2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nước nhiễm dầu
Làm giàu vi sinh vật lần một bằng cách hút 5 ml mẫu nước nhiễm dầu chuyển vào trong bình tam giác chứa 45 ml môi trường khoáng dịch có bổ
sung vitamin, vi lượng, cao men và PAH với nồng độ 50 ppm. Nuôi lắc bình 200 vòng/phút, ở 30o
C trong 5 ngày.
Làm giàu vi sinh vật lần 2 và lần 3 tương tự như mẫu làm giàu lần 1. Tiến hành pha loãng mẫu làm giàu lần 3, rồi gạt mẫu pha loãng trên môi trường muối khoáng có bổ sung vitamin, vi lượng, cao men và 100 ppm PAH. Mẫu được đem nuôi tĩnh ở 30oC. Chọn chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường có PAH rồi tiến hành nuôi lắc và làm sạch.
2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn
* Phƣơng pháp nhuộm Gram
Lam kính được rửa sạch bằng các dung dịch rửa, sau đó làm khô trên ngọn lửa đèn cồn. Lấy một giọt dịch sau 16 giờ nuôi nhỏ lên lam kính rồi dùng que cấy vô trùng dàn đều giọt dịch và cố định tế bào trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch tím kết tinh (Cystal violet) trong thời gian 1 phút. Rửa bằng nước cất rồi nhuộm tiêu bản với lugon trong thời gian 2 phút. Tiếp tục rửa tiêu bản bằng cồn 70 % khoảng 20 giây, sau đó rửa bằng nước sạch rồi để khô. Nhuộm tiếp với safarin trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất 2 lần và để khô tự nhiên.
Mẫu được quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100 lần dưới vật kính dầu. Nếu vi khuẩn bắt màu xanh tím thuộc loại Gram (+) còn bắt màu hồng là Gram (-). Vi khuẩn sử dụng làm đối chứng cho nhóm Gram (-) là E. coli và Gram (+) là Bacillus.
* Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét
Vi khuẩn được nuôi cấy 5-7 ngày trên môi trường muối khoáng chứa PAH. Dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc vô trùng để loại bỏ cặn, rồi ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Rửa lại sinh khối vi khuẩn bằng nước cất vô trùng 2 lần để loại các chất cặn bẩn trong môi trường nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được hòa tan trong glutaraldehyt 2,5 % trong đệm
photphat natri 100 mM (pH 7,2) trong 30 phút. Lấy một giọt tế bào đã xử lý đưa lên lưới đồng khoảng 1 phút để cho mẫu bám được vào lưới. Rửa nhẹ bằng nước sạch sau đó làm khô mẫu qua cồn 25, 50, 75, 100 % T-butyl. Sau đó làm khô mẫu bằng máy đông khô và phủ mẫu bằng vàng. Mẫu được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV. Hình thái tế bào vi khuẩn được chụp ảnh và đo kích thước. Cố định mẫu và soi kính được thực hiện tại Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng Hồ Chí Minh.
2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn
PAH được xác định bằng phương pháp đo quang phân tử, dựa trên sự dịch chuyển điện tử trên các orbital п của các nối đôi liên kết trong vòng thơm của PAH. Khả năng chuyển hóa PAH của vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được xác định trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS: GBC - CINTRA 4. 20 ml dịch nuôi cấy vi sinh vật sử dụng PAH được chiết bằng 180 ml acetone, sau đó lọc toàn bộ, thu dịch lọc đưa đi phân tích. Nồng độ của mỗi PAH trước và sau xử lý được tính toán dựa vào chiều cao peak hấp thụ tại các bước sóng, các PAH hấp thụ tại các bước sóng như: pyrene 275 nm; fluorene: 257,7 nm, fluoranthrene: 286,7 nm, phenanthrene: 292,6 nm, anthracene: 252 nm, naphthalene: 296 nm.
2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3-dioxygenase
2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo phương pháp của Sambrook, Russell [47]. Sambrook, Russell [47].
Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách lấy dịch nuôi cấy chuyển vào
ống li tâm rồi li tâm với vận tốc 6.000 vòng/phút ở 4o
C trong 10 phút.
Bƣớc 2: Hòa tan mẫu trong 400 µl đệm lysis rồi lắc kỹ cho tan tủa. Bƣớc 3: Bổ sung 50 µl lysozym và ủ ở 37o
C trong 30 phút.
Bƣớc 4: Bổ sung 20 µl protease K rồi ủ ở 56o
Bƣớc 5: Bổ sung phenol (tỷ lệ 1:1 v/v), lắc đều và ly tâm 12.000
vòng/phút trong 15 phút ở 4o C.
Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới, bổ sung CI (24:1)
với tỷ lệ 1:1 v/v, lắc nhẹ sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o C.
Bƣớc 7: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới và tủa DNA bằng
cồn tuyệt đối, giữ ở -20oC trong khoảng 2-3 giờ.
Bƣớc 8: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C, thu tủa DNA.
Bƣớc 9: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C
Bƣớc 10: Làm khô tủa và hòa tan tủa trong nước khử ion vô trùng
2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phương pháp PCR
Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phương pháp này tạo ra bước nhảy vọt trong kỹ thuật sinh học phân tử và được sử dụng phổ biến đến nay. Phương pháp này cho phép nhân lên số lượng lớn đoạn gen cần thiết trong thời gian ngắn.
Để thực hiện được phản ứng PCR cần có các nguyên liệu chính là đoạn DNA khuôn, cặp mồi đặc hiệu, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do, máy PCR v.v. * Thành phần phản ứng: Buffer Taq 10X 2,5 µl MgCl2 25 mM 3,0 µl dNTPs 2,5 mM 2.5 µl Mồi xuôi 20 µM 1 µl Mồi ngược 20 µM 1 µl
Taq DNA polymerase (5 U/µl) 0,2 µl
H2O 13,3 µl
DNA khuôn 1,5 µl
Đối với nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F và 1492R thì chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau:
Bƣớc 1 95oC trong 5 phút
Bƣớc 2 94oC trong 1 phút
Bƣớc 3 55oC trong 1 phút
Bƣớc 4 72o
C trong 2 phút
Bƣớc 5 Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4
Bƣớc 6 72oC trong 7 phút
Bƣớc 7 4o
C bảo quản mẫu
Trong trường hợp nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase sử dụng cặp mồi C23OF và C23OR với chu trình nhiệt dưới đây:
Bƣớc 1 94oC trong 7 phút
Bƣớc 2 94oC trong 1 phút
Bƣớc 3 55oC trong 1 phút
Bƣớc 4 72o
C trong 1 phút
Bƣớc 5 Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4
Bƣớc 6 72oC trong 10 phút
Bƣớc 7 4o
C bảo quản mẫu
2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng
Biến nạp: bộ Kit TA Cloning(R) của hãng InvitrogenTM
(Mỹ) đã được
sử dụng cho quá trình biến nạp.
Nguyên tắc: Đoạn DNA cần thiết nhân lên trong phản ứng PCR được sử dụng để gắn vào vector PCR 2.1 tạo thành vector mang đoạn gen 16S rRNA.
* Thành phần phản ứng:
Dung dịch đệm 1,0 µl
Vector pCR2.1 1,5 µl
Sản phẩm PCR (đoạn DNA cần thiết) 1,2 µl
Enzyme T4 ligase 1,0 µl
Nước 5,3 µl
Tổng thể tích 10 µl
Phản ứng gắn đoạn DNA cần thiết vào vector được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 14o
C, thời gian 18 giờ. Sau đó sản phẩm này được biến nạp vào tế bào khả biến (vi khuẩn E. coli INV F’).
* Quy trình biến nạp:
Bƣớc 1: Lấy 4 µl vector tái tổ hợp ở trên cho vào ống đựng tế bào khả
biến E. coli INV F’ rồi ủ trên đá 30 phút.
Bƣớc 2: Sốc nhiệt 42oC trong thời gian 45 giây.
Bƣớc 3: Đặt ống tế bào lên đá trong 2 phút.
Bƣớc 4: Thêm 250 µl SOC vào ống đựng tế bào rồi đem nuôi ở tủ lắc
37oC trong khoảng 1 giờ.
Bƣớc 5: Hút dịch nuôi gạt trên đĩa môi trường LB có bổ sung 50 mg/l
ampicilin, và 50 mg/ml X-Gal. Sau đó nuôi ở 37oC trong khoảng 16-18 giờ. Chọn các dòng khuẩn lạc màu trắng và một dòng khuẩn lạc màu xanh nuôi trên môi trường LB dịch. Trên môi trường LB có X-gal những khuẩn lạc màu trắng là những cá thể có thể mang DNA plasmid đã gắn đoạn DNA ngoại lai, những khuẩn lạc màu xanh là những cá thể không đính đoạn DNA plasmid và DNA ngoại lai.
* Quy trình tách chiết DNA plasmid:
Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách ly tâm dịch nuôi 6.000
Bƣớc 2: Bổ sung 100 µl Sol I rồi vontex kỹ cho tan hết tủa. Bƣớc 3: Thêm 200 µl Sol II và đảo nhẹ, ủ đá khoảng 5 phút. Bƣớc 4: Bổ sung 150 µl Sol III, đảo đều rồi ủ đá 10 phút.
Bƣớc 5: Bổ sung C:I theo tỷ lệ 1:1 v/v, lắc đều rồi ly tâm 12.000
vòng/phút trong 10 phút.
Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang ống mới và thêm 500 µl isopropanol
100 % tủa DNA, để khoảng 2-3 giờ.
Bƣớc 7: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút.để thu tủa.
Bƣớc 8: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10
phút.
Bƣớc 10: Làm khô tủa bằng cách ly tâm khô, sau đó tủa được hòa tan
trong nước khử ion.
* Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzym e EcoRI:
*Thành phần phản ứng:
Đệm EcoRI 10X 2,0 µl
Enzyme cắt EcoRI (5 U/µl) 0,2 µl
RNase (1 mg/ml) 0,5 µl
H2O 15,3 µl
DNA plasmid 2,0 µl
Tổng thể tích 20 µl
Trộn đều các thành phần phản ứng với nhau rồi đặt ống phản ứng vào bể ổn nhiệt ở 37o
C trong 16 giờ.
2.4.4.4. Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động
Xác định trình tự hai đoạn gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3- dioxygenase của vi khuẩn BQN31 trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer tự động theo phương pháp của Sanger. Trình
tự hai đoạn gen 16S rRNA và đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 được đăng ký trên GenBank.
2.4.4.5. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
Sử dụng chương trình Blast so sánh mức độ tương đồng giữa trình tự các đoạn gen mã hóa 16S rRNA, gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 với các trình tự gen liên quan trên ngân hàng gen. Tiếp theo, sử dụng phần mềm Clustal X, NJ để xây dựng cây phát sinh chủng loại đoạn gen mã hóa 16S rRNA, gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 và các đoạn gen đại diện.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH trƣờng chứa PAH
Từ mẫu ban đầu, vi sinh vật sử dụng PAH được phân lập theo phương pháp làm giàu trên môi trường muối khoáng chứa các nguồn PAH như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. VSV sử dụng PAH trong mẫu nước nhiễm dầu không đa dạng, trên mỗi loại PAH chỉ có từ 1 đến 4 loại khuẩn lạc, trong đó loại vi khuẩn có mầu trắng, trơn, lồi bóng và nhỏ chiếm ưu thế (Bảng 3.1). Khả năng phát triển của vi khuẩn được đánh giá sơ bộ bằng sự thay đổi mầu môi trường.
Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên môi trường khoáng có bổ sung các hợp chất PAH Môi trường chứa
PAH và hỗn hợp PAH Số lượng vi khuẩn phân lập
Phenanthrene 5
Anthracene 4
Fluorene + Fluoranthene 1
Pyrene + Chrysene 3
Naphthalene 2
Các số liệu trong bảng 3.1 cho thấy, từ mẫu làm giàu vi sinh vật trên hai nguồn phenanthrene và anthracene có số lượng vi khuẩn phân lập được nhiều nhất. Tổng số 15 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển tốt trên môi trường chứa các nguồn PAH khác nhau đã được phân lập và được ký hiệu từ BQN20-BQN34. Trong số 15 chủng vi khuẩn này, 4 chủng vi khuẩn BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 có khả năng phát triển mạnh hơn cả trên nguồn phenanthrene (Hình 3.1).
Môi trường trong các bình nuôi cấy vi khuẩn và các PAH có mầu vàng nâu. Trong số 15 chủng vi khuẩn, chủng BQN31 phân hủy phenanthrene mạnh nhất, môi trường đổi màu chỉ sau 32 giờ nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn còn lại chuyển hóa ở mức độ yếu hơn, sinh khối vi sinh vật ít hơn, môi trường không đổi mầu hoặc đổi màu sau nhiều ngày.
Hình thái khuẩn lạc của 4 chủng vi khuẩn sử dụng phenanthrene mạnh được trình bày tóm tắt ở Bảng 3.2. BQN30 BQN31 BQN32 BQN33 K K K K
Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng
BQN30, BQN31, BQN32, BQN33
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường muối khoáng chứa phenanthrene
BQN30 Tròn, trơn, trắng trong
BQN31 Tròn, trơn, bóng, lồi, trắng đục, ánh xanh
BQN32 Tròn, trơn, ánh vàng
BQN33 Tròn, trơn, bóng, ánh xanh
Trong số các chủng vi khuẩn kể trên, chủng vi khuẩn BQN31 có khuẩn lạc to, mọc dầy, dịch nuôi cấy chuyển màu nhanh hơn những chủng khác. Do đó, chủng BQN31 đã được chọn để nghiên cứu và xác định khả năng phân hủy PAH.
Sự tồn tại của các vi khuẩn bản địa sử dụng các loại PAH khác nhau cho thấy tiềm năng lớn trong việc áp dụng thành công công nghệ phân hủy sinh học xử lý ô nhiễm dầu và PAH.
3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31
Chủng vi khuẩn BQN31 được nuôi cấy trên môi trường muối khoáng bổ sung phenanthrene, nuôi ở nhiệt độ 30o
C. Khuẩn lạc chủng BQN31 sau 3-5 ngày nuôi cấy có hình tròn, trắng, trơn, lồi, bóng, có ánh xanh, kích thước khoảng 1-2 mm (Hình 3.2). Chủng BQN31 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, bề mặt tương đối nhẵn và kích thước khoảng 0,29 - 0,5 m x 0,95 - 1,1 m (Hình 3.3).
Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31
Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31
(Quan sát trên kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV với độ phóng đại
15.000 lần)
3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn BQN31
Trong môi trường tự nhiên, các PAH thường tồn tại ở dạng hỗn hợp và rất độc. Do đó, việc đánh giá khả năng phân hủy PAH bởi các chủng vi sinh vật bản địa có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình làm sạch ô nhiễm dầu nói chung và PAH nói riêng.
Sau 5 ngày nuôi lắc trên môi trường khoáng bổ sung các PAH khác nhau, mầu của môi trường chứa các vi sinh vật thay đổi rõ rệt, môi trường chuyển màu nâu vàng. Đặc biệt, trong các bình nuôi cấy chứa phenanthrene và naphthalene môi trường đục hơn và có nhiều sinh khối hơn (Bảng 3.3).
Bảng 3.3: Phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng BQN31
Nguồn PAH Phổ UV Hình ảnh minh họa
Phenanthrene
Naphthalene
Hiệu quả sử dụng một số loại PAH của chủng BQN31 được trình bày trong bảng 3.4.
ĐC
BQN31
ĐC
Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 Các PAH Hiệu suất
phân hủy (%) Màu môi trường nuôi cấy Ghi chú
Phenanthrene 60,24 vàng nâu
Fluorene 18,52 vàng nhạt
Fluoranthene vàng chanh không phân tích
Pyrene 18,75 nâu nhạt, ánh vàng
Naphthalen 69,38 màu vàng
Anthracene 25,9 màu nâu
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, chủng BQN31 sử dụng tất cả các PAH thử nghiệm. Đối với mỗi loại PAH, màu môi trường nuôi cấy có sự thay đổi khác nhau. Dựa trên kết quả phân tích, sau 5 ngày nuôi lắc ở nhiệt độ 30oC và 200 vòng/phút, chủng BQN31 có khả năng sử dụng 69,38% naphthalene, 60,24% phenanthrene, 18,52% fluorene, 25,9% anthracene và 18,75% pyrene với nồng độ ban đầu là 100 ppm mỗi loại PAH. Khả năng phân hủy của chủng BQN31 với naphthalen là cao nhất và fluorene là thấp nhất. Kết quả này chứng tỏ với các PAH ít vòng thì khả năng bị phân hủy sinh học càng mạnh.
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng phân hủy các loại PAH của các chủng vi sinh vật. Weissenfels và cộng sự (1991) đã công bố chủng Alcaligenes denitrficans WW1 phân hủy fluoranthene với tốc độ 300 mg/l mỗi ngày, đồng thời chủng này sử dụng các loại PAH khác như pyrene, benzo(a)anthracene theo cơ chế đồng trao đổi chất [53]. Chủng
Mycobacterium sp. PYR-1 phân hủy 74% hỗn hợp PAH gồm phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene và benzo(a)pyrene sau 7 ngày nuôi cấy. Trong đó 95% fluoranthren bị loại bỏ sau 24h nuôi cấy, tuy nhiên nồng
