡng, chăm sóc, điều kiện ngoại cảnh, ký sinh trùng, vi khuẩn, vi rút trong đó có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát và việc phân biệt rõ ràng nguyên nhân gây tiêu chảy là rất khó khăn Cho dù bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến tiêu chảy thì hậu quả của nó cũng là gây viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hoá và cuối cùng là quá trình nhiễm khuẩn (Trịnh Văn Thịnh, 1964) [28], (Hồ Văn Nam và cộng sự, 1997) [11] Dù nguyên nhân nào thì tiêu chảy cũng dẫn đến triệu chứng chung là: tiêu chảy, mất nước, mất chất điện giải, suy kiệt, nếu trầm trọng dễ bị trụy tim mạch và có thể chết

Bằng nhiều nghiên cứu và thực nghiệm, người ta đã tìm ra những nguyên nhân chính gây hội chứng tiêu chảy ở bê nghé, bao gồm:

1.1.1 Nguyên nhân do vi khuẩn

Trong đường ruột của gia súc nói chung và của bê, nghé nói riêng có rất nhiều loài vi sinh vật sinh sống Chúng tồn tại dưới dạng cân bằng và có lợi cho cơ thể vật chủ Dưới tác động của sự bất lợi nào đó, trạng thái cân bằng của khu hệ vi sinh vật trong đường ruột bị phá vỡ, tất cả hoặc chỉ một loài nào đó sinh sản quá nhiều sẽ gây ra hiện tượng loạn khuẩn, hấp thu ở ruột bị rối loạn, hậu quả là bê, nghé bị ỉa chảy

Fetisova K, (1989) [51], Contrepois M, (1990) [43] đã nghiên cứu hội

chứng viêm dạ dày, ruột ở bê sơ sinh và vai trò của E coli và Salmonella

trong bệnh viêm dạ dày, ruột ở bê

Hồ Văn Nam và cộng sự, 1997) [11] khi nghiên cứu trâu bị ỉa chảy, đã

cho thấy: thấy số lượng vi khuẩn thường gặp trong phân trâu như: E coli,

Salmonella, Klebsiella, Staphylococcus, Streptococcus tăng lên rất rõ so với

bình thường, nhất là trâu già và nghé bị bệnh

Nguyễn Ngã và cộng sự (2000) [15] qua theo dõi 425 bê, nghé dưới 12 tháng tuổi tại 2 tỉnh Khánh Hoà và Ninh Thuận cho thấy có 115 bê, nghé bị ỉa chảy (26,71%) chủ yếu tập trung vào tháng 9-10 và tháng 4-5 và ở bê, nghé 1- 9 tháng tuổi Xác định lượng vi khuẩn trong phân bê, nghé ỉa chảy cho thấy nhiều gấp 3 lần so với bê, nghé khoẻ mạnh Phân lập và giám định vi khuẩn

trong 189 mẫu phân ỉa chảy cho thấy có 4 loài chính: E.coli, Salmonella,

Klebsienlla và Shigella, trong đó cao nhất là E coli (72,48%) và Salmonella

(51,32%)

Nguyễn Văn Quang (2004) [20] khi nghiên cứu vai trò của Salmonella và E coli trong hội chứng tiêu chảy của bò, bê đã cho biết khi bò, bê bị tiêu chảy E coli và Salmonella bội nhiễm với số lượng cao (vi khuẩn /1g phân)

E coli gấp 3 lần, Salmonella gấp 1, 98 lần

Theo Nguyễn Văn Sửu (2005) [23] khi nghiên cứu ở 3 tỉnh miền núi

phía Bắc đã kết luận: vi khuẩn E coli, Salmonella và Cl Perfringens thấy ở

bê, nghé bị tiêu chảy cao hơn bê, nghé ở trạng thái bình thường

Trương Văn Quang và cộng sự (2006) [21] khi bê nghé bị tiêu chảy thì

số lượng và tỷ lệ các chủng vi khuẩn E coli phân lập được mang các yếu gây

bệnh và sản sinh độc tố tăng rất cao so với bê nghé bình thường Điều này

khẳng định vi khuẩn E coli có vai trò đặc biệt quan trọng và thực sự là tác

nhân làm cho quá trình tiêu chảy ở bê nghé càng trầm trọng hơn

Phạm Hồng Ngân (2007) [14], ở bê dưới 6 tháng tuổi khi bị tiêu chảy:

61,35% số mẫu phân phân lập được Salmonella với số lượng rất lớn: 26,00 -

43,70 x 106 CFU/g phân

Như vậy, các loài vi khuẩn như: E coli, Salmonella, Clostridium perfringens

là những vi khuẩn thường gặp trong các loại vi khuẩn gây tiêu chảy cho bê, nghé

1.1.2 Nguyên nhân do vi rút

Ngoài nguyên nhân gây tiêu chảy do vi khuẩn còn có vi rút Đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định vai trò của một số vi rút: nhóm Rotavirut, Adenovirut, vi rút dịch tả trâu bò, vi rút viêm ruột bò (Bovine Rhinotracheitis Infection- IBR) Các vi rút này tác động gây viêm ruột và gây rối loạn quá trình tiêu hoá, hấp thu của bê, nghé và cuối cùng dẫn đến triệu chứng tiêu chảy

1.1.3 Nguyên nhân do ký sinh trùng

Ký sinh trùng ở đường tiêu hoá là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở gia súc Tác hại của chúng không chỉ cướp đi các chất dinh dưỡng của vật chủ mà còn tiết ra độc tố đầu độc vật chủ làm giảm sức đề kháng, gây trúng độc, tạo điều kiện cho các bệnh khác phát sinh Theo Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996) [8], chính phương thức sống ký sinh ở đường tiêu hoá của các loài giun sán đã làm tổn thương niêm mạc ruột, nhờ đó các loại mầm bệnh dễ xâm nhập gây viêm ruột, gây rối loạn quá trình tiêu hoá hấp thu, kích thích nhu động ruột, gây ỉa chảy và hiện tượng nhiễm trùng

Theo tài liệu của Lương Tố Thu (1996) (theo trích dẫn của Phạm Sĩ Lăng 2002) [10] kết quả khảo sát ở một số cơ sở chăn nuôi trâu bò sữa cho thấy có 7 loài cầu trùng là một trong những nguyên nhân gây ỉa chảy ở bê, nghé non

Phạm Sĩ Lăng và cộng sự (2002) [10] cho biết giun đũa Toxocara

vitulorum thường gây ỉa chảy phân trắng ở bê, nghé non 1-3 tháng tuổi Sán lá

gan Fasciola gigantica, Fasciola hepatica trong quá trình ký sinh cũng tiết

độc tố gây ỉa chảy cho bê, nghé non

Ký sinh trùng là nguyên nhân tiền phát cho nhiễm khuẩn và ỉa chảy ở bê, nghé

1.1.4 Ảnh hưởng của môi trường, khí hậu

Môi trường ô nhiễm là điều kiện để bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E coli phát thành dịch, ở những nơi nuôi bê nhốt thì bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E coli

phát nhiều hơn là những nơi thả ngoài đồng Bệnh có thể lây qua con vật mang trùng hoặc qua thức ăn như: bột thịt, bột xương của con vật ốm không tiệt trùng hoặc qua đệm lót chuồng, các loài gặm nhấm, chim nuôi, chim trời đều có thể là nguồn truyền bệnh Edward Aliame (1990) [46]

Phạm Sĩ Lăng, Phan Địch Lân (1997) [9] mùa xuân mùa có mưa phùn ẩm ướt và mùa hè nóng ẩm, bệnh ỉa chảy bê, nghé xảy ra nhiều có khi chiếm 40-50% tổng số trâu, bò ở cơ sở giống như một ổ dịch Các cơ sở chăn nuôi bò sữa, thường thấy bê non phát bệnh nhiều vào mùa hè thời tiết nóng ẩm, sau các trận mưa rào làm chuồng trại bãi chăn ẩm ướt và ô nhiễm

Tác nhân stress: là yếu tố nguy hại lớn, dù không phải là tác nhân đặc biệt Bê, nghé thường sinh ra trong vụ đông xuân, phải đương đầu với tác nhân lạnh ẩm Để chống lại tác nhân stress lạnh ẩm, các catecolamin sản sinh nhiều hơn, hoạt động hệ trục H-H-H (hypothalamus, hypophyis, hyponephra) thay đổi để tự điều chỉnh, nếu tác nhân stress tiếp tục kéo dài hoạt động hệ trục H-H-H đi vào rối loạn Các hormon kích thích viêm ở vỏ thượng thận tiết nhiều Các receptor thụ cẩm với hormon này có ở dạ dày, ruột và khớp Kết quả là dẫn tới viêm niêm mạc dạ dày, ruột, đây là cơ hội tốt nhất để các vi

khuẩn độc hại (E coli, Salmonella ) tấn công, lúc này gia súc non bị ỉa chảy

là không thể tránh khỏi (Phạm Khắc Hiếu, 1997) [6]

1.1.5 Ảnh hưởng của nuôi dưỡng không đúng kỹ thuật

Trong chăn nuôi bê, nghé phải thực hiện đúng quy trình chăm sóc nuôi dưỡng: bê, nghé phải phải bú đầy đủ sữa đầu, đảm bảo vệ sinh chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi Khi thay đổi thức ăn đột ngột, đặc biệt là tăng lượng đạm và chất béo làm cho bê, nghé rối loạn tiêu hoá, dẫn đến viêm ruột Thức ăn bị

ôi thiu, nấm mốc đặc biệt là nấm Candia albicans xâm nhập vào ruột cũng

gây tác hại tương tự như các vi khuẩn Ngoài tác hại phá hoại tổ chức dạ dày, ruột gây ỉa chảy, nấm còn tiết độc tố gây nhiễm độc toàn thân

* Như vậy, có thể nói hội chứng tiêu chảy của bê, nghé là một hội chứng bệnh lý rất phức tạp ở đường tiêu hoá, do nhiều nguyên nhân, nhiều yếu tố tác động Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi xin trình bày

vai trò của vi khuẩn E coli ở bê, nghé

1.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E.coli gây tiêu chảy ở bê, nghé 1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Từ lâu, trên thế giới đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về

vi khuẩn E coli, đặc biệt là trong thập kỷ 60, 70 của thế kỷ 20 và những năm

gần đây

Vi khuẩn E coli được bác sĩ nhi khoa người Đức Theodor Escherich (1857-1911) mô tả lần đầu tiên vào năm 1885, vi khuẩn E coli thuộc họ

Enterobacteriace Escherichia coli thường xuất hiện sớm ở ruột người và động

vật sơ sinh (sau khi đẻ 2 giờ) chúng thường cư trú ở phần sau của ruột, ít khi thấy ở dạ dày hay ruột non vô hoạt sống trong ruột già của người và động vật

Smith (1963) [77] đã cho thấy có hai loại độc tố là thành phần chính

của Enterotoxin được phát hiện ở các vi khuẩn E coli gây bệnh Hai loại đó

có sự khác biệt ở khả năng chịu nhiệt Độc tố chịu nhiệt ST (Heat-stabletoxin) chịu nhiệt ở nhiệt độ 100oC trong 15 phút Độc tố không chịu nhiệt LT (Heat-labile toxin) bị vô hoạt ở nhiệt độ 60oC trong 15 phút

Theo Smith và cộng sự (1968) [78] cho biết: trong nước bị ô nhiễm các loại vi khuẩn gây bệnh mang Plasmid kháng thuốc kháng sinh có thể sống rất

lâu Nước nhiễm E coli, Salmonella chủ yếu là do động vật thải trực tiếp hoặc

gián tiếp vào nước

Minhew và cộng sự (1978) [70] đã phát hiện có 48% số chủng vi khuẩn

E coli phân lập ở ngoài đường ruột có khả năng gây dung huyết, trong khi đó

vi khuẩn E coli phân lập từ phân chỉ có từ 8-10% các chủng gây dung huyết Evan và cộng sự (1981) [48] đã xác định được 48,0% chủng E coli phân lập ngoài đường ruột, 8-10,0% E coli phân lập từ phân, 42,0% E coli

phân lập từ bàng quang và 29,0% phân lập từ máu và có khả năng dung huyết Theo Sokol (1981) [80] vi khuẩn E coli từ cộng sinh thường trực trong đường ruột trở thành vi khuẩn gây bệnh vì trong quá trình sống vi khuẩn có thể tiếp nhận các yếu tố gây bệnh, bao gồm các yếu tố dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv) và yếu tố bám dính Có 5 yếu tố bám dính gồm F4 hay còn gọi là K88 (K88ac, K88ab, K88ad); F5 hay còn gọi là K99; F6 hay còn gọi là 987P Loại kháng nguyên F4 cho phép vi khuẩn có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô của toàn bộ ruột non Kháng nguyên F5, F6 chỉ kết dính ở tế bào biểu mô phần giữa và phần sau của ruột non Các kháng nguyên F4 và

F6 chỉ có ở vi khuẩn E coli gây bệnh trên lợn, F5 tìm thấy chủ yếu ở vi khuẩn E coli gây bệnh trên bê Các yếu tố gây bệnh này không được di

truyền bằng ADN của nhiễm sắc thể mà di truyền bằng ADN nằm ngoài nhiễm sắc thể được gọi là Plasmid Qua hiện tượng di truyền bằng tiếp hợp, chính yếu tố gây bệnh này đã giúp cho vi khuẩn bám dính vào được tế bào nhung mao của ruột non, xâm nhập vào thành ruột Từ đây, vi khuẩn thực hiện quá trình gây bệnh và sản sinh độc tố, gây phá huỷ tế bào niêm mạc ruột, gây dung huyết, nhiễm độc huyết

Felix B, (1983) [50] cho rằng Plasmid mang mã thông tin ngoài nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn Mã di truyền này có cấu trúc AND hình tròn hai nhánh xoẵn, có khả năng tái sinh Thông qua Plasmid, vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh, kháng tia tử ngoại và có khả năng tạo colicin

Tại Iraq, Abdul-rudha và cộng sự (1984) [34] cho biết khi nghiên cứu 103

bê bị tiêu chảy đã thấy 41 chủng E coli gây bệnh phân lập được thuộc 12 nhóm

huyết thanh khác nhau, trong đó chủ yếu là O9 và O20 và kháng nguyên K99

Acres (1985) [35] nghiên cứu nhiễm khuẩn E coli ở bê sơ sinh đã khẳng định: tiêu chảy do Enterotoxigenic E coli (ETEC) là bệnh nhiễm khuẩn của bê xảy ra từ ngày đầu sau sinh ETEC gây bệnh có độc lực giúp chúng phát triển ở ruột và tạo ra Enterotoxin

Gunther và cộng sự (1985) [57] đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi gia

súc đối với tiêu chảy của bê do vi khuẩn E coli gây ra, đã khẳng định sức đề kháng của bê đối với E coli tăng nhanh theo lứa tuổi

Al-Dabbas và Willinger (1986) [36] qua nghiên cứu tính chất của các

chủng E coli ở bê bị tiêu chảy từ năm 1970-1983 cho biết: trong 274 chủng

E coli phân lập được thì type O101 chiếm 59,1%; O9 chiếm 25,9%; O8 chiếm 6,6% và O35 chiếm 2,6% Có 12% số chủng phân lập được không xác định được type và 25,8% số chủng có độc tố

Theo Janke và cộng sự (1989) [65] tuổi của bê, nghé cảm nhiễm

Adherencia Enteropathogenic E coli (AEEC) từ 2 ngày đến 4 tháng tuổi, sự

cảm nhiễm với AEEC dường như là nguyên nhân duy nhất của bệnh tiêu chảy

và nguyên nhân tử vong của một số gia súc Hiện tượng xuất huyết đường ruột kèm theo các tổn thương biến đổi từ các đám nhỏ lác đác trên các vết thương lớn lan rộmg khắp màng nhày ruột là do quá trình bám dính của vi khuẩn gây ra

Trong năm 1986-1987, Fialova (1989) [51] đã phân lập được 400

chủng E coli từ bê mắc bệnh và hầu hết các bê này tiêu chảy trầm trọng,

viêm tĩnh mạch rốn, viêm khớp hoặc một số trường hợp bị nhiễm trùng máu Từ năm 1986-1987, Tominaga (1989) [83] đã xác định được các đặc

điểm sinh hoá và khả năng gây bệnh của E coli phân lập được từ bê bị bệnh

tiêu chảy Các đặc điểm sinh hoá đặc biệt của vi khuẩn này là kỵ khí, di động và sản sinh enzym, phân huỷ urea Các serotype huyết thanh của chúng là O5:

K Các chủng E coli không điển hình phân lập từ 2 bê, có sản sinh Verotoxin, nhưng không sản sinh ST và LT (Eterotoxin)

Otoi (1990) [73] đã nghiên cứu sự cảm nhiễm E coli có cấu trúc kháng

nguyên K99 ở bê và kết quả điều tra huyết thanh học cho thấy có 11 chủng E coli

mang K99 Các chủng E coli phân lập được từ phân của 50 bê bị tiêu chảy đã

xác định được khả năng sản sinh độc tố chịu nhiệt ST và không sản sinh độc tố không chịu nhiệt LT và có 9 chủng mang kháng nguyên O9, 2 chủng có kháng nguyên O8 Kết quả nghiên cứu huyết thanh học của 100 gia súc từ 92 trang trại cho thấy có 34 gia súc được kiểm tra sau 6-9 tháng có hiệu giá kháng thể với kháng nguyên K99 cao gấp 4 lần

Baljer và cộng sự (1990) [38], Janke và cộng sự (1990) [66] khi nghiên

cứu các chủng E coli tại Mỹ, Anh từ năm 1985-1988 đều đi đến kết luận: E coli

gây bệnh tiêu chảy ở bê chủ yếu đều cư trú ở đoạn xoắn ốc của kết tràng, chúng gây ra các tổn thương đặc biệt ở đây như viêm kết tràng, xuất huyết ở đại tràng Kết quả quan sát cho thấy có trên 40% bê và gần 90% gia súc cảm nhiễm là sơ sinh, tuổi trung bình là 11,8 ngày, xuất hiện hiện tượng viêm này

Baljer (1990) [38] bằng phương pháp kiểm tra tế bào nuôi cấy và xác

định ADN của E coli phân lập được ở bê bị tiêu chảy để xác định độc tố

Verotoxin do E coli này sản sinh ra

Fairbrother (1992) [49] căn cứ vào kết quả nghiên cứu các yếu tố

gâybệnh của từng chủng vi khuẩn E coli phân lập được từ các bệnh khác nhau, các chủng vi khuẩn E coli đã được phân loại theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sản sinh như: Enterotoxigenic E coli được ký hiệu là ETEC, Enterotoxinic E.coli được ký hiệu ETEEC, Enterotopathogenic

E coli được ký hiệu EPEC, Verotoxigenic E.coli được ký hiệu VTEC, Adherence Enterotopathogenic E coli được ký hiệu AEEC Từ đó xác định

các serotype mang các yếu tố gây bệnh đặc trưng cho từng loại vi khuẩn E coli trên từng nhóm gia súc khác nhau

Blanco (1993) [41] đánh giá vai trò của Enterotoxigenic (ETEC),

Verotoxigenic (VTEC) và Necrotoxigenic (NTEC) của vi khuẩn E coli trên bò

bị tiêu chảy, đã đi đến kết luận: bò đang là nguồn chứa đựng VTEC và đó là tác nhân gây bệnh cho con người Còn với ETEC đang là nguyên nhân không bình thường của bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E coli gây ra ở bò nuôi tại tây

bắc Tây Ban Nha Ngoài ra các kết luận của nghiên cứu cũng chỉ ra rằng

VTEC và NTEC mà E coli sản sinh ra CNF2 (nhân tố hoại độc tế bào) có thể

là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường của bò

Cray (1995) [45] nghiên cứu sự thải hồi của độc tố E coli O157: H7 theo phân và có sự biến động rất lớn trong số các gia súc trong cùng một nhóm tuổi Maria de Fatima Martins và cộng sự (2000) (dẫn theo Đỗ Ngọc Thuý,

2002) [31] khẳng định: Đã phát hiện các chủng vi khuẩn E coli kháng thuốc

với tỷ lệ và mức độ khá cao, có đến 50,5% số chủng đã kháng lại ít nhất 1 loại kháng sinh và 20,87% số chủng kháng lại 2 hay nhiều hơn các loại kháng sinh khác nhau

Bảng 1.1: Các serotype và yếu gây bệnh của vi khuẩnE coli ở bò, bê

KN bám dính

Serotype

Loại VK

E.coli

Sản sinh độc tố Tác giả năm công

bố STLTC

VTEC +

Gonzalez (1989)

[55] K O2; O103; O104;

Abdul-hoặc K99

Tiêu chảy trầm trọng, viêm tĩnh mạch rốn, viêm khớp, nhiễm trùng máu ở bê

[67]

hoặcH16

Tiêu chảy ở bò VTEC

Pohl (1997)

[75] O26; O103

Blanco (1993) [41] O1; O3; O15

O55;O88;O123

+

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Ở nước ta, bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E coli gây ra ở bê, nghé xuất hiện

rất lâu, bệnh đã được báo cáo có ở hầu hết các tỉnh, thành phố trong toàn quốc, bệnh đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng cho chăn nuôi trâu bò ở tất cả các hình thức và quy mô chăn nuôi Vì vậy, nghiên cứu bệnh tiêu chảy ở

bê, nghé do vi khuẩn E coli gây ra đã có nhiều nhà khoa học thú y trong nước

Theo Phạm Quang Phúc (2003) [18] khi nghiên cứu một số đặc điểm

dịch tễ học, vai trò của vi khuẩn E coli gây tiêu chảy ở bê, nghé tại tỉnh Thái

Nguyên đã cho thấy:

- Bê, nghé dưới một năm tuổi bị tiêu chảy và chết giảm dần theo tháng tuổi, tháng tuổi càng cao tỷ lệ bị tiêu chảy và chết càng thấp

- Bê, nghé bị tiêu chảy và chết vụ đông xuân cao hơn vụ hè thu Nguy cơ bị tiêu chảy và chết của bê, nghé thay đổi theo lứa tuổi và theo vùng

- Trong 213 chủng E Coli xác định được type có 25,82% là O101, 16,43% là O9, 15,96% là O20 và O8 chiếm 15,02%

Nguyễn Văn Quang (2004) [20] khi nghiên cứu vai trò của vi khuẩn

Salmonella và E coli trong hội chứng tiêu chảy của bò, bê ở các tỉnh Nam

Trung bộ, cho biết: khi bò, bê bị tiêu chảy E coli bội nhiễm với số lượng cao (số vi khuẩn /1gam phân) E coli gấp 3 lần

- Các chủng vi khuẩn E coli phân lập được từ bò, bê bị tiêu chảy sản

sinh ra độc tố ST là 83,3%, LT là 41,6% cả ST và LT là 41,6% 30% có khả năng dung huyết, 50% sản sinh F4 (K88) và 55% sản sinh F5 (K99)

Nguyễn Văn Sửu (2005) [23] khi nghiên cứu tình hình tiêu chảy của bê, nghé dưới 6 tháng tuổi tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc và xác định một số yếu tố

gây bệnh của vi khuẩn E coli, Salmonella và Clostridium perfringens phân

lập được kết luận:

- Tiêu chảy ở bê, nghé cao nhất là mùa Xuân: bê 23,61% nghé 21,38%

tiếp đó là mùa Hè và mùa Đông, thấp nhất là mùa Thu: bê 15,48% nghé 17,19% Tỷ lệ chết cao nhất vào mùa Đông: 9,00%, mùa Xuân: 7,32%, mùa Hè: 5,90% và thấp nhất là mùa Thu: 5,65%

- Bê, nghé bị tiêu chảy và chết giảm dần theo lứa tuổi

- Bê, nghé bị tiêu chảy số lượng vi khuẩn E coli gây bệnh tăng cao hơn

với trạng thái bình thường không tiêu chảy: trung bình tăng 81,04% ở bê và 184,62% ở nghé

Trương Văn Quang và cộng sự (2006) [21] khi nghiên cứu vai trò gây

bệnh của vi khuẩn E coli trong bệnh tiêu chảy của bê, nghé cho biết: khi bê,

nghé bị tiêu chảy thì số lượng và tỷ lệ các chủng vi khuẩn E coli phân lập

được mang các yếu tố gây bệnh và sản sinh độc tố tăng rất cao so với bê, nghé bình thường:

- Số lượng vi khuẩn /1g phân: bê gấp 2,99 lần, nghé gấp 2,79 lần

- Tỷ lệ các chủng mang kháng nguyên bám dính: bê gấp 3,4 lần, nghé gấp 2,9 lần

- Tỷ lệ các chủng có khả năng dung huyết: bê gấp 2,1 lần, nghé gấp 2,77 lần - Tỷ lệ các chủng sản sinh độc tố đường ruột: đối với độc tố chịu nhiệt (ST) ở bê gấp gấp 4,33 lần, nghé gấp 3,5 lần; đối với độc tố không chịu nhiệt (LT) ở bê gấp gấp 5,48 lần, ở nghé gấp 2,7 lần; cả 2 thành phần độc tố ở bê là 6,93 lần, nghé là 3,69 lần

1.3 Một số đặc tính của vi khuẩn E.coli

Trực khuẩn ruột già E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Escherichae, giống Escherichia, loài Escherichia coli Trong các vi khuẩn đường ruột, E coli phổ biến nhất còn có tên là Bacterium coli commune, Bacillus coli communis

do Theodor Escherich phân lập được đầu tiên vào năm 1885 từ phân trẻ em

Về mặt huyết thanh học, người ta chia các chủng vi khuẩn E coli thành

nhiều serotype khác nhau Cho đến nay đã phát hiện được 279 serotype, trong đó có 250 serotype có độc lực và có vai trò quan trọng trong một số bệnh của gia súc

Ở điều kiện bình thường, các chủng vi khuẩn E coli không gây bệnh,

khi điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, vệ sinh thú y kém, điều kiện ngoại cảnh

bất lợi, dẫn đến sức đề kháng của con vật giảm thì vi khuẩn E coli trở nên

cường độc và có khả năng gây bệnh

1.3.1 Đặc tính về hình thái

Theo Bergey's (1957) [39], Nguyễn Vĩnh Phước (1970) [19], Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1976) [4], Nguyễn Như Thanh và cộng sự (1997) [27]

vi khuẩn E coli là một trực khuẩn ngắn, kích thước 2-3 x 0,6 µm Có trong

môi trường nuôi cấy hai đầu tròn, có lông nên đa số là di động được, một số

không di động được Vi khuẩn E coli không hình thành nha bào, có thể có

giáp mô, bắt màu gram âm Trong cơ thể gia súc, vi khuẩn có hình cầu riêng rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Dưới kính hiển vi điện tử người ta quan sát

thấy những Pili - yếu tố mang kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coli

1.3.2 Đặc tính nuôi cấy

E coli trực khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5-

400C, nhiệt độ thích hợp là 370C trong 24 giờ, pH thích hợp là 7,2-7,4 nhưng

có thể phát triển ở pH từ 5,5-8 Vi khuẩn E coli phát triển dễ dàng trên các

môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản:

- Trên môi trường nước thịt: sau thời gian nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ

nuôi cấy, vi khuẩn E coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu

tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối

- Trên môi trường thạch thường: bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ vi khuẩn phát triển hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi lồi đường kính 2-3 mm Nếu nuôi lâu hơn, khuẩn lạc chuyển màu gần như màu nâu nhạt và mọc rộng ra Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng M (Mucoid) và dạng R (Rough)

- Trên môi trường thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn E coli

hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thước từ 1-2 mm, có thể có hoặc không có dung huyết tuỳ thuộc vào chủng

- Trên môi trường thạch peptone: sau 18-24 giờ bồi dưỡng trong tủ ấm 37oC, vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn ướt, màu xám, kích thước trung bình, mặt khuẩn lạc hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng bóng

- Trên môi trường thạch MacConkey: sau khi nuôi cấy 24 giờ ở tủ ấm 37oC, hình thành khuẩn lạc màu hồng, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

- Trên môi trường Endo: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có hoặc không có màu ánh kim

- Trên môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim

- Trên môi trường thạch SS (Salmonella Shigella): sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn E coli hình thành khuẩn lạc màu đỏ

- Trên môi trường thạch Brilliant Green Agar: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC hình thành khuẩn lạc dạng S (Smooth), màu vàng chanh

Vi khuẩn không mọc lên ở các môi trường Malasit và Mulerkauffmann, bị kiềm chế khi nuôi trong môi trường Wilson Blair

1.3.3 Đặc tính sinh hoá

- Đặc tính lên men các loại đường

Nhóm Escherichia coli gồm những trực khuẩn di động hoặc không di

động, có khả năng lên mên sinh hơi các loại đường Glucoza, Fructoza, Galactoza, Lactoza, Maniton, Mannit, Levuloza, Xyloza Lên men không chắc chắn với các loại đường Dulciton, Sacaroza, Lactose trong khi đó vi

khuẩn Salmonella thì không có đặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E coli và Salmonella (Nguyễn Như Thanh và cộng sự,

+ Vi khuẩn E coli có khả năng khử Nitrat thành Nitrit, khử Cacboxyl

trong môi trường Lysine decacboxylase

1.3.4 Sức đề kháng

Vi khuẩn E coli không hình thành nha bào nên có sức đề kháng yếu, bị

diệt ở nhiệt độ 55oC trong một giờ hoặc 60oC trong vòng 30 phút, đun sôi 100oC thì chết ngay Những chủng vi khuẩn E coli trong phân có xu hướng

đề kháng cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngoài ở môi

trường bên ngoài, các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4

tháng (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 1997) [27]

1.3.5 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E coli

Dựa vào cấu trúc bề mặt và cấu trúc bên trong tế bào vi khuẩn E coli, các

nhà khoa học đã xác định được cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E coli gồm

kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên lông H (flagellar), kháng nguyên vỏ K (Capsular) và kháng nguyên F (Fimbriae)

Hiện nay người ta xác định được 170 nhóm kháng nguyên O, 70 type kháng nguyên K, 56 type kháng nguyên H và một số nhóm kháng nguyên F Bertschinger H.U và cộng sự (1992) [40]

Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học đã phát hiện được các tính

chất phức tạp các yếu tố kháng nguyên của vi khuẩn E coli, bao gồm các loại

kháng nguyên sau:

1.3.5.1 Kháng nguyên O (Somatic - kháng nguyên thân)

Theo Zinner và Perter (1983) [86] đây là thành phần chính của vi khuẩn và cũng được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn Kháng nguyên O được coi như một ngoại độc tố, có thể tìm thấy ở màng ngoài vỏ của vi khuẩn và thường xuyên được giải phóng vào môi trường nuôi cấy Trong trạng thái chiết xuất tinh khiết, nó có bản chất là lypopolysaccharide, bao gồm 2 nhóm sau:

- Polysaccharide có nhóm hydro ở thành ngoài vi khuẩn, mang tính chất đặc trưng cho kháng nguyên từng giống

- Polysaccharide không có nhóm hydro nằm ở phía trong, không mang tính đặc trưng mà chỉ tạo sự khác biệt về khuẩn lạc (từ dạng S sang dạng R)

Kháng nguyên O có những đặc tính sau: chịu nhiệt (không bị phá huỷ khi đun nóng ở 100oC trong 2 giờ); các chất cồn, axit HCL nồng độ 1N chịu được 20 giờ Kháng nguyên O rất độc chỉ cần 1/20mg đã đủ giết chết chuột nhắt trắng sau 24 giờ, nhưng bị phá huỷ bởi Formol 0,5%

Kháng nguyên O được cấu trúc bởi các phân tử lớn với thành phần các phân tử gồm:

+ Protein: làm cho phức hợp mang tính kháng nguyên + Polyosit: tạo ra tính đặc hiệu của kháng nguyên + Lypit: kết hợp với Polyosit và là cơ sở của độc tính

Theo Medearis, 1968 (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Nội, 1986) [16], khi làm mất dần từng phân tử đường của chuỗi polysaccharide hay thay đổi vị trí của các phân tử này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn Tất cả kháng nguyên O đều cư trú ở bề mặt, do vậy có thể liên kết trực tiếp với hệ thống miễn dịch Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết gọi là “Hiện tượng ngưng kết O” Thân vi khuẩn ngưng kết với nhau dưới dạng những hạt khô, rất khó tan khi lắc

1.3.5.2 Kháng nguyên H (flagellar - kháng nguyên lông)

Kháng nguyên H được cấu tạo bởi thành phần lông vi khuẩn, có bản chất là protein giống như chất myosin của cơ và mang các đặc tính sau:

+ Bị phá huỷ ở 60oC trong 1 giờ

+ Dễ bị cồn, acid yếu và các enzym phân giải protein phá huỷ + Kháng nguyên H vẫn tồn tại khi sử dụng formol 0,5% xử lý

Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết, trong đó các vi khuẩn được ngưng kết lại với nhau nhờ lông dính lông Các kháng thể kháng H cố định trên lông và là cầu nối với các lông bên cạnh Kết quả tạo nên các hạt ngưng kết giống như cục bông nhỏ Các hạt ngưng kết rất dễ tan khi lắc vì lông rất nhỏ và dài, dễ đứt Các vi khuẩn di động khi tiếp xúc với kháng thể tương ứng và sẽ trở thành không di động

Kháng nguyên H của vi khuẩn E coli không có vai trò về bám dính,

đồng thời không có vai trò đáp ứng miễn dịch nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa lớn trong việc xác định giống, loài của vi khuẩn và bảo vệ vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào đại thực bào, giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại trong đại thực bào (Weinstein, 1984) [85]

1.3.5.3 Kháng nguyên K (Capsular - kháng nguyên bề mặt)

Kháng nguyên K còn gọi là kháng nguyên bề mặt, chúng bao quanh tế bào vi khuẩn và có bản chất hoá học là polysaccharide Vai trò của kháng nguyên K chưa được thống nhất lắm, có tác giả cho rằng nó không có ý nghĩa

về độc lực, vì vậy chủng E coli có kháng nguyên K cũng giống như chủng

không có kháng nguyên K (Orskov, 1980) [72], cũng có ý kiến cho rằng kháng nguyên K có ý nghĩa về độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước các yếu tố phòng vệ của cơ thể (Evan và cộng sự, 1981) [48] Phần lớn các ý kiến cho rằng kháng nguyên K có 2 nhiệm vụ chính:

+ Hỗ trợ phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O

+ Tạo ra hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại điều kiện ngoại lai và hiện tượng thực bào

Theo Nguyễn Như Thanh (1997) [27] kháng nguyên K gồm 3 loại kháng nguyên: L, A, B

+ Kháng nguyên L: ngăn không cho hiện tượng ngưng kết O của vi khuẩn sống xảy ra, khi đun 100oC trong 1 giờ kháng nguyên L bị phá huỷ

+ Kháng nguyên A: ngăn hiện tượng ngưng kết O, kháng huyết thanh A

trộn với E coli có kháng nguyên A gây hiện tượng phình vỏ Với nhiệt độ

120oC trong 2 giờ kháng nguyên A mới bị phân huỷ

+ Kháng nguyên B: gồm nhiều thành phần: B1, B2, B3, B4, B5 Kháng nguyên B của vi khuẩn sống xảy ra Đun 100oC trong 1 giờ kháng nguyên này bị phá huỷ một phần

Dựa vào cấu tạo kháng nguyên O, vi khuẩn E coli được chia làm nhiều nhóm, căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên O, K, H E coli được chia làm nhiều

type, mỗi type đều được ghi thứ tự các yếu tố kháng nguyên O, K, H

1.3.5.4 Kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ bọc)

Chất nhầy giáp mô phần lớn không có tính định hình vì khuyếch tán, thường được cấu trúc bởi hợp chất polysaccharide nhưng cấu trúc của

polysaccharide lại phụ thuộc vào từng họ vi khuẩn khác nhau thì cấu trúc khác nhau, do đó mà tính kháng nguyên của từng loại vi khuẩn khác nhau

Tuy nhiên ở vi khuẩn E coli nói riêng kháng nguyên giáp mô không đóng vai

trò quan trọng, vì vậy chủ yếu đi sâu tìm hiểu kháng nguyên K88, K99 (kháng nguyên Fimbriae) (Nguyễn Thị Nội, 1986) [16]

Một số vi khuẩn trong quá trình phát triển tiết ra một chất nhầy có khả năng tan vào nước ở một mức độ nhất định, chất nhầy này bao bọc xung quanh bên ngoài vách vi khuẩn giúp vi khuẩn chống lại sự tác động của môi trường ngoại cảnh, có thể quan sát thấy ở trạng thái ướt, dễ bị mất đi khi thay đổi điều kiện phát triển gọi là giáp mô (Capsul) (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 1997) [27]

1.3.5.5 Kháng nguyên F (Fimbriae - Kháng nguyên bám dính)

Ngoài lông ra, ở nhiều vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn E coli

nói riêng còn có những bộ phận khác hình sợi gọi là pili Pili hay Fimbriae có bản chất là protein bao phủ trên toàn bộ bề mặt vi khuẩn Dưới kính hiển vi điện tử, chúng có hình ảnh giống như một chiếc áo lông bao bọc xung quanh vi khuẩn, pili vi khuẩn đường ruột khác lông ở chỗ nó cứng hơn, không lượn sóng và không liên quan đến chuyển động Trước đây, kháng nguyên bám dính được ký hiệu là K (K88; K99), nay đổi là F (K88 =F4; K99 = F5; 987P = F6)

Một số kháng nguyên bám dính thường gặp ở các chủng vi khuẩn E coli phân

lập được từ gia súc ỉa chảy bao gồm F4, F5, F6, F18 và F41 Riêng đối với

giống E coli phân lập từ lợn thì kháng nguyên Fimbriae F4 (K88) còn ở bê, nghé là F5 (K99) đóng vai trò quan trọng nhất trong việc bám dính (Parry và Porter,1978) [74]

* Kháng nguyên F4 (K88)

Kháng nguyên F4 có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, đặc tính này không bị cản trở bởi manose (đề kháng với manose) Kháng nguyên này chỉ

có mặt ở các chủng vi khuẩn E coli phân lập từ phân lợn con bị ỉa chảy, đây

là một yếu tố độc lực đối với lợn và không có khả năng gây bệnh đối với loài gia súc khác Điều đó phụ thuộc vào receptor đặc hiệu, có trên bề mặt tế bào biểu mô ruột non của các loài gia súc khác nhau chỉ cho phép một số serotype

E coli nhất định nào đó gắn với kháng nguyên pili mà thôi Kháng nguyên F4

được sản sinh ở nhiệt độ 37oC, trong khi ở nhiệt độ phòng (20oC), vi khuẩn không có khả năng tạo kháng nguyên này Thông tin mã hoá cho tổng hợp cho kháng nguyên nằm ngoài nhiễm sắc thể, trên plasmid (Gyles, 1992) [58]

* Kháng nguyên F5 (K99)

F5 trước kia được cho là kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coli

bê, nghé và cừu Sự sản sinh của F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: tốc độ sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt độ và alanine trong môi trường, các gen mã hoá cho sự tổng hợp F5 nằm trên ADN của plasmid (Isaacson, 1983) [62]

Tuy nhiên hiện nay chúng cũng được tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các

chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy (Lindhl và cộng sự, 1990) [69]

* Kháng nguyên F6 (987P)

Giống như F4, F5, kháng nguyên F6 thường có mặt trong ở các nhóm có kháng nguyên O9, O20, O101, O149 Vật liệu di truyền má hoá quá trình tổng hợp kháng nguyên pili F6 cũng nằm ngoài nhiễm sắc thể, trên plasmid của tế bào vi khuẩn (Orskov, 1980) [72]

* Kháng nguyên F41

Những nghiên cứu đầu tiên về kháng nguyên F5 cho rằng, đây chỉ là kháng nguyên gồm 1 đơn vị, nhưng gần đây điện phân thấy rằng F5 có 2 đơn vị nhỏ, 1 đi về cực dương và 1 đi về cực âm Đơn vị đi về cực dương được cho là 1 Fimbriae riêng biệt đặt tên là F41 Khối lượng phân tử của F41 là 30,5 KDa (Jacobs và cộng sự, 1985) [63], (Raybould và cộng sự, 1987) [76]

Cox và cộng sự (1993) [44] đã nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về

khả năng mẫn cảm và sức đề kháng của lợn đối với vi khuẩn E coli có F41

Kết quả cho thấy các chủng có F41 bám vào lông nhung (với số lượng thấp) của 23 lợn trong số 30 lợn 4 đến 5 tuần tuổi được kiểm tra Tại đó tác giả cho thấy rằng, chỉ có lợn lớn tuổi hơn có sức đề kháng với sự bám dính của các

chủng E coli có F41 do các receptor tương ứng với F41 bị giảm đi

* Kháng nguyên F18

Kháng nguyên F18 đã được Rippinger và cộng sự (1995) (dẫn theo Đỗ

Ngọc Thuý, 2002) [31] mô tả là có mỗi quan hệ với các chủng vi khuẩn E coli

phân lập được từ bệnh tiêu chảy ở lợn trước cai sữa và bệnh phù đầu Dựa vào đặc điểm hình thái, huyết thanh học và đặc điểm kháng nguyên, người ta chia F18 thành 2 loại là: F18ab và F18ac F18ab thường thấy trong bệnh phù đầu,

trong khi đó F18ac phân lập được từ lợn con tiêu chảy trước cai sữa

1.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli

Vi khuẩn đường ruột nói chung hay vi khuẩn E coli nói riêng đều bao

gồm các yếu gây bệnh quan trọng sau:

1.4.1 Các yếu tố không phải là độc tố

1.4.1.1 Khả năng bám dính của vi khuẩn

Khả năng bám dính của vi khuẩn là yếu gây bệnh vô cùng quan trọng

để thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh của vi khuẩn E coli nói

riêng và vi khuẩn đường ruột nói chung Đó là quá trình liên kết vững chắc giữa bề mặt vi khuẩn với bề mặt tế bào vật chủ (Jones G, 1976) [67]

Ngày nay, bằng phương pháp chụp vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử và các phản ứng sinh hoá, PCR đã xác định cấu trúc vi thể thực hiện chức năng bám dính, giúp vi khuẩn cố định lên niêm mạc ruột, đó là các pili (fimbriae) Fimbriae bao gồm các đơn vị cấu trúc nhỏ, gọi là sợi bám dính có kháng nguyên gọi là kháng nguyên bám dính (kháng nguyên F) (Elsinghorst

E A and Weit J A, 1994) [47] Mỗi loại kháng nguyên bám dính có các quyết định kháng nguyên tương xứng, phù hợp với cấu trúc điểm tiếp nhận trên bề mặt biểu mô nhung mao ruột non

Lê Văn Tạo và cộng sự (1996) [25] đã nghiên cứu về cấu trúc Fimbriae và vai trò K88 trong quá trình gây bệnh, về tổ hợp các yếu gây bệnh có trong

một chủng E coli phân lập, trong đó nêu rõ vai trò của kháng nguyên K88 Đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định các kháng nguyên bám

dính của vi khuẩn E coli như: F4 có ở E coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con, F18 gây bệnh phù đầu ở lợn con sau cai sữa, F5 có ở E coli gây bệnh cho bê nghé, F41 có ở E coli gây bệnh cho trẻ em (Nagy, 1999) [71]

Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất hoá học, vừa mang tính chất sinh học và thực hiện theo 3 bước sau:

Bước1: vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, thực hiện quá

trình này đòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di động (Jones, 1983) [68] Sự liên kết này tăng lên khi bề mặt của vi khuẩn có các ion hoá học hoạt động mạnh, nhờ có ion hoá học này vi khuẩn mới được giữ lại trong lớp dịch nhầy của niêm mạc ruột

Bước 2: đây là quá trình hấp phụ, nó phụ thuộc vào đặc tính bề mặt của

vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính và thực hiện theo hướng thuận nghịch, dưới sự tác động của những lực tương hỗ khác nhau (Freter, 1981) [53] Việc chuyển động thẳng tiến của vi khuẩn cũng có thể giúp vi khuẩn cố định và bám chắc trên bề mặt tế bào tham gia vào sự hấp thụ của quá trình bám dính (theo Uhllman, 1982) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Nội, 1986) [16]

Bước 3: quá trình tác động tương tác giữa các yếu tố bám dính của vi

khuẩn với các điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào như màng glucoprotein của tế bào ruột non (nhung mao, tế bào biểu mô, các vi tế bào trên tế bào nhung mao), nó là hợp chất protein mạch thẳng, được tạo bởi những đơn vị tiểu

phần, số lượng tiểu phần quyết định trọng lượng, độ dài của yếu tố bám dính Lực lượng để giữ và liên kết giữa các tiểu phần trong yếu tố bám dính đến nay chưa rõ ( Isaacson, 1980) [61]

1.4.1.2 Khả năng xâm nhập của vi khuẩn

Sau khi bám dính, vi khuẩn sẽ xâm nhập vào bên trong lớp tế bào Tại

đây vi khuẩn E coli phát triển nhân lên với tốc độ lớn, sản sinh độc tố đường

ruột, gây phản ứng niêm mạc và đầu độc cơ thể

Khả năng xâm nhập của vi khuẩn đường ruột là một khái niệm để chỉ quá trình chưa được xác định rõ mà nhờ đó vi khuẩn đường ruột qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô, đồng thời sản sinh và phát triển trong lớp tế bào này Trong khi đó các vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào bảo vệ lớp màng nhầy hoặc đi qua được lớp hàng rào này sẽ bị vây bắt bởi tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc (Giannella, 1976) [54]

1.4.1.3 Khả năng dung huyết (Hly)

Vi khuẩn E coli phát triển trong tổ chức cơ quan vật chủ, F3+ được cung cấp cho sự dinh dưỡng phụ thuộc vào chất Siderofor do vi khuẩn sinh ra Chất này có khả năng phân huỷ sắt liên kết trong tổ chức của vật chủ thông

qua sự phá vỡ hồng cầu để vi khuẩn sử dụng dạng hợp chất HEM Vì vậy,

việc sản sinh ra chất dung huyết (haemolyzin) của vi khuẩn có thể coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn

Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn E coli nhưng quan trọng nhất là

kiểu  và  Trong đó kiểu  gắn với tế bào vi khuẩn do vậy mà không có tác dụng độc lực (Smith, 1963) [77]

Kiểu α hình thành là do một protein thẩm thấu qua lọc, không được gắn với tế bào vi khuẩn, được giải phóng vào môi trường nuôi cấy ở pha logarit của chu trình phát triển vi khuẩn và được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn

Các nhà khoa học đã chứng minh được mức độ gây chết của Haemolyzin trên chuột, trên thai trứng, gây hoại tử trên da thỏ, trên tế bào xơ thai gà, tế bào thận chuột Trọng lượng phân tử của Haemolyzin khoảng 300.000 Dalton, được cấu tạo chủ yếu là protein còn có cả hydrocacbon (Cavalieri, 1982) [42] Theo Smith (1967) [79] thì gen này nằm ở Plasmid được đặt tên là Hlyplasmid chỉ sản sinh Haemolyzin có trọng lượng phân tử 41 Md Gen trong ADN sản sinh Haemolyzin có trọng lượng phân tử 3,2 Md Những gen di truyền này không cố định ở plasmid hay ADN và không giống nhau ở các loại vi khuẩn

1.4.1.4 Khả năng kháng kháng sinh

Trong thực tế, để điều trị bệnh đường ruột người ta sử dụng nhiều loại kháng sinh, ngoài ra còn trộn chúng vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng trọng gia súc, gia cầm đã gây nên hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn đường ruột nói riêng đang ngày càng gia tăng làm hiệu quả điều trị thấp, thậm chí nhiều liệu pháp kháng sinh còn vô hiệu hoá hoàn toàn

Hosoda và cộng sự (1990) [59] nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn

E coli về các plasmid - R của vi khuẩn này phân lập được từ bê tiêu chảy Kết

quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng mỗi loại kháng sinh là: Tetracycline 59,7%, Chloramfenicol 21,0%, Streptomycin 52,9%, Sulfadimethoxine 37,8%, Kanamycin 45,4%, Aminobenzyn penicillin 43,7% và Nalidixic axit 28,6% Trong các chủng kháng thuốc có tới 53,7% số chủng mang các plasmid - R

Theo Lê Văn Tạo và cộng sự (1993) [24] đã xác định được khả năng

kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh phân trắng và tác

giả đi đến kết luận: khả năng kháng sinh được di truyền ngang và dọc bởi các loại plasmid

Bùi Thị Tho (1995) [30], cần có một chiến lược sử dụng thuốc kháng

sinh trong chăn nuôi và thú y hợp lý để ngăn chặn kịp thời hiện tượng kháng