Luận văn: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH doc
Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 78 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
78
Dung lượng
1,36 MB
Nội dung
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ TIẾN MẠNH PHÂNLẬP,TUYỂNCHỌNVÀNGHIÊNCỨUKHẢNĂNGPHÂNHỦYSINHHỌCHYDROCACBONTHƠMCỦAMỘTVÀICHỦNGVIKHUẨNĐƯỢCPHÂNLẬPTỪNƯỚCÔNHIỄMDẦUTẠIQUẢNGNINHLUẬN VĂN THẠC SĨ SINHHỌC Thái nguyên - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ TIẾN MẠNH PHÂNLẬP,TUYỂNCHỌNVÀNGHIÊNCỨUKHẢNĂNGPHÂNHỦYSINHHỌCHYDROCACBONTHƠMCỦAMỘTVÀICHỦNGVIKHUẨNĐƯỢCPHÂNLẬPTỪNƯỚCÔNHIỄMDẦUTẠIQUẢNGNINH Chuyên ngành: Sinhhọc thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINHHỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGHIÊM NGỌC MINH Thái nguyên - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lêi c¶m ¬n! Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS. Nghiêm Ngọc Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiêncứuvà hoàn thành luận văn. Trong quá trình nghiêncứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công nghệ Sinhhọc Môi trường, đặc biệt là KS. Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn Bá Hữu những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa họcvà Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập vànghiêncứutại trường Đại học Sư Phạm - Đại Học Thái Nguyên. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó! Hà nội, tháng 9 năm 2008 Học viên Lê Tiến Mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiêncứucủa riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiêncứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Lê Tiến Mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 1 DANH MỤC CÁC BẢNG 2 DANH MỤC CÁC HÌNH 3 MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8 1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 8 1.1.1. Tính chất hóa lý 8 1.1.2 Tính độccủa PAH và ảnh hƣởng của nó tới môi trƣờng sống 10 1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH 13 1.2.1. Hiện trạng ônhiễm PAH trên thế giới vàở Việt Nam 13 1.2.2. Nguồn gốc phát sinh 14 1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH 15 1.3.1 Phƣơng pháp hóa lý 16 1.3.2. Phƣơng pháp phânhủysinhhọc 16 1.4. Phânhủysinhhọc các PAH bởi visinh vật 19 1.4.1. Visinh vật phânhủy PAH 19 1.4.2. Cơ chế phânhủy PAH bởi VSV 21 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phânhủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 25 1.6. Các phƣơng pháp phân loại visinh vật 29 1.6.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống 29 1.6.2. Phƣơng pháp phân loại bằng sinhhọcphântử 30 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 33 2.1. Nguyên liệu và hóa chất 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1.1. Nguyên liệu 33 2.1.2. Hóa chất 33 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy 33 2.3. Máy móc và thiết bị nghiêncứu 34 2.4. Phƣơng pháp nghiêncứu 34 2.4.1. Phânlậpvisinh vật trên mẫu nƣớc nhiễmdầu 34 2.4.2. Nghiêncứumột số đặc điểm sinhhọccủamột số chủngvikhuẩn 35 2.4.3. Đánh giá khảnăng sử dụng PAH củavikhuẩn 36 2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3-dioxygenase 36 2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số củavikhuẩn theo phƣơng pháp của Sambrook, Russell 36 2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phƣơng pháp PCR 37 2.4.4.3. Quy trình biến nạp vàchọn dòng 38 2.4.4.4. Phƣơng pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động 40 2.4.4.5. Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinhchủng loại 41 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1. Phânlậpvàtuyểnchọnvikhuẩn có khảnăng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH 42 3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào củachủngvikhuẩn BQN31 44 3.3. Khảnăng sử dụng các loại PAH củachủngvikhuẩn BQN31 45 3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA củachủng BQN31 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR 49 3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từchủng BQN31 50 3.4.3 Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc thích hợp 52 3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA củachủngvikhuẩn BQN31 54 3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từchủng BQN31 57 IV. KẾT LUẬN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (cặp bazơ) USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ) LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) POP Persistent Organic Pollutant DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid VSV Visinh vật X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside μl Microlit μm Micromet PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa nhân) ppm đơn vịmộtphần triệu (mg/l) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Tính chất vật lý củamột số loại PAH 9 Bảng 1.2: Một số chủngvisinh vật có khảnăngphânhủy PAH 20 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại visinh vật 30 Bảng 3.1: Số lượng vikhuẩnphânlậpđược trên môi trường khoáng có bổ sung các hợp chất PAH 42 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủngvikhuẩn 44 Bảng 3.3: phổ UV đo khảnăngphânhủy các PAH củachủng BQN31 46 Bảng 3.4: Khảnăng sử dụng các PAH khác nhau củachủng BQN31 46 Bảng 3.5: Độ tương đồng củachủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế 56 Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3 dioxygenase củachủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế 60 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc hóa họccủamột số hydrocacbonthơm đa nhân (PAH) 8 Hình 1.2: Các con đường phânhủy PAH ởvisinh vật 21 Hình 1.3: Ba con đường phânhủy hiếu khí PAH chính củavikhuẩnvà nấm 22 Hình 3.1: Khảnăngphânhủy phenanthrene của 4 chủng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 43 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủngvikhuẩn BQN31 45 Hình 3.3: Hình thái tế bào vikhuẩn BQN31 45 Hình 3.4: DNA tổng số củachủng BQN31 50 Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA củachủng BQN31 50 Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 51 Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng được lựa chọn 52 Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 53 Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 củachủngvikhuẩn BQN31 53 Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA củachủng BQN31 54 Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen mã hóa 16S rRNA củachủng BQN31 vàmột số chủngvikhuẩn đại diện. Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000 nucleotide so sánh 55 [...]... tiêu nghiên cứu: Phânlậpvàtuyểnchọn ra đượcmột số chủng vikhuẩn có khảnăngphânhuỷ hợp chất hydrocacbonthơm Nội dung nghiêncứucủaluận văn bao gồm: 1 Phânlậpvàtuyểnchọnmột số loại vikhuẩn có khảnăngphânhủy PAH 2 Nghiên cứu, đánh giá khảnăngphânhủysinhhọc PAH củamột số chủng vikhuẩn đã đượcphânlập 3 Nghiêncứumột số đặc điểm hình thái tế bào củamột đại diện vikhuẩn có khả. .. catechol được nhiều nhà nghiêncứu quan tâm Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọnnghiêncứuvà thực hiện đề tàiPhânlập,tuyểnchọnvà nghiên cứukhảnăng phân hủysinhhọc hydrocarbon thơmcủamộtvài chủng vikhuẩn được phânlậptừnướcônhiễmdầutạiQuảngNinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 7 Khoa Sinh -... và các điều kiện sống thích hợp Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phânlập những chủngvisinh vật có khảnăng sử dụng PAH, nghiêncứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa củachúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu củachúngtừ đó ứng dụng cho vi c kích thích hoạt động sống của tập đoàn visinh vật bản địa trong vi c phânhủysinhhọc PAH tại vùng ônhiễm Để tăng cường quá trình phânhủysinh học, vi c... trọng phânhủy PAH và các chất ônhiễm trong môi trường đất [27] Thống kê ở bảng 1.2 cho thấy, visinh vật phânhủy PAH thuộc nhiều nhóm visinh vật khác nhau [3], [6], [11], [27], [33], [42], [51], [60], [58], [61], [62] Các visinh vật có khảnăng chuyển hóa PAH phần lớn thuộc vi khuẩn, vikhuẩn lam vàmột số vi tảo [16], [38], [58], [39], [60] Bảng 1.2: Một số chủngvisinh vật có khảnăngphân hủy. .. thái sinh trưởng tốt trước khi các visinh vật bản địa kịp thích nghi, tấn công và làm thay đổi cấu trúc cơ chất Tuy nhiên, vi c lên men visinh vật với khối lượng lớn là điều không dễ dàng và vô cùng tốn kém, mặt khác cũng không đảm bảo visinh vật giữ nguyên được các đặc tính phânhủyônhiễm [26], [27] 1.4 Phânhủysinhhọc các PAH bởi visinh vật 1.4.1 Visinh vật phânhủy PAH Hiện nay, có nhiều nghiên. .. vậy, công nghệ phânhủysinhhọc đã trở thành công nghệ thân thiện với môi trường Phương pháp phânhủysinhhọc đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiêncứuvà áp dụng trong những năm gần đây và cũng đã đạt đượckhá nhiều thành tựu Công nghệ sinhhọc đảm bảo an toàn cho môi trường hơn tất cả các công nghệ khác Đặc biệt, trong điều kiện sinh thái đa hệ, vi c áp dụng công nghệ phânhủysinhhọc PAH... có nhiều nghiêncứu về khảnăngcủavisinh vật sử dụng các PAH có trọng lượng phântử thấp như naphthalene, phenanthrene và anthracene Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiêncứu về tiềm năngphânhủy các PAH có trọng lượng phântử cao như chrysene và benzo[a]pyrene [16] Visinh vật phânhủy PAH phân bố rộng rãi trong tự nhiên Số lượng các visinh vật có khảnăngphânhủy PAH tại các vùng ônhiễm nhiều hơn... Trọng lượng phântử vào khoảng 128 – 278 g/mol (Hình 1.1) Hình 1.1: Cấu trúc hóa họccủamột số hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) PAH là những chất kỵ nướcKhảnăng gây ônhiễm môi trường tùy thuộc khảnăng hòa tan củachúng trong môi trường nước [16], [48] Đặc điểm về khảnăng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng đến khảnăng phân tán củachúng trong khí quyển, thủy quyển vàsinh quyển... tới 31 mg/l Nếu khảnăng hòa tan trong nướccủa PAH thấp, hay hệ số hấp phụ cao sẽ dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích, do đó ảnh hưởng rất nhiều tới khảnăngchúng bị phânhủysinhhọc bởi visinh vật [10] Ngược lại, khảnăng hòa tan trong nướccủa PAH cao thì khảnăng bị phânhủy bởi visinh vật cũng cao Điều đó cho thấy khảnăng hòa tan trong nướccủa các PAH có... truyền bổ sung vào các môi trường bị ônhiễm Tuy nhiên, vẫn còn có những khó khăn trong vi c bổ sung visinh vật vào các nơi bị ônhiễm do chi phí lớn; hiệu quả phânhủy nhiều khi không cao do nhiều nguyên nhân (sự cạnh tranh củavisinh vật, độ độccủa môi trường; sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng vàvi lượng cần thiết cho hoạt động phânhủycủavisinh vật) [26] Kích thích sinhhọc là quá . PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH Chuyên ngành: Sinh học. tiêu nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm. Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: 1. Phân lập và tuyển chọn một. loại vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH. 2. Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập. 3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một