Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh vì phân lập gen chaperonin liên quan đến tính chịu hạn của một số giống đậu tương địa phươngtrồng ở vùng tây nguyên

Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh vì phân lập gen chaperonin liên quan đến tính chịu hạn của một số giống đậu tương địa phươngtrồng ở vùng tây nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐINH THỊ NGỌC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH

VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐINH THỊ NGỌC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH

VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC MÃ SỐ: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS CHU HOÀNG MẬU

Thái Nguyên- 2008

MU1 Lý do ch n tài

u t ng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghi p ng n ngày, có giá

tr kinh t và hàm l ng dinh d ng cao H t u t ng ch a 30 % - 56% protein,ch a nhi u lo i axit amin không thay th (lysin, tryptophan, metionin, cystein,leucin…), 12 %-25% lipit, và các vitamin (B1, B2, C,D, E, K…) c n thi t cho cth ng i và ng v t M t c tính quan tr ng n a c a cây u t ng là có n t s n

r t o kh n ng c nh nit không khí, vì v y tr ng u t ng góp ph n c i t ot và b o v môi tr ng [20].

S n xu t u t ng phát tri n m nh t i M , Brazil, Argentina, Trung Qu c vànhi u n c khác S n l ng u t ng trên th gi i t hàng tr m tri u t n/ n m Trongkhi ó, Vi t Nam s n l ng m i ch t tr m nghìn t n/ n m, u ó ch ng t tìnhhình s n xu t u t ng n c ta so v i khu v c v n còn m c th p thúc y s nxu t u t ng v n quan tr ng là ch n t o c nh ng gi ng không ch cho n ngsu t cao, ph m ch t t t mà còn ph i thích h p v i u ki n a hình khí h u.

c ta có h sinh thái r t a d ng, khí h u gi a các vùng, mi n l i khônggi ng nhau a hình có n 3/4 là i núi th ng có mùa khô hanh mi n B c, mùakhô nóng Tây Nguyên…Nh ng n m g n ây di n bi n khí h u ngày càng ph c t p,ng m a phân b không u gi a các vùng và gi a các th i k trong n m nên h nhán và n ng nóng kéo dài u t ng là cây t ng i m n c m v i u ki n ngo ic nh và thu c vào nhóm cây ch u h n kém, công tác ch n t o các gi ng u t ng cóki u gen ch ng ch u ngày càng c quan tâm nghiên c u [10], [18], [23].

Vi t Nam, ngu n gen c a cây u t ng r t a d ng và phong phú; ngoàinh ng gi ng nh p n i, gi ng l i t o và gi ng t bi n, còn có t p oàn các gi nga ph ng Nh ng gi ng u t ng a ph ng th ng có n ng su t th p, nh ngl i có ch t l ng h t t t và kh n ng ch ng ch u cao v i các u ki n b t l i c ango i c nh c tính ch u nóng, ch u h n c a các gi ng u t ng này ã cnhi u nhà khoa h c quan tâm nghiên c u [18], [24], [31], [36] Tuy nhiên, các tácgi m i ch t p trung nghiên c u các gi ng u t ng tr ng các t nh trung du,

ng b ng và các t nh vùng núi phía B c, trong khi ngu n gen c a cây u t ngcác t nh khu v c Tây Nguyên n c ta c ng r t a d ng, có nhi u c tính quý còn ít

c quan tâm.

Tây Nguyên là vùng t v i hai mùa rõ r t, mùa m a và mùa khô, mùa khôth ng kéo dài gây thi u n c tr m tr ng d n n n ng su t, s n l ng cây tr nghàng n m gi m m nh trong ó có cây u t ng Vì v y, vi c ánh giá, tuy n ch ncác gi ng u t ng có n ng su t và ch t l ng, có kh n ng ch ng ch u h n caolàm v t li u ch n gi ng là yêu c u th c ti n t ra cho ngành ch n gi ng u t ng vùng t Cao Nguyên này T nh ng lý do trên chúng tôi ã ti n hành tài:

“Nghiên c u c m hóa sinh và phân l p gen chaperonin liên quan n tínhch u h n c a m t s gi ng u tng a phng tr ng vùng Tây Nguyên”

nh m ánh giá ch t l ng h t và tìm hi u gen liên quan n kh n ng ch u h n c acây u t ng trong i u ki n sinh thái khu v c Tây Nguyên.

2 M c tiêu nghiên c u

- So sánh ch t l ng h t c a m t s gi ng u t ng tr ng t i khu v c Tây Nguyên.- Nghiên c u kh n ng ch u h n, c s hóa sinh và phân l p gen liên quann kh n ng ch u h n c a m t s gi ng u t ng tr ng t i khu v c Tây Nguyên.

3 N i dung nghiên c u

- Phân tích c m hình thái, kh i l ng và kích th c h t c a m t sgi ng u t ng tr ng t i Tây Nguyên.

- Xác nh hàm l ng protein, lipit trong h t c a các gi ng u t ng nghiên c u.- Phân tích thành ph n axit amin trong protein h t c a các gi ng u t ng- Xác nh hàm l ng protein tan, ho t c a proteaza giai n h t n y m m.- ánh giá kh n ng ch u h n c a các gi ng u t ng giai n cây nontrong i u ki n h n nhân t o.

- Xác nh hàm l ng prolin giai o n cây non 3 lá th i m tr c và saukhi x lý b i h n.

- Nhân, tách dòng và c trình t gen chaperonin liên quan n tính ch u h nc a m t s gi ng u t ng tr ng t i Tây Nguyên.

Chng 1

NG QUAN TÀI LI U

1.1 CÂY U TNG

1.1.1 c m sinh h c c a cây u tng

u t ng có tên khoa h c là Glycine max (L) Merrill, có b nhi m s c th

2n = 40, thu c thân th o, h u (Fabaceae), h ph cánh b m (Papilionoidea).u t ng có ngu n g c t các t nh phía B c và ông B c Trung Qu c, các vùngk c n c a C ng hòa liên bang Nga, Tri u Tiên và Nh t B n.Các gi ng u t ng

ang tr ng t i n c ta c du nh p t Trung Qu c t lâu i [13].

V hình thái, cây u t ng các b ph n chính là r , thân, lá, hoa và qu R u t ng có r c c g m r cái và r bên, trên b r c a cây u t ng có

nhi u n t s n ch a vi khu n Rhizobium japonicum có kh n ng c nh nit t khítr i cung c p m cho cây, có vai trò c i t o t [9].

Thân u t ng có hình tròn, thân non có màu xanh ho c tím, khi qu chínthì thân ng sang màu vàng nâu.

Lá u t ng g m 3 lo i lá: lá m m, lá n và lá kép (có 3 lá chét ôi khi có4-5 lá chét).

Hoa m c thành chùm nách lá, m i chùm hoa có t 10-15 hoa, có màu tr ngho c tím, hoa u t ng t th ph n hoàn toàn Qu có th th ng ho c cong cónhi u lông, m i qu ch a t 1-5 h t nh ng thông th ng là 2-3 h t.

H t u t ng không có n i nh mà ch có m t l p v bao quanh phôi và 2 lám m H t có hình tròn ho c hình b u d c, tròn dài, tròn d t, v h t u t ng có màunâu, en, vàng, xanh Kh i l ng h t r t a d ng t 20-400 mg/h t

n c vào th i gian sinh tr ng c a cây u t ng ng i ta chia làm 3 lo i:Gi ng chín s m (75-85 ngày), gi ng chín trung bình (80-100 ngày), và gi ng chínmu n (110-120 ngày) Th i gian sinh tr ng là m t y u t quan tr ng l a ch ncây tr ng luân canh t ng v [28].

1.1.2 Giá tr kinh t c a cây u tng

u t ng là cây tr ng có giá tr kinh t cao, là cây công nghi p, cây th cph m, v a là cây c i c i t o t V i u th ng n ngày, tr ng c nhi u v trongm, có th tr ng thu n, tr ng xen, luân canh g i v , tr ng c nhi u vùng sinhthái khác nhau, vì v y sau lúa và ngô, cây u t ng có m t vai trò c bi t quantr ng trong n n nông nghi p nhi t i.

V m t dinh dng, h t u t ng có thành ph n dinh d ng cao ch a 56% protein, 12-25% lipit và 20% gluxit [20], là ngu n axit amin, vitamin (B1, B2,C, D, E) r t quan tr ng i v i i s ng c a con ng i Protein u t ng còn cótác d ng h u hi u gi m cholesterol trong máu, gi m thi u nguy c các b nh liênquan n tim m ch, chúng c ng ng n c n s phát tri n các m m ung th , ng n ng ab nh th n, b nh ti u ng, b nh x p x ng

30-Trong công nghi p, s n ph m t cây u t ng c s d ng r t a d ngnh dùng tr c ti p h t khô ho c ch bi n thành u ph , ép thành d u u t ng,làm bánh k o, s a u, n c gi i khát, n c ch m áp ng nhu c u m trongkh u ph n n hàng ngày c a ng i c ng nh gia súc.

nh ng qu c gia phát tri n, ng i ta còn dùng u t ng vào các k nghkhác nh bi n ch cao su nhân t o, m c in, s n, xà phòng, ch t t nhân t o, ch tnhiên li u l ng, d u làm tr n trong k ngh hàng không.

Trong tr ng tr t, cây u t ng còn có tác d ng c i t o t, t ng n ng su tcác cây tr ng khác u này có c là do ho t ng c nh N2c a loài vi khu n

Rhizobium c ng sinh trên r cây Nh kh n ng c nh m nên sau m i v thuho ch thành ph n hóa tính c a t tr ng c c i thi n rõ r t, l ng m trong tt ng và khu h vi sinh v t hi u khí trong t ng t ng Do ó, có l i i v i câytr ng khác và sau khi thu ho ch toàn b thân lá, r , lá ph l i b m t t v a có tácd ng che ph ch ng xói mòn, v a là ngu n h u c giàu m c i t o t.

1.1.3 Tình hình s n xu t u tng trên th gi i và Vi t Nam

Trên th gi i (tính n tháng 4/ 2006), có 78 n c tr ng u t ng v i di ntích là 91,3 tri u ha; n ng su t 22,9 t / ha, s n l ng t 236,1 tri u t n Các n cs n xu t u t ng ng u th gi i là: M , Brazil, Argentina và Trung Qu cchi m kho ng 90-95% t ng s n l ng u t ng trên toàn th gi i [45].

Nh v y, có th th y u t ng chi m m t v trí quan tr ng trong n n kinh tth gi i không ch do c gieo tr ng trên di n tích l n 78 n c, mà h t u t ngcòn c s d ng r ng rãi làm th c ph m và nguyên li u cho công nghi p.

B ng 1.1 S n l ng u t ng c a m t s n c trên th gi i niên v 2006 – 2007(Theo Oil World); n v tính: tri u t n

Vi t Nam, trong vòng h n 20 n m qua (t 1985- 2006) di n tích, n ngsu t và s n l ng u t ng ã không ng ng t ng, c bi t trong nh ng n m g nây: th m 2000 di n tích tr ng u t ng là 124100 ha n n m 2005 t ng lên203600 ha, n ng su t t t 12000 t /ha n m 2000 lên 14,300 t /ha n m 2005 vàs n l ng t 147300 t n n m 2000 lên 290600 t n n m 2005 [21].

B ng 1.2: Di n tích, n ng su t, s n l ng u t ng c n c qua các n m(Ngu n: T ng c c Th ng kê, 2006)

Di n tích (1000 ha) 124,1 140,3 158,6 165,6 182,5 203,6 185,8ng su t (t /ha) 12,0 12,4 13,0 13,3 13,3 14,3 13,9S n l ng (1000 t n) 149,3 173,7 205,6 219,6 242,1 290,6 186,9

Hi n nay cây u t ng c tr ng c 7 vùng nông nghi p trên c n c,do i u ki n sinh thái c a m i vùng khác nhau nên có s khác bi t khá rõ v di ntích tr ng, n ng su t và s n l ng [21].

B ng 1.3 Di n tích, n ng su t và s n l ng u t ng c a 7 vùng n m 2005

(1000 ha)

ng su t(Kg/ha)

S n lng(1000 t n)

M c dù, s n l ng u t ng n c ta có t ng nh ng so v i các n c trênth gi i và trong khu v c n ng su t c a ta v n còn th p, và c bi t trong nh ngm g n ây di n tích, n ng su t và s n l ng u t ng c a n c ta gi m i áng

k N m 2005 di n tích t 203600 ha gi m xu ng ch còn 185800 ha n m 2006 vàs n l ng gi m t 290600 t n n m 2005 xu ng còn 186900 t n n m 2006.

Nguyên nhân chính là do u t th p, ch a có b gi ng phù h p, ch a ápd ng k th t tiên ti n Vì v y, nghiên c u c i ti n các c m nông sinh h c c acác gi ng a ph ng và t o gi ng m i có n ng su t cao, thích nghi v i u ki nsinh thái nh ng vùng khác nhau b ng ph ng pháp truy n th ng k t h p v i hi ni s áp ng c yêu c u c a th c ti n t ra và ó c ng là chi n l c quantr ng v s phát tri n cây u n c ta.

1.1.4 Thành ph n hóa sinh h t u tng

Trong h t u t ng có các thành ph n ã bi t tính theo t l protein 56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mu i khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, cácvitamin A, B1, B2, D, E, F, các men, sáp, nh a, cellulose Ngoài ra, h t u t ngcòn có các axit amin c b n isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin,tryptophan, valin [20].

30-Protein là thành ph n ch y u trong h t u t ng Chúng chi m kho ng30%-55% kh i l ng khô c a h t D a vào h s l ng, ng i ta chia protein c a h tu t ng thành 3 lo i: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin Nh ng lo iprotein chính trong h t u t ng là: protein d tr (chi m 70% t ng s protein),các enzim, các ch t c ch proteaza và lectin Thành ph n c a protein g m cóalbumin (9,5%), globulin tan trong n c (75,8%), globulin ch tan trong NaCl là3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [18], [25].

Thành ph n axit amin c a h t u tng: Protein c a các lo i u ,nh t là u t ng, c xem là protein có ch t l ng t t nh t trong các lo i proteinth c v t Chúng có ch a t t c các axit amin không thay th H n n a protein c acây h u còn có hàm l ng lysin r t cao so v i protein t các lo i ng c c.Tuyv y, hàm l ng các axit amin có ch a g c SH (metionin, cystein) còn th p [8], [40].

Hàm lng lipit trong u t ng khá cao chi m kho ng 12-25% kh ing khô, trong ó hàm l ng các axit béo no th p, kho ng 13%, không cócholesterol, 30% là các axit béo ch a no m t n i ôi L ng axit béo không no c n

thi t: axit linoleic 50%, và c bi t có 7% axit anpha linolenic là ngu n cung c paxit béo chu i m ch dài omega 3 quan tr ng cho c th nh DHA (DocosaHexaenoic Acid) và EPA (Eicosa Pentaenoic Acid ) [44].

Ch t l ng lipit c a h t u t ng r t t t, cho nên nó c s d ng r ng rãitrong công nghi p ch bi n th c ph m H t u t ng còn có các lo i vitamin tantrong lipit, c bi t là vitamin E = 200 mg/100g lipit [8], ngoài ra trong h t ung còn ch a m t s ch t khác nh hydrat cacbon, mu i khoáng, axit nucleic,kích thích sinh tr ng

Tóm l i, h t u t ng có giá tr dinh d ng cao.Trong ó, hàm l ngprotein d tr và ch t l ng c a chúng là y u t quy t nh làm cho u t ng trthành ngu n th c ph m quan tr ng cho ng i và th c n cho gia súc [18].

1.2 NGHIÊN C U VC TÍNH CH U H N C A CÂY U TNG1.2.1 Khái ni m v h n và tác ng c a h n n th c v t

H n i v i th c v t là khái ni m dùng ch s thi u n c do môi tr nggây nên trong su t quá trình hay t ng giai n, làm nh h ng n sinh tr ng vàphát tri n c a cây.

Thi u n c tr c tiên nh h ng n s cân b ng n c c a cây, t ó nhng n ch c n ng sinh lý nh quang h p, hô h p dinh d ng khoáng và cu icùng nh n s sinh tr ng phát tri n c a th c v t Cây s ch t non ho c gi m s cs ng, gi m n ng su t [19].

Hi n t ng m t n c có th do tác ng s c p, là k t qu c a s thi u n ctrong môi tr ng, ho c là tác ng th c p c gây ra b i nhi t th p, s tnóng hay tác ng c a mu i H n c ng nh y u t ngo i c nh b t l i khác khi tácng lên c th th c v t s gây ra ph n ng c a c th Tùy theo t ng loài, gi ngmà m c ph n ng c a c th c ng nh thi t h i do khô h n gây ra khác nhau:m t s b ch t, m t s b t n th ng nh ng c ng có m t s khác không b nhng Kh n ng th c v t có th gi m thi u m c t n th ng do thi u h t n c gâyra g i là tính ch u h n [19].

Vi t Nam là m t n c có a hình a d ng và di n bi n khí h u ph c t p, l nga phân b không u gi a các vùng, mi n và gi a các th i k trong n m nên h nhán có th x y ra b t k mùa nào, vùng nào Di n tích có t i 3/4 lãnh th là i núi,t canh tác c a các khu v c này th ng xuyên b h n nên thành ph n th nh ng c acác vùng khác nhau r t rõ r t T t c các y u t trên chi ph i m nh m m c n c ng mvà kh n ng gi n c c a t ch ng l i khô h n cây có th gi không b m tc, gi m di n tích lá, rút ng n chu k s ng…Kh n ng duy trì áp su t th m th u n ibào có tác d ng b o v ho c duy trì s c s ng c a t bào ch t khi b m t n c [2] Cóhai lo i h n do môi t ng tác ng là h n t và h n không khí [1], [5].

Tác ng a n lên cây ch y u theo hai h ng chính là: làm t ng nhi t cây và gây m t n c trong cây N c là y u t gi i h n i v i cây tr ng, v a là s nph m kh i u v a là s n ph m trung gian và cu i cùng c a các quá trình chuy n hoásinh h c N c là môi tr ng các ph n ng trao i ch t x y ra [2].

S tác ng c a h n, gây nên hi n t ng co nguyên sinh và làm cho cây bhéo S co nguyên sinh các t bào di n ra khi n ng n c trong môi tr ng quácao hay do h n n c làm cho n c trong t bào th t thoát ra ngoài nên kh i.

H n hán làm gi m m nh quang h p Khi hàm l ng n c trong lá cònkho ng 40-50% quang h p c a lá s b ình tr c n tr s sinh tr ng c a cây.

Nh v y, nh h ng c c oan c a h n b t c giai n sinh tr ng nào c acây tr ng c ng nh h ng n các y u t c u thành n ng su t và s n l ng cây tr ng.

1.2.2 C s sinh lý, sinh hóa và sinh h c phân t c a tính ch u h n

1.2.2.1 C s sinh lý, sinh hóa c a tính ch u h n

Khi g p h n th c v t luôn có nh ng bi n i v m t sinh lý, sinh hóa nh mkhông m t n c Có hai c ch b o v th c v t t n t i trên môi tr ng thi u

c ó là vai trò c a b r và kh n ng u ch nh áp su t th m th u [2].

Vai trò c a b r : kh n ng thu nh n n c ch y u ph thu c vào b r tránh m t n c nh ng cây ch u h n th ng có b r kh e, dài, m p, có s c xuyênsâu s hút c n c nh ng n i sâu trong t ho c r lan r ng v i s l ng l n[19] Th c v t nói chung, và cây u t ng nói riêng, khi giai n cây nonth ng ch u tác ng m nh c a h n vì b r ch a phát tri n y còn y u.

Kh n ng u ch nh áp su t th m th u (ASTT): là m t c tính quan tr ng

c a t bào khi b m t n c do nóng h n Nh ng th c v t t n t i trên môi tr ng m tcân b ng v áp su t th m th u òi h i ph i có kh n ng ch ng l i u ki n kh cnghi t ó Trong u ki n khô h n ASTT c u ch nh t ng lên giúp cho t bàothu nh n c nh ng phân t n c t t B ng c ch nh v y, th c v t có th v tqua c tình tr ng h n c c b

Thông th ng, thi u n c gây r i lo n toàn b ph ng th c chuy n hóa th c v t, làm t ng ho c gi m hàm l ng các ch t chuy n hóa nh : ng lên v hàm

ng prolin, n ng ion K+, các lo i ng, axit h u c [2], [4], [30] S t ngh p và tích l y các ch t trên di n ra r t nhanh khi t bào m t n c, các ch t hòa tans c tích l y nh m ch ng l i vi c gi m m t n c, t ng kh n ng gi n c c ach t nguyên sinh và chúng có th t ng tác v i lipit ho c protein màng ng n ch ns phá h y màng và các ph c protein [24] Quá trình này liên quan n s bi u hi nc a các gen, hàng lo t các gen ngh c ho t hóa t ng h p t o ra các ch t c n thi t

ch ng l i s khô h n [1].

c ta n m trong khu v c nhi t i gió mùa h n là y u t t ng xuyên tácng gây nh h ng n sinh tr ng, phát tri n c a cây tr ng, nh h ng x u nng su t và ph m ch t c a chúng Vì v y, vi c nghiên c u các c ch ch u h n slà c s cho vi c c i thi n gi ng c ng nh t o ra c các gi ng có tính ch ng ch u.

Khi nghiên c u v kh n ng ch ng ch u c a các cây tr ng l y h t ng i tath c hi n theo nhi u h ng khác nhau: phân tích hóa sinh trong h t n y m m nghiên c u a d ng enzym - amylaza và proteaza hàm l ng protein tan, thànhph n axit amim, prolin

Các proteaza óng vai trò quan tr ng trong c th s ng và nh t là trong th i

k n y m m c a h t Chúng r t a d ng Thành ph n ph c t p c a các proteaza h tc t o ra b i s a d ng ch c n ng do chúng m nhi m trong th i k n y m m.Proteaza nói chung không ch tham gia vào phân gi i protein d tr trong h t, nh mcung c p các axit amin cho th i k phát tri n u tiên c a cây mà chúng còn tham giavào quá trình vi x lý phân t protein Proteaza tham gia vào phân gi i các protein l

ho c b bi n tính khi g p u ki n c c oan (l nh, m n, h n, tác ng c h c ) [18].Tr n Th Ph ng Liên (1999) khi nghiên c u so sánh ph n di ho t tính proteazac a các gi ng u t ng ch u nóng ch u h n khác nhau ã nh n xét r ng Proteazatrong quá trình h t n y m m c a h t t t c các gi ng u t ng nghiên c u r t ad ng, có ho t tính cao, có kh n ng phân gi i hoàn toàn protein d tr t o nguyênli u t ng h p protein cho c th m i X lý nhi t cao ch nh h ng n ho ttính proteaza m t s gi ng ch u h n, không nh h ng n gi ng ch u nóng [18].Nguy n Th Kim Dung (2003) nghiên c u s bi n ng ho t proteaza giaio n h t n y m m c a các gi ng l c ã rút ra k t lu n, ho t c a proteaza tronggiai o n h t n y m m có xu h ng t ng t 1 n 5 ngày tu i, sau ó gi m t 7 n9 ngày tu i [6] C ng theo h ng nghiên c u này Nguy n Th Thu Ngà (2007), chor ng các giai n h t n y m m làm bi n i ho t c a proteaza và hàm l ngprotein tan S bi n i này tuân theo quy lu t chung : t ng các giai n t 3 n7 ngày tu i, b t u gi m giai n 9 ngày tu i, hàm l ng protein tan và ho t proteaza có m i t ng quan thu n ch t ch [29].

Nh ng thay i hóa sinh khác do h n gây ra c ng c nhi u tác gi quantâm nghiên c u: nh s thay i hàm l ng prolin khi cây g p h n.

Prolin là m t axit amin có vai trò quan tr ng trong s u hòa ASTT trongt bào, ng th i là m t axit amin a n c có kh n ng gi và l y n c cho t bào,ng n ch n s xâm nh p c a ion Na+ t ng tác v i protein màng, ng n ch n s pháh y c a màng và các ph c protein khác Các k t qu nghiên c u u cho th y khi câytr ng g p h n thì cây gi m t ng h p protein và t ng t ng h p prolin [26], [28].

Soulages và cs (2003) ã ch ng minh ngoài vai trò t ng c ng kh n ng ch uh n thì chu i axit amin L – Prolin nhóm II còn có kh n ng ch ng l i các tác ngb t l i c a nhi t i v i cây u t ng [ 38] Theo inh Th Phòng (2001), lúakhi gây h n sinh lý b ng dung d ch sorbitol 5% hàm l ng prolin c a các dòng ch nl c t ng lên v t xa so v i i ch ng, s t ng hàm l ng prolin liên quan n kh

ng ch u h n [30] Kh o sát ch t l ng h t và kh n ng ch u h n c a m t s gi nglúa c n a ph ng vùng núi phía B c, Chu Hoàng M u và cs ( 2005) ã nh n xét,

kh n ng ch u h n c a các gi ng lúa c n có liên quan n hàm l ng protein và hàmng prolin Khi g p h n, cây lúa c n gi m hàm l ng protein và t ng hàm l ngprolin [24] Nguy n Th Thúy H ng ( 2006), khi nghiên c u v kh n ng ch u h n c acác gi ng u t ng a ph ng c a T nh S n La c ng ã nh n xét r ng: khi g p h ncác gi ng u t ng có s gi m t ng h p protein và t ng c ng t ng h p prolin [26 ].

1.2.2 C s phân t c a tính ch u h n

Kh n ng ch ng ch u c a sinh v t nói chung và c a th c v t nói riêng liênquan n c u trúc, ch c n ng c a các thành ph n trong t bào và các quá trìnhx y ra trong m i vùng liên quan n kh n ng ch u nóng, ch u h n, m n, phènc a th c v t.

Ph n ng c a th c v t tr c nh ng tác ng: nóng, h n r t a d ng nó phthu c vào nhi u y u t khác nhau, trong ó có ki u gen, dài và tính kh c li t c a

i u ki n ngo i c nh Bi u hi n c a quá trình này là vi c sinh t ng h p m t lo t cácch t trong t bào, m t s hormon ho c ch t kích thích giúp cho cây có kh n ngthích ng Khi i sâu vào nghiên c u m c phân t c a hi n t ng nóng h n th c v t ng i ta ã có nh ng b c ti p c n khác nhau trên nhi u loài cây tr ng các giai o n phát tri n khác nhau c nghiên c u nhi u nh t là các protein s nph m bi u hi n gen [19] Nhóm các protein c c bi t quan tâm bao g m:protein s c nhi t, môi gi i phân t , LEA

Protein s c nhi t (heat shock protein- HSP): HSP có h u h t các loàith c v t nh : lúa mì, m ch, lúa g o, ngô, u nành, hành, t i… chúng chi mkho ng 1% protein t ng s trong lá c a các loài th c v t này HSP c t ng h pkhi t bào g p i u ki n c c oan nh : h n, nhi t cao, mu i cao S xu t hi nc a HSP có ch c n ng ng n c n ho c s a ch a s phá y do stress nóng và mr ng giá tr ng ng v i s ch ng ch u nhi t cao Trong các t bào th c v t HSPt bào ch t t p trung thành các h t s c nhi t (HSG-Heat Shock Granules) Ng i tacho r ng các HSP g n k t trên các ARN polymeraza ng n c n s phiên mã t ngh p mARN trong quá trình b stress nóng Sau s c nóng các h t này phân tán vàliên k t dày c v i các ribôxôm ho t ng sinh t ng h p protein [19].

HSP có th chia làm 6 nhóm d a trên c s kh i l ng phân t khác nhau:110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa Trong ó có nhóm HSP70 và HSP 60 có nhi u idi n c a ch t môi gi i phân t (g i là chaperonin) HSP 8,5 kDa (Ubiquitin) có ch cng b o v cho t bào nh ng không ph i là môi gi i phân t Ubiquitin có ho ttính proteaza v i ch c n ng phân gi i các protein không có ho t tính enzym.Ubiquitin có MW r t th p, ít ch u nh h ng c a nhi t nên có vai trò t s a ch ac a t bào khi g p y u t c c oan, c bi t là nhi t cao [19].

Môi gi i phân t (MGPT): MGPT là m t nhóm g m nhóm g m nhi u lo i

protein khác nhau, nh ng chúng u có ch c n ng tham gia t o c u trúc không gianúng cho protein trong t bào Ph n l n các ch t MGPT có ho t tính ATP-aza, cóch c n ng: (1) Gi n nh chu i polypeptit khi ang t ng h p và t o c u trúckhông gian úng cho chúng, (2) T o l i c u trúc không gian c a protein sau khi v nchuy n qua màng t bào, (3) L p ráp các chu i polipeptit vào ph c t o c u trúcb c 4, (4) MGPT c t ng c ng nh quá trình t ng h p trong u ki n c c oando nhu c u c p thi t c a t bào, nh t là s c nhi t.

MGPT có th chia thành m t s nhóm nh sau:

HSP 70 là nhóm MGPT có ho t tính ATP-aza và có tính b o th cao Trongi u ki n c c oan HSP có th ng n ch n s co c m và k t t protein.

HSP 60 (chaperonin) là lo i protein c u t o t các ti u n v có kh i l ng60 kDa và c ng có ho t tính ATP-aza [24].

H CCT: Chaperonin c a t bào ch t, còn g i là chaperonin ch a

polypeptit-l c a ph c t (CCT), hay còn g i polypeptit-là ph c vòng ch a popolypeptit-lypeptit-polypeptit-l c a ph c t (TriC) polypeptit-làm t nhóm môi gi i phân t m i Chúng giúp cho vi c t o c u trúc không gian úngc a protein trong khung t bào actin và tubulin trong t bào ch t Chúng óng vaitrò quan tr ng trong qua trình hình thành thoi vô s c c a giai n phân bào, cbi t là th i k phát tri n m m t h t Chaperonin t bào ch t là m t ph c có kh i

ng phân t kho ng 90 kDa bao g m 8 ti u n v có tên là α, , , , , , ,(t ng ng v i CCT1- CCT8) và hình thành nên c u trúc vòng bi kép [16] Trongd ch chi t t bào các ti u n v trong c u trúc không gian c a vòng bi có vai trò r t

quan tr ng g n c ch t Ch c n ng này g n li n v i s có m t c a 4 ti u n v :CCTα Vì quá trình t o c u trúc không gian trong CCT không có s tham giac a protein d ng GroES, nên c ch t protein c gi l i trong kh i hình tr nh cch óng m c bi t theo ki u b c thang c a các vùng CCT Ngoài CCT còn có hainhóm nhân t cùng tác ng A và B tham gia vào c u trúc không gian úng c aprotein Trong ó nhóm nhân t A không óng vai trò trong công vi c u ch nhho t tính c a CCT Nó không tham gia t ng tác v i CCT nh ng l i tham gia vàot o c u trúc không gian úng c a protein khi gi i phóng ra kh i CCT [18].

Các nhóm HSP 100, HSP 90 u có tính b o th cao và có ho t tính aza M t s tìm th y trong t bào bình th ng, nh ng ph n l n chúng sinh ra khig p các u ki n ngo i c nh b t l i nh h n, nóng, l nh Ch c n ng chính c achúng là ng n ch n s co c m c a protein và tái ho t hoá các protein bi n tính [19].

ATP-1.2.3 Nghiên c u v tính ch u h n cây u tng

Trong các cây tr ng l y h t thì cây u t ng có nhu c u v n c cao h ncác lo i cây khác ó chính là do trong h t và cây u t ng có hàm l ng proteinvà lipit r t cao, t ng h p 1kg ch t khô c n 500 - 530 kg n c Trong quá trìnhn y m m thì nhu c u v n c c a u t ng c ng khá cao 50%, trong khi ó ngôch là 30%, lúa là 26% [20 ].

Nghiên c u v các c tính ch u h n c a cây u t ng v ph ng di n sinhlý và di truy n ã cho th y r ng, các c tính này liên quan ch t ch n c mhoá keo c a nguyên sinh ch t, c m c a quá trình trao i ch t Tính ch u h nc a cây u t ng là tính tr ng a gen Chúng th hi n nhi u khía c nh khác nhaunh : v s phát tri n c a b r , tính chín s m t ng i, c ng nh b n ch t ditruy n c a t ng gi ng có kh n ng s d ng n c ti t ki m trong quá trình sinhtr ng và phát tri n c a cây n c vào c m này, u t ng c chia thànhhai nhóm [18].

- Nhóm ch u c s m t n c trong t ng giai n phát tri n c a cây.- Nhóm ch u c s thi u n c trong t t c giai n phát tri n c a cây.

giai n cây con khi g p h n, u t ng có th d v t qua h n, cònnh ng giai n sau nh giai o n ra hoa, k t qu , h t chín s a mà g p h n thì sd n n n ng su t gi m áng k

Trong nh ng n m g n ây các nhà khoa h c ã có nhi u thành công khinghiên c u sâu h n v tính ch u h n c a cây u t ng.

Maitra và Cushman (1994) ã phân l p c cDNA c a dehydrin t lá ung khi b m t n c, ngoài ra các tác gi còn phân l p c cDNA c a LEA nhóm D- 95 t lá và r cây u t ng khi b h n [36].

Jinn và các tác gi khác (1997) nghiên c u v sHSP nhóm 1 (15-18 kDa) ãnh n th y, chúng t ng lên l ng l n trong m m u t ng d i tác ng c a nhi tc tìm th y c u trúc d ng h t trong nguyên sinh ch t và trong nhân cùng v iprotein b bi n tính.[35].

m 2004, nhóm nghiên c u g m Huang và cs c a Tr ng i h c Tnhiên và K thu t Pingtung, ài Loan, ã phân l p c gen P5CS u t ng tmARN v i kích th c 2148bp [45] Gen P5CS là nhân t gi i h n cho nh p t ngh p proline th c v t trong u ki n b t l i do h n và do m n gây nên [39].Nghiên c u c a Porcel và Cs (2005), ã ch ra r ng, gen mã hoá protein dehydrin(LEA-DII) có vai trò v i kh n ng ch ng ch u c a u t ng.

Vi t Nam ã có m t s công trình nghiên c u phân l p các gen liên quann kh n ng ch u nóng, ch u h n c a cây u t ng Nghiên c u phân l p và ctrình t gen chaperonin t gi ng u t ng ch u nh Bonminori- Nh t n v i kíchth c phân t 1,6 kb c a Nông V n i và cs (1997) [12] Nghiên c u c a Tr n ThPh ng Liên (1999) ã phân l p, xác nh trình t gen chaperonin t bào ch t CCTt gi ng u t ng t bi n M103 v i kích th c 1602 bp mã hóa cho 533 axitamin Trình t gen này có s thay i axit amin 3 v trí 99 (Ser Thr), 280 (Ser Gly)và 308 ( Ser Ala), s thay i này tuân theo quy lu t t ng kh n ng ch u nhi t.Tác gi kh ng nh s thay i này là c n c lý gi i kh n ng ch u nóng c a gi ngt bi n M103 [18] Tr n Th Ph ng Liên và cs (2003), ã phân l p c genchaperonin CCTδ t gi ng u t ng a ph ng ch u n Cúc Vàng, gen này g m

1602 nucleotit mã hóa cho 533 axit amin [17] Nguy n Th Thu Hi n (2005), phânl p c gen dehydrin v i kích th c 751bp liên quan n kh n ng ch u h n t haigi ng u t ng vàng M ng Kh ng và Cao B ng 4 [11].

1.3 NH N XÉT CHUNG

1.3.1 u t ng là cây tr ng có giá tr kinh t cao, là cây công nghi p, câyth c ph m, v a là cây c i c i t o t c tr ng ph bi n nhi u qu c gia trên thgi i Vi t Nam, cây u t ng chi m m t v trí quan tr ng trong n n nôngnghi p Trong nh ng n m g n ây n ng su t và s n l ng u t ng tuy có s t ng

áng k , nh ng so v i các n c trên th gi i n ng su t c a các gi ng u t ngc ta còn m c th p.

1.3.2.Trong h t u t ng có các thành ph n ã bi t tính theo t l protein30-56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mu i khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; cácvitamin A, B1, B2, D, E, F….Trong ó, hàm l ng protein d tr và ch t l ng c achúng là y u t quy t nh làm cho u t ng tr thành ngu n th c ph m quantr ng cho ng i và th c n cho gia súc.

1.3.3 u t ng là lo i cây có nhu c u v n c cao h n các lo i cây tr ngkhác, thu c vào nhóm ch u h n kém H n ã nh h ng l n n quá trình sinh tr ng,phát tri n c a cây u t ng và làm gi m n ng su t, ch t l ng Nghiên c u v tínhch u h n c a cây u t ng ng i ta th c hi n theo nhi u h ng khác nhau: phân tíchhóa sinh trong h t n y m m nghiên c u a d ng enzym - amylaza và proteaza hàmng protein tan, thành ph n axit amin i sâu vào nghiên c u m c phân t ,c nghiên c u nhi u nh t là các protein s n ph m bi u hi n gen Nhóm các proteinc c bi t quan tâm bao g m: protein s c nhi t, môi gi i phân t , LEA

1.3.4 Trên th gi i ã thành công trong vi c nghiên c u gen mã hóa proteinu t ng và các trình t gen này ã c công b trên ngân hàng gen th gi i.T i Vi t Nam, ã có m t s tác gi nghiên c u v tính ch u h n và ã phân l p, gi itrình t gen liên quan n tính ch u h n c a cây u t ng, trong ó có chaperonintrên các gi ng u t ng khác nhau Tuy nhiên, vi c nghiên c u các gi ng u

ng a ph ng c a các t nh khu v c Tây Nguyên còn ít c quan tâm chú ý.

Chng 2

NGUYÊN LI U VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN C U

2.1 NGUYÊN LI U2.1.1 Nguyên li u th c v t

Các gi ng u t ng a ph ng: Az mpa Gia Lai (AZP), Sa Th y Kon Tum (ST), Ch mnga- k L k (CNg) do Trung tâm Tài nguyên Di truy nth c v t - Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t Nam cung c p.

-Gi ng a ph ng Duy Linh- Lâm ng (DL) và gi ng i ch ng HN9 doTrung tâm Khuy n Nông t nh k L k cung c p.

B ng 2.1 Ngu n g c c a các gi ng u t ng nghiên c u

1 Duy Linh DL Gi ng a ph ng, Duy linh- Lâm ng2 Sa Th y ST Gi ng a ph ng, Sa Th y- Kon Tum3 mnga CNg Gi ng a ph ng, Ch mnga- k L k

4 HN9 HN9 Gi ng i trà c tr ng ph bi n huy n Buônôn- k l k

5 Az mpa AZP Gi ng a ph ng, Az mpa- Gia Lai

2.1.2 Hóa ch t, thi t b và a m nghiên c u

Hóa ch t: dùng cho các thí nghi m phân tích hoá sinh và sinh h c h c phân

t : g m các lo i hoá ch t mua c a các hãng Anh, c, M , Trung Qu c: EDTA,CTAB, TAE, Agarose…

Các hóa ch t thông d ng khác: axit citric, NaOH, NaCl, CH3COONa, ethanol(70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, n c kh ion,NaH2PO4, Fe2( SO4), K3Fe( CN)6, CuSO4, ninhydrin…

Thi t b : Các thi t b chính c s d ng phân tích hoá sinh và sinh h cphân t g m:

- Máy quang ph UV-Vis Cintra 40 (Australia)

- Máy i n di + b ngu n PowerPac 300 (Bio-Rad, M )

- Máy phân tích axit amin t ng - HP amino Quan SeriesII (HewlettParkard, M )

- Máy phân tích trình t gen ABI 3100 Genetic Analyzer (M )- B n nhi t (Techne, OSI, Anh)

- Pipetman các lo i (Gilson, Pháp)- T s y (Anh)

- Cân i n t (Thu S )

- T l nh sâu – 850C (Sanyo, Nh t B n)- N i kh trùng (Tomy- Nh t)

- Máy PCR (ABI System, M )- Máy soi ADN (Bio-Rad, M )- Máy li tâm l nh ( c)

- Máy khu y tr n Voltex ( c)

- Máy o pH (Metter Toledo, Th y S )

a m nghiên c u: Các thí nghi m c th c hi n t i Phòng thí nghi mDi truy n h c và Công ngh gen, Khoa Sinh- KTNN, Tr ng i h c S ph m -i h c Thái Nguyên Các phân tích axit amin t ng và xác nh trình t genc th c hi n t i Phòng thí nghi m tr ng m Công ngh gen, Vi n Công nghsinh h c, Vi n Khoa h c và Công ngh Viêt Nam.

2.2 PHNG PHÁP NGHIÊN C U2.2.1 Phng pháp hoá sinh

2.2.1.1 Phân tích hóa sinh giai n h t ti m sinh

n khi kh i l ng không i r i cân m u Hàm l ng lipit c tính theo công th c:

D ch chi t c nh m c lên 5ml và o h p th quang ph trên máy quangph UV b c sóng 750 nm v i thu c th Folin.

Hàm l ng protein c tính theo công th c : X % =

x 100%Trong ó :

X : hàm l ng protein (% kh i l ng khô)A : n ng thu c khi o trên máy (mg /ml )HSPL: h s pha loãng

m: kh i l ng m u (mg)

(3) Xác nh hàm lng và thành ph n axit amin trong h t

Hàm l ng axit amin c xác nh trên máy HP - Amino Quant s d ngortho-phtalADNehyt t o d n xu t i v i các axit amin b c 1 và 9 - fluoreryl -metyl - cloroformat i v i các axit amin b c 2 M u c x lý theo ph ng phápthu phân pha l ng theo h ng d n s d ng máy phân tích axit amin t ng.

2.2.1.2 ánh giá kh n ng ch u h n thông qua phân tích m t s ch tiêu hóasinh giai n h t n y m m

(1) Chu n b m u

H t các gi ng u t ng c ngâm trong n c 1h, sau ó c mb ng dung d ch MS pha loãng 10 l n ch a sorbitol 7% H t n y m m sau các

th i gian 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày c l y xác nh ho t c proteaza và hàm l ng protein tan i ch ng là h t u t ng c b ng

ng chu n xây d ng b ng tyrosin, và c tính theo công th c:VH /mg = (n k) D HSPL

T m

− × ××

H t u t ng n y m m gieo vào ch u (kích th c 30cm x 30cm) ch a cátvàng ã r a s ch, m i ch u tr ng 30 cây, m i gi ng tr ng 4 ch u Thí nghi m cl p l i 3 l n trong i u ki n và ch ch m sóc nh nhau Th i gian u t i n ccho m, khi cây u t ng c 3 lá ti n hành gây h n nhân t o và ánh giá kh

ng ch u h n c a các gi ng u t ng b ng cách xác nh t l thi t h i và ch sch u h n t ng i.

(1) Xác nh t l cây s ng sót (%)

S cây s ngT l cây s ng sót =

(3) Xác nh t l thi t h i do h n gây ra c tính theo công th c

N ba

Trong ó:

a: T l thi t h i do h n gây ra (%);b: Tr s thi t h i c a m i c p;c: Tr s thi t h i c a c p cao nh t;No: S cây c a m i c p thi t h i;N: T ng s cây x lý

Các tr s :

S cây ch t: Tr s 3

: Góc t o b i 2 tr c mang tr s li n nhau = 3600/1515: S ch tiêu theo dõi

T: T s kh i l ng c a r / thân lá khôWr: Kh i l ng khô c a r (mg)Wtl: Kh i l ng khô c a thân lá (mg)

(6) Xác nh hàm lng prolin theo Bastes (1973) [33].

Tách chi t prolin: Nghi n 0,5 gram thân lá cây u t ng ã x lý h n ng ng tr c h n, h n 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày trong c i chày x , thêm 10ml dungd ch axit sunfosalisilic 3 %, li tâm 8000 vòng /phút trong 30 phút.Thu d ch làm thínghi m o h p th quang ph b c sóng 520 nm.

Hàm l ng prolin c tính theo công th c:X % =

x 100%

Quy trình tách chi t ADN t ng sc th c hi n theo các bc sau:

- L y kho ng 200g m m u t ng ã l nh -850C nghi n nhanh trongc i và chày x (c i chày ã c vô trùng và trong t -850C).

- B sung 0,8ml m r a, li tâm 15 phút, 12000 vòng/ phút, lo i b d ch n i.c này làm 2 l n.

- Thêm 700µl m tách, mix nh , 650C trong 2h, sau ó l y ra nhi t phòng 5 phút.

- Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol ( 24:1 ), tr n u 20 phút

- Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút Hút c n th n 500µl d ch trong sang ngeppendorf 1,5 ml m i ( b t a).

- Thêm 600µl isopropanol, l c nh , t lên á ( t l nh qua êm), ch cód ch t a tr ng.

- Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, b d ch, úp xu ng gi y cho khô.

- B sung 300µl c n 70%, búng nh Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, lo ib c n (th c hi n 2 l n).

- Làm khô ADN trong box b t qu t.- Hòa tan ADN trong 50 µl n c kh ion.

2.2.4.2 Phng pháp i n di ADN trên gel agarose

T o b n gel agarose v i n ng thích h p Dung d ch m dùng cho i n dilà TAE 1X Tra m u và ch y n di v i hi u n th là 80V -100V, sau ó ADN

c nhu m b ng ethidium bromide, soi d i èn UV và ch p nh.

2.2.4.3 Phng pháp nhân b n n ADN thu c gen mã hóa cho chaperonin

o n gen ADN c hi u thu c gen chaperonin c a u t ng c nhân b nb ng k thu t PCR v i c p m i MC1 và MC2 do hãng Invitrogen cung c p

S n ph m PCR c ki m tra b ng n di trên gel agaroza (nh mô t trên).

2.2.4.4 Phng pháp tách dòng o n gen chaperonin

Tách dòng gen chaperonin c ti n hành b ng cách g n tr c ti p n ph mPCR vào vet tách dòng Pjet 1.2 (Hãng Fermentas) Ph n ng g n có thành ph nnh sau: H2O : 3,5µl

Dung dich m cho T4ligaza : 1µl S n ph m PCR: 3µl Vet Pjet 1.2 : 1,5µl T4 Ligaza : 1µl

Quá trình g n c ti n hành 12 ti ng nhi t 140C Sau khi g n n ph m

c bi n n p vào E Coli DH5α Các khu n c E.coli ch a vect tái t h p mang

n ph m PCR c ch n l c trên môi tr ng LB ch a ampixilin, IPTG và Xgal.

2.2.4.5 Phng pháp bi n n p ADN plasmit vào t bào E coli ch ng DH5α

- L y t bào kh bi n DH5α trong l nh – 750C trên á 30 phút.

- Tr n 4µl dung ch ph n ng g n (ligate) vào ng t bào kh bi n, sau ótrên á 30 phút.

- S c nhi t 420C, th i gian 1 phút 30 giây, sau ó trên á 2 phút.

- B sung 300 µl môi tr ng LB ng, sau ó nuôi l c t c 200 v/p 370Ctrong 1 gi

- C y tr i toàn b d ch t bào ã bi n n p trên m t a môi tr ng LB cch a ampixilin (100µg/ml), Xgal và IPTG.

- Gi a c y vi khu n trong m 370C qua êm

2.2.4.6 Phng pháp tách chi t ADN plasmit t vi khu n

- L y m t khu n c E Coli ch a plasmit c y vào 2ml môi tr ng LB ngc ng v i ch t kháng sinh ampixilin (n ng 100µg/ml) L c qua êm nhi t370C, 200 vòng/ phút.

- L y 1,5 ml ch nuôi c y vào ng eppendorf Li tâm 5000 vòng/ phút trong10 phút thu c n t bào.

- B sung 150 µl dung ch I, tr n u b ng máy voltex.

- B sung 150µl dung ch II, o nh b ng tay kho ng 3 l n.

- Ti p c b sung 150µl dung ch III, o nh b ng tay kho ng 3 l n.- Thêm 400µl chlorofom: isoamyl alcohol (24:1) o nh

- Hòa c n ADN- plasmit trong 40µl TE có ARNaza ( n ng 100µl/ml).- b n nhi t 370C trong 1 gi lo i ARN.

- i n di trên gel azaroza 1% ki m tra

2.2.4.7 Phng pháp xác nh trình t gen b ng thi t b tng

Xác nh trình t ADN theo ph ng pháp thông ng nh t ó là xác nhtr c ti p thông qua ph n ng k t thúc u cu i- ph ng pháp enzym a Sanger[41] V i các n m i có g n hu nh quang và b hóa ch t chu n (kit) nhân trìnht gen b ng PCR v i Tap ADN polymeraza Chu trình nhi t: 950C 36 giây, 500C 36giây, 720C 84 giây, k t thúc 40C Sau ó s n ph m nhân gen có g n hu nh quangc bi n tính b ng nhi t và phân tích trên máy xác nh trình t ADN t ng ABIPRISM 3100 Avant Genetic Analizer S li u nh n c x lý trên máy vi tínhb ng ph n m m Clustalx.

Chng 3

T QU VÀ TH O LU N

3.1 ÁNH GIÁ CH T LNG H T C A 5 GI NG U TNGNGHIÊN C U

3.1.1 c m hình thái, kích thc và kh i lng h t 5 gi ng u tngnghiên c u

K t qu phân tích c m hình thái, kích th c và kh i l ng 1000 h t c a 5gi ng u t ng a ph ng: Duy Linh- Lâm ng (DL), Sa Th y - Kon Tum (ST),Ch mnga- k L k (CNg), Az mpa- Gia Lai (AZP), và gi ng i ch ng HN9 ctrình bày trên b ng 3.1 B ng 3.1 cho th y h u h t các gi ng u t ng u có hìnhtròn, màu h t có màu vàng và vàng nh t Màu s c r n h t có màu nâu, nâu nh t vàen, ây là m t c tính quan tr ng trong vi c giám nh gi ng Riêng gi ng DuyLinh -Lâm ng có hình thái r t khác bi t so v i các gi ng khác, c m chính c agi ng này: h t dài d t lõm gi a, màu h t tr ng xanh, r n màu nâu nh t.

B ng 3.1 Màu s c, hình d ng, kích th c và kh i l ng h tc a 5 gi ng u t ng nghiên c u

Kích thc

v h t

Màur n h t

Hìnhd ng

h t R ng (mn)Dài (mn)

Kh i lng1000 h t (g)

nh t Nâu nh t Tròn 0,62 ±0,01 0,73 ±0,02 118,36 ± 1,55

Hình 3.1 H t c a 5 gi ng u t ng

DL : 2- ST : 3- CNg : 4 - NH9 : 5- AZP

K t qu phân tích cho th y kh i l ng 1000 h t c a 5 gi ng u t ng daong t 65,26 (g) ± 0,34 n 145,34 (g) ± 0,04 , trong ó gi ng NH9 có kh i l ng1000 h t cao nh t 145,34±0,04 (g) Có th x p kh i l ng h t c a các gi ng u

ng theo th t t cao n th p nh sau: HN9 >ST >CNg >AZP >DL.

3.1.2 Hàm lng protein và lipit trong h t c a 5 gi ng u tng nghiên c u

H t u t ng g m có lipit, protein, hydratcacbon và các ch t khoáng Trongó protein và lipit là hai thành ph n quan tr ng c s d ng ánh giá ch tng h t trên ph ng di n hóa sinh K t qu phân tích hàm l ng lipit và proteinc a 5 gi ng u t ng c trình bày trong b ng 3 2.

Trên ph ng di n hóa sinh, ch t l ng h t c a các gi ng u t ng c xácnh d a vào k t qu phân tích hàm l ng protein, lipit và thành ph n axit amin trongprotein c a h t B ng 3.2 cho th y hàm l ng protein và lipit c a 5 gi ng u t ngnghiên c u khá chênh l ch nhau, hàm l ng protein dao ng trong kho ng t 33,12%n 38,35%, k t qu này phù h p v i các tài li u ã công b [18], [24], [31] Trong óDL và AZP là 2 gi ng có hàm l ng protein cao nh t (38,35% và 37,87%), gi ng NH9có hàm l ng protein th p nh t (33,12%) Hàm l ng protein c a 5 gi ng u t ng

c s p x p theo th t t ng d n là: NH9< ST< CNg< AZP< DL.

Lipit là m t trong nh ng ch tiêu quan tr ng ánh giá ch t l ng h t Tk t qu phân tích b ng 3.2 cho th y hàm l ng lipit c a các gi ng nghiên c u dao

ng trong kho ng t 12,26% n 18,33% NH9 là gi ng có hàm l ng lipit caonh t (18,33%), gi ng DL có hàm l ng lipit th p nh t (12,26%), k t qu nghiên c uchúng tôi cho th y r ng các gi ng u t ng a ph ng có hàm l ng lipit khôngcao Hàm l ng lipit c a 5 gi ng u t ng c s p x p theo th t t ng d n: DL<AZP< CNg< ST < NH9.

Trong 5 gi ng u t ng nghiên c u, gi ng DL có hàm l ng protein caonh t (38,35%), nh ng hàm l ng lipit l i th p nh t (12,26 %) Gi ng NH9 có hàmng protein th p (33,12%) nh ng hàm l ng lipit l i cao (18,33%) Nh v y hàmng protein và lipit trong h t u t ng có m i t ng quan ngh ch [18], [25].

B ng 3.2 Hàm l ng protein và lipit c a h t 5 gi ng u t ng (%TL khô

3.1.3 Thành ph n axit amin trong protein h t c a 5 gi ng u tng

Ch t l ng c a h t u t ng không nh ng ph thu c vào hàm l ng proteinmà còn ph thu c vào thành ph n axit amin trong protein h t B ng cách s d ngph ng pháp phân tích hàm l ng axit amin trong h t trên h máy HP- Amino Quantvà d a vào s c ký , chúng tôi ã xác nh c hàm l ng axit amin trong proteinh t c a 5 gi ng u t ng.

Hình 3.2 S c ký axit amin c a b t gi ng u t ng DL

Hình 3.3 S c ký axit amin c a b t gi ng u t ng ST

K t qu phân tích thành ph n và hàm l ng axit amin trong protein h t c a 5gi ng u t ng, chúng tôi thu c 17 axit amin (3 axit amin còn l i, bình th ngkhông phân tích c trên máy t ng), trong ó hàm l ng cystein và cystin ctính chung, k t qu c trình bày b ng 3.3 Quá trình th y phân các m u nghiênc u trong HCl s làm tryptophan b phân h y hoàn toàn, còn glutamin và asparaginchuy n hóa thành axit glutamic và axit aspartic.

B ng 3.3 Hàm l ng axit amin trong h t c a 5 gi ng u t ng (g aa/100g protein)

Hình 3.4 S c ký axit amin c a b t gi ng u t ng CNg

Hình 3.5 S c ký axit amin c a b t gi ng u t ng HN9

B ng 3.3 cho th y hàm l ng axit amin có ch a nhóm SH u th p: metionint (0,87g n 1,03g/100g protein) còn cystein và cystin t (0,58g n0,78g/100gprotein) Gi ng CNg có hàm l ng metionin cao nh t (1,03g/100gprotein), th p nh t là gi ng AZP (0,87g/ 100g protein) Trong 5 gi ng u t ngnghiên c u hàm l ng axit amin t ng s chênh l ch nhau không áng k , nh nghàm l ng m i lo i axit amin t ng gi ng l i có s khác nhau.

u t ng c coi là lo i u ch a proterin có ph m ch t t t nh t trong scác lo i protein th c v t Các axit amin không thay th (treonin, valin, metionin,phenylalanin, isoleuxin, leucin, lysin) u có trong thành ph n axit amin cnghiên c u Hàm l ng prolin c a các gi ng u t ng trong kho ng (4,39g n5,42g/100g, trong ó CNg có hàm l ng này cao nh t (5.56g/100gprotein), th pnh t là gi ng NH9 (4,39g/100g protein) Hàm l ng lysin trong kho ng t (11.30gn 11,86 g/100g protein), cao h n so v i các lo i ng c c, trong ó gi ng DL vàAZP là 2 gi ng có kh n ng ch u h n có hàm l ng lysin cao nh t (11,86g-11,69g/1000g protein) i u này làm t ng giá tr c a u t ng v m t dinh d ngvì lysin v n là axit amin gi i h n trong g o và các lo i ng c c khác [18].

Hình 3.6.S c ký axit amin c a b t gi ng u t ng AZP

3.1.4 Nh n xét vc m hình thái, hóa sinh h t c a 5 gi ng u tngnghiên c u

(1) Các gi ng u t ng nghiên c u có kích th c, kh i l ng và hìnhd ng h t khác nhau Kh i l ng 1000 h t c a 5 gi ng u t ng dao ng t65,26± 0,34(g) n 145,34± 0,04(g), trong ó gi ng NH9 có kh i l ng l n nh t145,34± 0,04(g), nh nh t là 2 gi ng a ph ng DL (65,24± 0,34g), và AZP(118,36± 1,55g).

(2) Hàm l ng protein trong h t c a các gi ng u t ng a ph ng:Az mpa- Gia Lai (AZP), Sa Th y - Kon Tum (ST), Ch mnga- k L k (CNg),Duy Linh- Lâm ng (DL) và gi ng i ch ng HN9 dao ng t 33,12% n38,35%, trong ó DL và AZP là 2 gi ng có hàm l ng protein cao nh t (38,35% và37,87%), gi ng NH9 có hàm l ng protein th p (33,12%).

(3) Lipit dao ng trong kho ng t 12,53% n 18,33 % NH9 là gi ng cóhàm l ng lipit cao nh t (18,33%), hai gi ng AZP và DL có hàm l ng lipit th pnh t (12,26% và 12,53%).

(4) ã xác nh c 17 lo i axit amin có trong h t c a 5 gi ng u t ngtrên, trong ó có 7 lo i axit amin không thay th Gi ng DL và AZP có hàm l nglizin cao nh t (11,86g và 11,69g).

3.2 ÁNH GIÁ KH N NG CH U H N C A 5 GI NG U TNG3.2.1 Kh n ng ch u h n c a 5 gi ng u tng nghiên c u giai n h t n y m m

3.2.1.1 Ho ta proteaza và hàm lng protein tan trong h t n y m m khix lý b i sorbitol 7%

Các proteaza óng vai trò quan tr ng trong c th s ng, nh t là trong th i kn y m m c a h t Khi h t n y m m, m t s proteaza c t ng h p và ho t ngm nh, giúp cho quá trình phân gi i protein d tr di n ra m nh m nh m cung c pcác axit amin t ng h p protein m i cho m m non phát tri n, m b o cho câynon có th sinh tr ng phát tri n bình th ng trong u ki n thi u n c Do v y,vi c tìm hi u v s bi n ng ho t proteaza và s phân gi i protein d tr tronggiai o n h t n y m m là m t trong nh ng c s ánh giá tính ch u h n c a cây h

u nói chung và cây u t ng nói riêng.

Trong nghiên c u này chúng tôi ti n hành ánh giá kh n ng ch u h n c a 5gi ng u t ng thông qua s bi n ng v ho t proteaza và hàm l ng proteingiai o n h t n y m m d i tác ng c a sorbitol n ng 7% Dung d ch sorbitolt o áp su t th m th u cao, c nh tranh n c v i t bào h t làm cho h t không hútc n c, gây ra s thi u n c trong t bào K t qu nghiên c u c trình bàytrên b ng 3.4.