Đánh giá khả năng phân hủy DDT và sinh laccase của nấm sợi bản địa phân lập từ đất ô nhiễm thuốc trừ sâu

Ảnh hưởng đến môi trường

DDT [ 1,1,1-trichloro-2,2-bis-(p-chlorophenyl)ethane] đã đƣợc tổng hợp vào năm 1874, nhƣng mãi đến 1930, Bác sĩ Paul Muller (Thụy Sĩ ) mới xác nhận DDT là một hóa chất hữu hiệu trong việc trừ sâu rầy và từ đó đƣợc xem như là một thần dược và không biết có ảnh hưởng nguy hại đến con người. Năm 1998, đại diện của hơn 92 quốc gia trên thế giới đã tụ họp tại Montreal đã bàn thảo về các biện pháp nhằm cấm sản xuất và sử dụng các hoá chất trên vì lý do tác hại của chúng do sự tích luỹ lâu dài trong không khí, lòng đất và nguồn nước, kết tụ vào các mô động vật- nguồn thực phẩm chính của loài người [7].

Ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Tính độc của DDT đã đƣợc biết đến thông qua các nghiên cứu rất kỹ lƣỡng ở trên các vi sinh vật, động vật không xương sống ở dưới nước, cá, lưỡng cư, động vật không xương sống ở trên cạn và các loài động vật có vú khác (chuột hang, thỏ v.v.). DDT là loại thuốc hóa học diệt côn trùng đƣợc sử dụng rộng rãi từ chiến tranh thế giới lần thứ II trên khắp thế giới và hàng triệu tấn đƣợc sản xuất, sử dụng trước đây hiện đang còn lưu giữ trong đất và sẽ tiếp tục phân tán trong môi trường.

Tình trạng ô nhiễm DDT trên thế giới

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của DDT trong các mẫu trầm tích với nồng độ cao do DDT đƣợc vận chuyển từ khu vực bị ô nhiễm đến Bắc cực và Nam cực. Lƣợng DDT cao nhất đƣợc tìm thấy ở gần khu vực nơi mà DDT vẫn đƣợc sử dụng, ví dụ ở bờ biển Arabian của ấn Độ.

Tình trạng ô nhiễm DDT ở Việt Nam

Hiện nay số thuốc DDT đã nằm phơi lộ trên mặt đất, một phần thuốc có thể bị phân hủy song phần lớn vẫn còn đó, chúng có thể khuếch tán vào không khí gây ô nhiễm môi trường và phân rã ngấm vào đất và các mạch nước ngầm gây ô nhiễm đất và nước trong khu vực. Tùy điều kiện địa hình, tính chất, quy mô của vùng ô nhiễm; tùy điều kiện kinh phí để áp dụng các quy trình xử lý khác nhau, có thể xử dụng các phương pháp như phương pháp hóa lý; phương pháp bao vây, cô lập nguồn ô nhiễm; hay phương pháp sinh học v.v.

Các phương pháp cơ, hóa lý

Ngoài ra DDT có thể được hấp thụ dễ dàng vào các mô mỡ và tích tụ trong cơ thể của các sinh vật sống, nồng độ chất này trở nên cao hơn theo chiều tăng của chuỗi thức ăn, đặc biệt là trong các loài sinh vật lớn và sống lâu. Chính vì những tính chất này mà việc loại bỏ, tiêu hủy DDT cũng nhƣ các chất bảo vệ thực vật trong danh mục cấm khác ngày càng trở nên cần thiết và cấp bách không chỉ riêng ở nước ta mà còn là vấn đề quan tâm của nhiều nước trên thế giới.

Phương pháp phân hủy sinh học

Ngoài ra trên thế giới việc ứng dụng hệ enzyme ngoại bào của vi sinh vật vào xử lý ô nhiêm đã có nhiều nghiên cứu, đây cũng là hướng có nhiều triển vọng do rút ngắn đƣợc thời gian xử lý và hiệu quả xử lý cao hơn so với khử độc bằng phân hủy sinh học thông thường. Trong đó laccase đƣợc tập trung nghiên cứu, enzyme này xúc tác quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic mạnh nhất trong nhóm enzyme phân hủy lignocellucose, laccase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghệ tẩy độc các hợp chất phenol, các dẫn xuất clo biphenyl, các loại thuốc nhuộm và các loại nước thải v.v.

Khả năng phân hủy DDT bởi vi sinh vật

Một số vi sinh vật chuyển hoá DDT thành DDD đã đƣợc công bố bao gồm Escheria coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Bacillus sp., “Hydrogenomonas” và một số nấm nhƣ Saccharomyces cerevisiae, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma [29,48].  Con đường chuyển hoá DDT bởi vi khuẩn theo cơ chế loại khử clo Trước tiên DDT bị phân hủy tạo DDMS, quá trình phân hủy tiếp theo sẽ là quá trình loại Cl tạo DDNU,sau đó sẽ là quá trình oxy hoá tạo DDOH, DDOH bị oxy hoá tiếp thành DDA và loại carbon thành DDM, DDM có thể đƣợc chuyển hoá tạo DBP hoặc tách một vòng thơm tạo p-chlorophenylaxetic acid (PCPA).

Các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến phân hủy sinh học DDT và các dẫn xuất của DDT

Hơn nữa, phốtpho nhƣ là một chất đệm pH để tạo pH thích hợp cho hoạt động của vi sinh vật nhằm tăng hoạt tính sinh học của chúng, do vậy làm tăng khả năng sống sót của vi sinh vật trong các môi trường có điều kiện khác nhau. Ngoài cơ chế phân hủy DDT và dẫn xuất của DDT bởi các enzyme nội bào tức là phải chuyển các chất độc qua màng tế bào thì cơ chế xúc tác phân hủy DDT bằng các enzyme ngoại bào cũng đã đƣợc quan tâm.

Định nghĩa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn.

Cấu trúc phân tử của laccase

Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase thường tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme nhƣ hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa. Các mediator thường phù hợp cho laccase là 3-Hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), N- hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid ( VLA) v.v [52].

Tính chất hóa sinh của laccase

Do vậy, hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase – cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxide. Laccase bền nhiệt nhất đƣợc phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryote ví dụ, thời gian bán hủy của laccase của Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70oC và của protein cotA từ loài Bacillus subtilis là 112 phút ở 80oC.

Sự phân bố và một số vi sinh vật sinh laccase

Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị giảm, nguyên nhân do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế laccase. Đối với các cơ chất không phải phenolic nhƣ ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2 – 3.

Gene mã hóa laccase

Như môi trường giàu nitơ làm tăng quá trình sinh tổng hợp laccase ở chủng Pleurotus sajor-caju, nhƣng chủng Lentinula edodes lại có khả năng sinh tổng hợp laccase t ốt hơn trên môi trườn g có hàm lượng nitơ thấp. Trong nghiên cứu mới nhất (2009) Xiaoshu Shao và cộng sự đã chỉ ra rằng, hoạt tính của laccase từ Shigella dysenteriae đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Wlac) tăng từ 24,4 UI/mg lên 52,9 UI/mg sau khi thay thế hai axit amin Glu 106 bằng Phe 106 trong chuỗi xoắn anpha (WlacS).

Ứng dụng của laccase

Trình tự gene mã hóa laccase có thể chia thành 3 nhóm chính là Ascomycete, Basidomycete và thực vật bậc cao. Tuy nhiên các nghiên cứu về gene mã hóa laccase ở prokaryote hiện nay không nhiều.

Lignin peroxidase và Mangan peroxidase .1 Lignin peroxidase

Enzyme này hoạt động nhƣ một phenoloxydase bằng cách sử dụng Mn3+/Mn2+ làm cặp oxy hóa khử trung gian, chúng tham gia phản ứng oxy hóa phenol và các hợp chất dẫn xuất phenol bằng cách tấn công trực tiếp vào cấu trúc vòng thơm chuyển hóa chúng thành những gốc có trọng lượng phân tử thấp theo con đương oxy hóa khử mangan gián tiếp. Tuy nhiên để xử lý ô nhiễm các chất POPs trong đó có DDT và các dẫn xuất thì Lac dễ thực hiện hơn do laccase xúc tác chỉ cần oxy phân tử.

Phân loại theo phương pháp truyền thống

Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất nhƣ nguồn cacbon và nitơ đƣợc sử dụng, nguồn năng lƣợng, cơ chế chuyển hóa năng lƣợng, kiểu dinh dƣỡng, các sản phẩm trao đổi chất, giới hạn về nhiệt độ và nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng, các hợp phần cấu tạo thành tế bào, giới hạn về pH tối thích cho sinh trưởng, các sắc tố quang hợp, các chất dự trữ, tính mẫn cảm với chất ức chế sinh trưởng v.v. Ngoài ra còn rất nhiều phương pháp phổ biến khác nữa như kiểm tra phản ứng sinh hóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau, các phản ứng miễn dịch của các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào như kháng nguyên O của lipopolysaccharid hay của bao nhày thường đƣợc sử dụng để phân biệt các chủng của một loài.

Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gene mã hóa 18S rRNA

Các đặc điểm hình thái như hình dạng, kích thước tế bào, màu sắc của khuẩn lạc, kích cỡ của tế bào vi sinh vật, khả năng bắt màu khi nhuộm Gram, các đặc điểm vi cấu trúc, cách thức chuyển động của tế bào, hình thức sinh sản, hình dạng và vị trí của nội bào tử trong tế bào, hình thái và vị trí bào tử trong tế bào mẹ v.v. Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU