NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH THỊ NGỌC ĐINH THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC MÃ SỐ: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS CHU HOÀNG MẬU Thái Nguyên - 2008 Thái Nguyên- 2008 M Lý ch n ut ng b ng t nh vùng núi phía B c, ngu n gen c a U t nh khu v c Tây Nguyên n tài ng (Glycine max (L.) Merrill) công nghi p ng n ngày, có giá tr kinh t hàm l ng dinh d ng cao H t ut Tây Nguyên vùng th ng kéo dài gây thi u n leucin…), 12 %-25% lipit, vitamin (B1, B2, C,D, E, K…) c n thi t cho c hàng n m gi m m nh ó có gi ng ng v t M t r t o kh n ng c nh nit không khí, v y tr ng t b o v môi tr S n xu t ut c khác S n l Vi t Nam s n l ut ut ng v n ut ng có n t s n ng góp ph n c i t o ng ut ng th gi i ng m i ch ng n t hàng tr m tri u t n/ n m Trong t tr m nghìn t n/ n m, u ó ch ng t tình c ta so v i khu v c v n m c th p quan tr ng ch n t o thúc ys n c nh ng gi ng không ch cho n ng su t cao, ph m ch t t t mà ph i thích h p v i gi ng a hình có n 3/4 i núi th ng có mùa khô hanh ng m a phân b không hán n ng nóng kéo dài ng t ng u ki n ngo i c nh thu c vào nhóm ch u h n kém, công tác ch n t o gi ng ki u gen ch ng ch u ngày Vi t Nam, ngu n gen c a ng Nh ng gi ng l i có ch t l ngo i c nh ut ng có c quan tâm nghiên c u [10], [18], [23] ut nh ng gi ng nh p n i, gi ng l i t o gi ng a ph ut ng a ph t bi n, có t p oàn gi ng ng có n ng su t th p, nh ng ng h t t t kh n ng ch ng ch u cao v i c tính ch u nóng, ch u h n c a gi ng u t u ki n b t l i c a ng ã c nhi u nhà khoa h c quan tâm nghiên c u [18], [24], [31], [36] Tuy nhiên, tác gi m i ch t p trung nghiên c u gi ng ut ng tr ng t cho ngành ch n gi ng c t nh trung du, ut m hóa sinh phân l p gen chaperonin liên quan ut ut ng a ph ng tr ng ng h t tìm hi u gen liên quan ng i u ki n sinh thái ng tài: n tính vùng Tây Nguyên” n kh n ng ch u h n c a khu v c Tây Nguyên u t ng tr ng t i khu v c Tây Nguyên - Nghiên c u kh n ng ch u h n, c s hóa sinh phân l p gen liên quan n kh n ng ch u h n c a m t s gi ng ut ng tr ng t i khu v c Tây Nguyên N i dung nghiên c u - Phân tích gi ng ut c m hình thái, kh i l ng kích th ch tc am t s ng tr ng t i Tây Nguyên - Xác nh hàm l ng protein, lipit h t c a gi ng u t ng nghiên c u - Phân tích thành ph n axit amin protein h t c a gi ng ng r t a d ng phong phú; ng th ng, có kh n ng ch ng ch u h n cao - So sánh ch t l ng h t c a m t s gi ng mi n B c, mùa im nc mv i ng Vì v y, vi c ánh giá, n ch n M c tiêu nghiên c u u gi a vùng gi a th i k n m nên h n ut ut ch u h n c a m t s gi ng u ki n a hình khí h u Tây Nguyên…Nh ng n m g n ây di n bi n khí h u ngày ph c t p, ng tr ng ng có n ng su t ch t l nh m ánh giá ch t l n n ng su t, s n l t Cao Nguyên T nh ng lý ã ti n hành “Nghiên c u c ta có h sinh thái r t a d ng, khí h u gi a vùng, mi n l i không khô nóng ut làm v t li u ch n gi ng yêu c u th c ti n vùng ng phát tri n m nh t i M , Brazil, Argentina, Trung Qu c nhi u n hình s n xu t ut ng [20] ó, xu t c tính quan tr ng n a c a c tính quý t v i hai mùa rõ r t, mùa m a mùa khô, mùa khô c tr m tr ng d n th ng i ng c quan tâm ng ch a 30 % - 56% protein, ch a nhi u lo i axit amin không thay th (lysin, tryptophan, metionin, cystein, c ta c ng r t a d ng, có nhi u ut - Xác nh hàm l ng protein tan, ho t - c a proteaza giai ánh giá kh n ng ch u h n c a gi ng ut ng ut ng n h t n y m m giai n non i u ki n h n nhân t o - Xác nh hàm l ng prolin giai o n non th i m tr c sau x lý b i h n - Nhân, tách dòng c a m t s gi ng ut c trình t gen chaperonin liên quan ng tr ng t i Tây Nguyên n tính ch u h n Ch 1.1.2 Giá tr kinh t c a ng ut NG QUAN TÀI LI U UT 1.1.1 m sinh h c c a c ut NG t V i u th ng n ngày, tr ng c nhi u v m, có th tr ng thu n, tr ng xen, luân canh g i v , tr ng ut thái khác nhau, v y sau lúa ngô, ng ng có tên khoa h c Glycine max (L) Merrill, có b nhi m s c th 2n = 40, thu c thân th o, h ut ng ng tr ng có giá tr kinh t cao, công nghi p, th c ph m, v a c i c i t o 1.1 CÂY ut u (Fabaceae), h ph cánh b ng có ngu n g c t t nh phía B c tr ng n n nông nghi p nhi t V m t dinh d m (Papilionoidea) ông B c Trung Qu c, vùng k c n c a C ng hòa liên bang Nga, Tri u Tiên Nh t B n.Các gi ng ut ng ut c nhi u vùng sinh ng có m t vai trò c bi t quan i ng, h t ut ng có thành ph n dinh d ng cao ch a 30- 56% protein, 12-25% lipit 20% gluxit [20], ngu n axit amin, vitamin (B1, B2, C, D, E) r t quan tr ng iv i i s ng c a ng i Protein ut ng có tác d ng h u hi u gi m cholesterol máu, gi m thi u nguy c b nh liên ang tr ng t i n c ta c du nh p t Trung Qu c t lâu V hình thái, R ut ut i [13] ng có r c c g m r r bên, b r c a nhi u n t s n ch a vi khu n Rhizobium japonicum có kh n ng c tr i cung c p m cho cây, có vai trò c i t o Thân quan ng b ph n r , thân, lá, hoa qu ut ut n tim m ch, chúng c ng ng n c n s phát tri n m m ung th , ng n ng a b nh th n, b nh ti u ng có nh nit t khí ut c gi i khát, n ng g m lo i lá: m m, n kép (có chét ôi có ut ng c s d ng r t a d ng u ph , ép thành d u ut c ch m áp ng nhu c u ng, m i c ng nh gia súc nh ng qu c gia phát tri n, ng i ta dùng ut ng vào k ngh khác nh bi n ch cao su nhân t o, m c in, s n, xà phòng, ch t t nhân t o, ch t nhiên li u l ng, d u làm tr n k ngh hàng không 4-5 chét) Trong tr ng tr t, Hoa m c thành chùm ho c tím, hoa u t nách lá, m i chùm hoa có t 10-15 hoa, có màu tr ng ng t th ph n hoàn toàn Qu có th th ng ho c cong có nhi u lông, m i qu ch a t 1-5 h t nh ng thông th H t u, n kh u ph n n hàng ngày c a ng thân ng sang màu vàng nâu Lá ng nh dùng tr c ti p h t khô ho c ch bi n thành làm bánh k o, s a t [9] ng có hình tròn, thân non có màu xanh ho c tím, qu chín ng, b nh x p x Trong công nghi p, s n ph m t ut ng 2-3 h t nâu, en, vàng, xanh Kh i l ut ng có màu ng c a ut ng ng i ta chia làm lo i: Gi ng chín s m (75-85 ngày), gi ng chín trung bình (80-100 ngày), gi ng chín mu n (110-120 ngày) Th i gian sinh tr ng m t y u t quan tr ng tr ng luân canh t ng v [28] ng c Rhizobium c ng sinh r Nh kh n ng c t tr ng t l a ch n t, t ng n ng su t nh N2 c a loài vi khu n nh m nên sau m i v thu c c i thi n rõ r t, l t ng khu h vi sinh v t hi u khí ng m ng t ng Do ó, có l i tr ng khác sau thu ho ch toàn b thân lá, r , ph l i b m t 1.1.3 Tình hình s n xu t Trên th gi i (tính ut ng th gi i n tháng 4/ 2006), có 78 n tích 91,3 tri u ha; n ng su t 22,9 t / ha, s n l s n xu t u t ng ng ng mc it o t i v i t v a có tác t Vi t Nam c tr ng ut ng v i di n t 236,1 tri u t n Các n c u th gi i là: M , Brazil, Argentina Trung Qu c chi m kho ng 90-95% t ng s n l ng có tác d ng c i t o c ho t d ng che ph ch ng xói mòn, v a ngu n h u c giàu ng h t r t a d ng t 20-400 mg/h t n c vào th i gian sinh tr ut u có ho ch thành ph n hóa tính c a ng n i nh mà ch có m t l p v bao quanh phôi m m H t có hình tròn ho c hình b u d c, tròn dài, tròn d t, v h t tr ng khác ng ut ng toàn th gi i [45] Nh v y, có th th y th gi i không ch ng chi m m t v trí quan tr ng n n kinh t c gieo tr ng di n tích l n c s d ng r ng rãi B ng 1.1 S n l ut ng 78 n c, mà h t ut B ng 1.2: Di n tích, n ng su t, s n l ng c a m t s n (Theo Oil World); c th gi i niên v 2006 – 2007 m Th gi i 236,1 M 86,8 Brazil 59,0 Argentina 47,2 Paraguay 6,5 Trung Qu c 16,2 n Ch tiêu Di n tích (1000 ha) n v tính: tri u t n 0,9 Liên bang Nga 0,7 2001 2002 2003 2004 2005 2006 124,1 140,3 158,6 165,6 182,5 203,6 185,8 ng (1000 t n) Hi n 12,0 12,4 13,0 13,3 13,3 14,3 13,9 149,3 173,7 205,6 219,6 242,1 290,6 186,9 ut ng c tr ng c vùng nông nghi p c n tích tr ng, n ng su t s n l a ng Di n tích m ut ng su t (1000 ha) S nl (1000 t n) 203,6 1430 291,5 67,3 16000 107,5 Vùng ông B c 48,4 1040 50,2 Vùng Tây B c 25,0 1150 28,7 c ng b ng Sông H ng Vùng B c Trung B 6,5 1220 7,9 Vi t Nam 0,3 Tây Nguyên 27,1 1570 42,5 Thái Lan 0,2 ông Nam B 5,3 1060 5,6 21,2 2100 44,5 ng b ng Sông C u long 0,4 c khác 0,8 ng 3.1 cho th y Tây Nguyên vùng có di n tích tr ng vùng nông nghi p c.Cùng v i s tr ng nh cao su, cà phê, h tiêu, ca cao….thì su t s n l th ng ut ng ã không ng ng t ng, m 2000 di n tích tr ng 203600 ha, n ng su t ut c bi t nh ng n m g n ng 124100 n n m 2005 t ng lên t t 12000 t /ha n m 2000 lên 14,300 t /ha n m 2005 ng t 147300 t n n m 2000 lên 290600 t n n m 2005 [21] ng (Kg/ha) C n Vi t Nam, vòng h n 20 n m qua (t 1985- 2006) di n tích, n ng s nl ng c a vùng n m 2005 0,8 Các n c, ng [21] B ng 1.3 Di n tích, n ng su t s n l Indonesia Nigeria ây: c qua n m i u ki n sinh thái c a m i vùng khác nên có s khác bi t rõ v di n 3,5 Ukraine ng c n 2000 ng su t (t /ha) S nl 7,7 Canada ut (Ngu n: T ng c c Th ng kê, 2006) ng làm th c ph m nguyên li u cho công nghi p ut ng tr ng phát tri n vùng M c dù, s n l ng ut ut ng l n th ng tr ng a lo i ut ng ng ang c t ng n c ta có t ng nh ng so v i n th gi i khu v c n ng su t c a ta v n th p, m g n ây di n tích, n ng su t s n l ng ut ng c a n c c bi t nh ng c ta gi m i k N m 2005 di n tích t 203600 gi m xu ng ch 185800 n m 2006 s nl thi t: axit linoleic 50%, c bi t có 7% axit anpha linolenic ngu n cung c p ng gi m t 290600 t n n m 2005 xu ng 186900 t n n m 2006 axit béo chu i m ch dài omega quan tr ng cho c Nguyên nhân Hexaenoic Acid) EPA (Eicosa Pentaenoic Acid ) [44] u t th p, ch a có b gi ng phù h p, ch a áp d ng k th t tiên ti n Vì v y, nghiên c u c i ti n các gi ng a ph sinh thái is c m nông sinh h c c a ng t o gi ng m i có n ng su t cao, thích nghi v i nh ng vùng khác b ng ph áp ng ng pháp truy n th ng k t h p v i hi n c yêu c u c a th c ti n tr ng v s phát tri n u n 1.1.4 Thành ph n hóa sinh h t Trong h t u t u ki n t ó c ng chi n l c quan c ta ut Ch t l ng lipit c a h t ng r t t t, công nghi p ch bi n th c ph m H t lipit, u t protein d tr ch t l ng có giá tr dinh d 56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có mu i khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, thành ngu n th c ph m quan tr ng cho ng 1.2 NGHIÊN C U V axit amin c b n isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, H n Protein thành ph n ch y u h t 30%-55% kh i l u t ut ng khô c a h t D a vào h s l ng, ng ng Chúng chi m kho ng i ta chia protein c a h t ut ng là: protein d tr (chi m 70% t ng s protein), enzim, ch t c ch proteaza lectin Thành ph n c a protein g m có albumin (9,5%), globulin tan n c (75,8%), globulin ch tan NaCl nh t ut ng, ut c xem protein có ch t l ng: Protein c a lo i u , ng t t nh t lo i protein th c v t Chúng có ch a t t c axit amin không thay th H n n a protein c a h u có hàm l v y, hàm l ng lysin r t cao so v i protein t lo i ng c c.Tuy ng axit amin có ch a g c SH (metionin, cystein) th p [8], [40] Hàm l ng lipit ng khô, ó hàm l u t ng cao chi m kho ng 12-25% kh i ng axit béo no th p, kho ng 13%, cholesterol, 30% axit béo ch a no m t n i ôi L ng ng tr ng c a h n i v i th c v t khái ni m dùng UT NG n th c v t ch s thi u n n, làm nh h ng c môi tr n sinh tr ng ng phát tri n c a Thi u n ng c tr c tiên nh h ng n s cân b ng n n ch c n ng sinh lý nh quang h p, hô h p dinh d nh n s sinh tr c c a cây, t ó nh ng khoáng cu i ng phát tri n c a th c v t Cây s ch t non ho c gi m s c s ng, gi m n ng su t [19] 3%, glutelin - protein tan NaOH 0,2M 11,7% [18], [25] Thành ph n axit amin c a h t ut i th c n cho gia súc [18] gây nên su t trình hay t ng giai ng thành lo i: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin Nh ng lo i protein h t nh làm cho C TÍNH CH U H N C A CÂY 1.2.1 Khái ni m v h n tác tryptophan, valin [20] ng cao.Trong ó, hàm l ng c a chúng y u t quy t vitamin A, B1, B2, D, E, F, men, sáp, nh a, cellulose Ngoài ra, h t có u ng Tóm l i, h t ng c s d ng r ng rãi ng có lo i vitamin tan c bi t vitamin E = 200 mg/100g lipit [8], h t kích thích sinh tr ut ut DHA (Docosa ng ch a m t s ch t khác nh hydrat cacbon, mu i khoáng, axit nucleic, ng ng có thành ph n ã bi t tính theo t l protein 30- ut th nh ng axit béo không no c n Hi n t môi tr nóng hay tác ng m t n c có th tác ng, ho c tác ng th c p ng s c p, k t qu c a s thi u n c gây b i nhi t th p, s c t ng c a mu i H n c ng nh y u t ngo i c nh b t l i khác tác ng lên c th th c v t s gây ph n ng c a c th Tùy theo t ng loài, gi ng mà m c ph n ng c a c th c ng nh thi t h i khô h n gây khác nhau: m t s b ch t, m t s b t n th ng nh ng c ng có m t s khác không b ng Kh n ng th c v t có th gi m thi u m c t n th g i tính ch u h n [19] ng thi u h t n nh c gây Vi t Nam m t n a phân b không hán có th x y c có a hình a d ng di n bi n khí h u ph c t p, l ng u gi a vùng, mi n gi a th i k n m nên h n b t k mùa nào, vùng Di n tích có t i 3/4 lãnh th t canh tác c a khu v c th i núi, Kh n ng c a t bào b m t n ng c a nghi t ó Trong vùng khác r t rõ r t T t c y u t chi ph i m nh m m c n c ng m thu nh n cc a t ch ng l i khô h n có th gi không b m t qua c, gi m di n tích lá, rút ng n chu k s ng…Kh n ng trì áp su t th m th u n i bào có tác d ng b o v ho c trì s c s ng c a t bào ch t b m t n hai lo i h n môi t Tác ng tác ng gây m t n a ng h n c y u t gi i h n i v i tr ng, v a s n ph m kh i u v a s n ph m trung gian cu i c a trình chuy n hoá sinh h c N c môi tr S tác ng ph n ng trao ng c a h n, gây nên hi n t i ch t x y [2] cao hay h n n c làm cho n n kho ng 40-50% quang h p c a s b Nh v y, nh h tr ng c ng nh h ng n ình tr c n tr s sinh tr ng c c oan c a h n ng c môi tr ng c t bào th t thoát nên kh i H n hán làm gi m m nh quang h p Khi hàm l b tc giai c ng c a n sinh tr ng c a n y u t c u thành n ng su t s n l ng tr ng m tn sâu s hút c nh ng ch u h n th cn c th ng ch u tác u t c ch y u ph thu c vào b r t ho c r lan r ng v i s l ng nói riêng, ng m nh c a h n b r ch a phát tri n ng, thi u n giai y c gây r i lo n toàn b ph th c v t, làm t ng ho c gi m hàm l ng th c chuy n hóa ng ch t chuy n hóa nh : ion K+, lo i c tích l y nh m ch ng l i vi c gi m m t n ch t nguyên sinh chúng có th t ng lên v hàm ng, axit h u c [2], [4], [30] S t ng h p tích l y ch t di n r t nhanh t bào m t n s t c, ch t hòa tan c, t ng kh n ng gi n cc a ng tác v i lipit ho c protein màng ng n ch n c a gen, hàng lo t gen ngh n s bi u hi n c ho t hóa t ng h p t o ch t c n thi t ch ng l i s khô h n [1] c ta n m khu v c nhi t ng gây nh h ng n sinh tr i gió mùa h n y u t t ng, phát tri n c a tr ng, nh h ng xuyên tác ng x u n ng su t ph m ch t c a chúng Vì v y, vi c nghiên c u c ch ch u h n s c s cho vi c c i thi n gi ng c ng nh t o c gi ng có tính ch ng ch u i ta ng khác nhau: phân tích hóa sinh h t n y m m nghiên c u a d ng enzym - amylaza proteaza hàm l ng protein tan, thành ph n axit amim, prolin Các proteaza óng vai trò quan tr ng c th s ng nh t th i ng có b r kh e, dài, m p, có s c xuyên nh ng n i sâu [19] Th c v t nói chung, ng thi u u ch nh áp su t th m th u [2] Vai trò c a b r : kh n ng thu nh n n tránh m t n i v m t sinh lý, sinh hóa nh m c Có hai c ch b o v th c v t t n t i môi tr c ó vai trò c a b r kh n ng u ch nh t ng lên giúp cho t bào t B ng c ch nh v y, th c v t có th v c tình tr ng h n c c b th c hi n theo nhi u h 1.2.2.1 C s sinh lý, sinh hóa c a tính ch u h n không c ng m t u ki n kh c Khi nghiên c u v kh n ng ch ng ch u c a tr ng l y h t ng 1.2.2 C s sinh lý, sinh hóa sinh h c phân t c a tính ch u h n Khi g p h n th c v t có nh ng bi n ct s phá h y màng ph c protein [24] Quá trình liên quan ng co nguyên sinh làm cho b héo S co nguyên sinh t bào di n n ng u ki n khô h n ASTT ng prolin, n ng ng là: làm t ng nhi t c nóng h n Nh ng th c v t t n t i môi tr c nh ng phân t n Thông th t h n không khí [1], [5] n lên ch y u theo hai h c N c [2] Có c tính quan tr ng cân b ng v áp su t th m th u òi h i ph i có kh n ng ch ng l i ng xuyên b h n nên thành ph n th nh kh n ng gi n u ch nh áp su t th m th u (ASTT): m t ng l n n non y u k n y m m c a h t Chúng r t a d ng Thành ph n ph c t p c a proteaza h t c t o b i s a d ng ch c n ng chúng m nhi m th i k n y m m Proteaza nói chung không ch tham gia vào phân gi i protein d tr h t, nh m cung c p axit amin cho th i k phát tri n u tiên c a mà chúng tham gia vào trình vi x lý phân t protein Proteaza tham gia vào phân gi i protein l 10 ho c b bi n tính g p Tr n Th Ph u ki n c c oan (l nh, m n, h n, tác ng Liên (1999) nghiên c u so sánh ph c a gi ng ut ng c h c ) [18] n di ho t tính proteaza ng ch u nóng ch u h n khác ã nh n xét r ng Proteaza trình h t n y m m c a h t t t c gi ng ut kh n ng ch u h n c a gi ng lúa c n có liên quan ng prolin Khi g p h n, lúa c n gi m hàm l prolin [24] Nguy n Th Thúy H n hàm l ng protein t ng hàm l ng nghiên c u r t a gi ng ut ng gi ng ut ng có s gi m t ng h p protein t ng c li u 1.2.2 C s phân t c a tính ch u h n t ng h p protein cho c th m i X lý nhi t tính proteaza m t s gi ng ch u h n, không nh h cao ch nh h ng Nguy n Th Kim Dung (2003) nghiên c u s bi n ng ho t o n h t n y m m c a gi ng l c ã rút k t lu n, ho t giai o n h t n y m m có xu h ngày tu i [6] C ng theo h r ng giai ng t ng t ngày tu i, b t proteaza có m i t Nh ng thay giai giai n i ho t c a proteaza hàm l n ngày tu i, hàm l giai nt ng n ng protein tan ho t c nhi u tác gi quan ng prolin g p h n Prolin m t axit amin có vai trò quan tr ng s ng th i m t axit amin a n ng n ch n s xâm nh p c a ion Na+ t c cho t bào, ng tác v i protein màng, ng n ch n s phá h y c a màng ph c protein khác Các k t qu nghiên c u u cho th y tr ng g p h n gi m t ng h p protein t ng t ng h p prolin [26], [28] Soulages cs (2003) ã ch ng minh vai trò t ng c ng b t l i c a nhi t lúa ut ng [ 38] Theo inh Th Phòng (2001), gây h n sinh lý b ng dung d ch sorbitol 5% hàm l ng prolin c a dòng ch n l c t ng lên v ng prolin liên quan t xa so v i i ch ng, s t ng hàm l ng ch u h n [30] Kh o sát ch t l lúa c n a ph ng n kh ng h t kh n ng ch u h n c a m t s gi ng vùng núi phía B c, Chu Hoàng M u cs ( 2005) ã nh n xét, 11 n c u trúc, ch c n ng c a thành ph n t bào trình x y m i vùng liên quan n kh n ng ch u nóng, ch u h n, m n, phèn c a th c v t Ph n ng c a th c v t tr c nh ng tác ng: nóng, h n r t a d ng ph thu c vào nhi u y u t khác nhau, ó có ki u gen, dài tính kh c li t c a i u ki n ngo i c nh Bi u hi n c a trình vi c sinh t ng h p m t lo t th c v t ng i ta ã có nh ng b m c giúp cho có kh n ng phân t c a hi n t ng nóng h n c ti p c n khác nhi u loài tr ng c nghiên c u nhi u nh t protein s n ph m bi u hi n gen [19] Nhóm protein c c bi t quan tâm bao g m: protein s c nhi t, môi gi i phân t , LEA Protein s c nhi t (heat shock protein- HSP): HSP có th c v t nh : lúa mì, m ch, lúa g o, ngô, h u h t loài u nành, hành, t i… chúng chi m kho ng 1% protein t ng s c a loài th c v t HSP ng kh n ng ch u h n chu i axit amin L – Prolin nhóm II có kh n ng ch ng l i tác i v i quan giai o n phát tri n khác u hòa ASTT c có kh n ng gi l y n ng t ng h p prolin [26 ] Kh n ng ch ng ch u c a sinh v t nói chung c a th c v t nói riêng liên thích ng Khi i sâu vào nghiên c u i hóa sinh khác h n gây c ng i hàm l ng c a T nh S n La c ng ã nh n xét r ng: g p h n ch t t bào, m t s hormon ho c ch t kích thích ng quan thu n ch t ch [29] tâm nghiên c u: nh s thay t bào, proteaza c a proteaza n ngày tu i, sau ó gi m t i tuân theo quy lu t chung : t ng u gi m n ho t ng nghiên c u Nguy n Th Thu Ngà (2007), cho n h t n y m m làm bi n protein tan S bi n ng n gi ng ch u nóng [18] ng ng ( 2006), nghiên c u v kh n ng ch u h n c a d ng, có ho t tính cao, có kh n ng phân gi i hoàn toàn protein d tr t o nguyên a ph ng protein hàm t bào g p i u ki n c c oan nh : h n, nhi t cao, c a HSP có ch c n ng ng n c n ho c s a ch a s phá r ng giá tr ng ng v i s ch ng ch u nhi t c t ng h p mu i cao S xu t hi n y stress nóng m cao Trong t bào th c v t HSP t bào ch t t p trung thành h t s c nhi t (HSG-Heat Shock Granules) Ng cho r ng HSP g n k t ARN polymeraza i ta ng n c n s phiên mã t ng h p mARN trình b stress nóng Sau s c nóng h t phân tán liên k t dày c v i ribôxôm ho t ng sinh t ng h p protein [19] 12 HSP có th chia làm nhóm d a c s kh i l ng phân t khác nhau: 110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa Trong ó có nhóm HSP70 HSP 60 có nhi u i di n c a ch t môi gi i phân t (g i chaperonin) HSP 8,5 kDa (Ubiquitin) có ch c ng b o v cho t bào nh ng không ph i môi gi i phân t Ubiquitin có ho t quan tr ng CCTα g n c ch t Ch c n ng g n li n v i s có m t c a ti u Vì trình t o c u trúc không gian CCT s tham gia c a protein d ng GroES, nên c ch t protein ch óng m c gi l i kh i hình tr nh c c bi t theo ki u b c thang c a vùng CCT Ngoài CCT có hai tính proteaza v i ch c n ng phân gi i protein ho t tính enzym nhóm nhân t tác Ubiquitin có MW r t th p, ch u nh h protein Trong ó nhóm nhân t A không óng vai trò công vi c c a t bào g p y u t c c oan, ng c a nhi t c bi t nhi t nên có vai trò t s a ch a cao [19] protein khác nhau, nh ng chúng n nh chu i polypeptit ang t ng h p t o c u trúc không gian úng cho chúng, (2) T o l i c u trúc không gian c a protein sau v n chuy n qua màng t bào, (3) L p ráp chu i polipeptit vào ph c b c 4, (4) MGPT c t ng c ng nh trình t ng h p t o c u trúc Các nhóm HSP 100, HSP 90 HSP 60 (chaperonin) lo i protein c u t o t ti u n v có kh i l 1.2.3 Nghiên c u v tính ch u h n lipit r t cao, m t nhóm môi gi i phân t m i Chúng giúp cho vi c t o c u trúc không gian úng c a protein khung t bào actin tubulin t bào ch t Chúng óng vai trò quan tr ng qua trình hình thành thoi vô s c c a giai n phân bào, c bi t th i k phát tri n m m t h t Chaperonin t bào ch t m t ph c có kh i ng phân t kho ng 90 kDa bao g m ti u (t ng n v có tên α, , , , , , , ng v i CCT1- CCT8) hình thành nên c u trúc vòng bi kép [16] Trong d ch chi t t bào ti u n v c u trúc không gian c a vòng bi có vai trò r t 13 ng ut ng có nhu c u v n ó h t ut ng có hàm l t ng h p 1kg ch t khô c n 500 - 530 kg n cc a Nghiên c u v l c a ph c t (CCT), hay g i ph c vòng ch a polypeptit-l c a ph c t (TriC) ut ut c cao h n ng protein c Trong trình ng c ng cao 50%, ó ngô ch 30%, lúa 26% [20 ] 60 kDa c ng có ho t tính ATP-aza [24] H CCT: Chaperonin c a t bào ch t, g i chaperonin ch a polypeptit- Trong tr ng l y h t n y m m nhu c u v n ng ng, nh ng ph n l n chúng sinh u ki n ngo i c nh b t l i nh h n, nóng, l nh Ch c n ng c a lo i khác HSP 70 nhóm MGPT có ho t tính ATP-aza có tính b o th cao Trong u có tính b o th cao có ho t tính ATP- chúng ng n ch n s co c m c a protein tái ho t hoá protein bi n tính [19] nhu c u c p thi t c a t bào, nh t s c nhi t i u ki n c c oan HSP có th ng n ch n s co c m k t t protein ng tác v i CCT nh ng l i tham gia vào aza M t s tìm th y t bào bình th g p u ki n c c oan MGPT có th chia thành m t s nhóm nh sau: u ch nh t o c u trúc không gian úng c a protein gi i phóng kh i CCT [18] u có ch c n ng tham gia t o c u trúc không gian úng cho protein t bào Ph n l n ch t MGPT có ho t tính ATP-aza, có ch c n ng: (1) Gi ng A B tham gia vào c u trúc không gian úng c a ho t tính c a CCT Nó không tham gia t Môi gi i phân t (MGPT): MGPT m t nhóm g m nhóm g m nhi u lo i nv: c tính ch u h n c a lý di truy n ã cho th y r ng, hoá keo c a nguyên sinh ch t, c a ut c c tính liên quan ch t ch ng tính tr ng a gen Chúng th hi n truy n c a t ng gi ng có kh n ng s d ng n ng phát tri n c a ng v ph m c a trình trao nh : v s phát tri n c a b r , tính chín s m t tr ut n c vào c ng ng di n sinh n c nhi u khía c nh khác i, c ng nh b n ch t di c ti t ki m trình sinh m này, ut ng c chia thành hai nhóm [18] - Nhóm ch u cs m tn - Nhóm ch u c s thi u n c t ng giai c t t c giai 14 m i ch t Tính ch u h n n phát tri n c a n phát tri n c a giai nh ng giai d n n g p h n, ut ng có th d v t qua h n, 1602 nucleotit mã hóa cho 533 axit amin [17] Nguy n Th Thu Hi n (2005), phân n sau nh giai o n hoa, k t qu , h t chín s a mà g p h n s l p n n ng su t gi m k Trong nh ng n m g n ây nhà khoa h c ã có nhi u thành công nghiên c u sâu h n v tính ch u h n c a ut - 95 t r ut u c cDNA c a LEA nhóm D ng b h n [36] c tìm th y l ng l n m m ut ng d i tác ng c a nhi t c 751bp liên quan n kh n ng ch u h n t hai ng Cao B ng [11] ng tr ng có giá tr kinh t cao, công nghi p, Vi t Nam, u t t c tr ng ph bi n k , nh ng so v i n c ta nhi u qu c gia th ng chi m m t v trí quan tr ng n n nông ng ut ng có s t ng c th gi i n ng su t c a gi ng ut ng m c th p 1.3.2.Trong h t ut ng có thành ph n ã bi t tính theo t l protein 30-56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có mu i khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; m 2004, nhóm nghiên c u g m Huang cs c a Tr nhiên K thu t Pingtung, mARN v i kích th ut th c ph m, v a c i c i t o gi i c u trúc d ng h t nguyên sinh ch t nhân v i protein b bi n tính.[35] h p proline ng Kh nghi p Trong nh ng n m g n ây n ng su t s n l Jinn tác gi khác (1997) nghiên c u v sHSP nhóm (15-18 kDa) ã nh n th y, chúng t ng lên ng vàng M 1.3.1 c cDNA c a dehydrin t c, tác gi phân l p ut 1.3 NH N XÉT CHUNG ng Maitra Cushman (1994) ã phân l p ng b m t n c gen dehydrin v i kích th gi ng ài Loan, ã phân l p ng c gen P5CS i h c T ut c 2148bp [45] Gen P5CS nhân t gi i h n cho nh p th c v t vitamin A, B1, B2, D, E, F….Trong ó, hàm l ng t chúng y u t quy t t ng tr ng cho ng u ki n b t l i h n m n gây nên [39] 1.3.3 nh làm cho u t ng protein d tr ch t l i th c n cho gia súc ut ng lo i có nhu c u v n Nghiên c u c a Porcel Cs (2005), ã ch r ng, gen mã hoá protein dehydrin khác, thu c vào nhóm ch u h n H n ã nh h (LEA-DII) có vai trò v i kh n ng ch ng ch u c a phát tri n c a ut ng Vi t Nam ã có m t s công trình nghiên c u phân l p gen liên quan n kh n ng ch u nóng, ch u h n c a trình t gen chaperonin t gi ng ut ut ng Nghiên c u phân l p ng ch u nh Bonminori- Nh t c n v i kích ng c a ng tr thành ngu n th c ph m quan ch u h n c a ut ut c cao h n lo i tr ng ng l n n trình sinh tr ng, ng làm gi m n ng su t, ch t l ng Nghiên c u v tính ng ng hóa sinh h t n y m m i ta th c hi n theo nhi u h ng khác nhau: phân tích nghiên c u a d ng enzym - amylaza proteaza hàm ng protein tan, thành ph n axit amin i sâu vào nghiên c u m c phân t , th c phân t 1,6 kb c a Nông V n i cs (1997) [12] Nghiên c u c a Tr n Th c nghiên c u nhi u nh t protein s n ph m bi u hi n gen Nhóm protein Ph ng Liên (1999) ã phân l p, xác nh trình t gen chaperonin t bào ch t CCT c t gi ng ut ng t bi n M103 v i kích th amin Trình t gen có s thay 308 ( Ser Ala), s thay Tác gi kh ng nh s thay i axit amin v trí 99 (Ser Thr), 280 (Ser Gly) i tuân theo quy lu t t ng kh n ng ch u nhi t i c n c lý gi i kh n ng ch u nóng c a gi ng t bi n M103 [18] Tr n Th Ph chaperonin CCTδ t gi ng c 1602 bp mã hóa cho 533 axit ut ng Liên cs (2003), ã phân l p ng a ph 15 ng ch u c gen n Cúc Vàng, gen g m c bi t quan tâm bao g m: protein s c nhi t, môi gi i phân t , LEA 1.3.4 Trên th gi i ã thành công vi c nghiên c u gen mã hóa protein ut ng trình t gen ã c công b ngân hàng gen th gi i T i Vi t Nam, ã có m t s tác gi nghiên c u v tính ch u h n ã phân l p, gi i trình t gen liên quan gi ng ng a ph u t n tính ch u h n c a ut ng, ó có chaperonin ng khác Tuy nhiên, vi c nghiên c u gi ng ng c a t nh khu v c Tây Nguyên 16 c quan tâm ý u Ch - Máy phân tích axit amin t ng NGUYÊN LI U VÀ PH ng - HP amino Quan SeriesII (Hewlett Parkard, M ) NG PHÁP NGHIÊN C U - Máy phân tích trình t gen ABI 3100 Genetic Analyzer (M ) 2.1 NGUYÊN LI U -B 2.1.1 Nguyên li u th c v t Các gi ng u t - Pipetman lo i (Gilson, Pháp) ng a ph Kon Tum (ST), Ch mnga- ng: Az mpa- Gia Lai (AZP), Sa Th y - k L k (CNg) Trung tâm Tài nguyên Di truy n th c v t - Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t Nam cung c p Gi ng a ph ng Duy Linh- Lâm Trung tâm Khuy n Nông t nh ut i ch ng HN9 ng nghiên c u - Máy soi ADN (Bio-Rad, M ) Tên gi ng Ký hi u Duy Linh DL Gi ng a ph ng, Duy linh- Lâm Sa Th y ST Gi ng a ph ng, Sa Th y- Kon Tum mnga CNg Gi ng a ph ng, Ch mnga- HN9 Gi ng i trà Ngu n g c ôn5 Az mpa AZP Gi ng - Máy li tâm l nh ( ng c) - Máy o pH (Metter Toledo, Th y S ) a kL k c tr ng ph bi n c) - Máy khu y tr n Voltex ( huy n Buôn m nghiên c u: Các thí nghi m c th c hi n t i Phòng thí nghi m Di truy n h c Công ngh gen, Khoa Sinh- KTNN, Tr i h c Thái Nguyên Các phân tích axit amin t kl k a ph - N i kh trùng (Tomy- Nh t) - Máy PCR (ABI System, M ) TT HN9 - T s y (Anh) - Cân i n t (Thu S ) - T l nh sâu – 850C (Sanyo, Nh t B n) ng (DL) gi ng k L k cung c p B ng 2.1 Ngu n g c c a gi ng n nhi t (Techne, OSI, Anh) c th c hi n t i Phòng thí nghi m tr ng ng, Az mpa- Gia Lai ng ng xác i h c S ph m nh trình t gen m Công ngh gen, Vi n Công ngh sinh h c, Vi n Khoa h c Công ngh Viêt Nam 2.1.2 Hóa ch t, thi t b a m nghiên c u Hóa ch t: dùng cho thí nghi m phân tích hoá sinh sinh h c h c phân t : g m lo i hoá ch t mua c a hãng Anh, c, M , Trung Qu c: EDTA, NG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1 Ph ng pháp hoá sinh 2.2.1.1 Phân tích hóa sinh (1) Xác CTAB, TAE, Agarose… Các hóa ch t thông d ng khác: axit citric, NaOH, NaCl, CH3COONa, ethanol (70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, n c kh ion, NaH2PO4, Fe2( SO4), K3Fe( CN)6, CuSO4, ninhydrin… Thi t b : Các thi t b 2.2 PH c s d ng phân tích hoá sinh sinh h c - Máy quang ph UV-Vis Cintra 40 (Australia) - Máy i n di + b ngu n PowerPac 300 (Bio-Rad, M ) 17 giai n h t ti m sinh ng lipit D a vào tính ch t hoà tan c a lipit dung môi h u c môi h u c chi t rút, dung c s d ng petroleum ether [24] M u em s y khô, bóc v , nghi n m n Cân 0,05g m u cho vào m i ng Eppendorf (3 ng Eppendorf / m u) Ti p theo, cho 1,5ml petroleum ether vào m i ng, l c phân t g m: nh hàm l o u, ng n l nh 4oC 24 gi , em ly tâm 12000 vòng/phút 20 phút, b d ch, l p l i thí nghi m l n Sau ó, s y khô m u l i epp n kh i l ng không i r i cân m u Hàm l 18 ng lipit 700C c tính theo công th c: (2) Hàm gây h n ng prolin thân, c a gi ng nghiên c u t ng theo th i gian u cao h n so v i i ch ng NH9 Gi ng DL AZP có hàm l prolin cao nh t, gi ng NH9 có hàm l ng ng prolin th p nh t (3) K t qu nghiên c u v kh n ng ch u h n c a gi ng o n non phù h p v i k t qu nghiên c u 3.2.3 M i quan h gi a gi ng ut giai ut ng giai n h t n y m m ng d a s bi u hi n c a tính tr ng M i gi ng ng c a môi tr protein, hàm l ut ng có m t ki u gen quy nh m c ph n ng ng lipit, hàm l Chúng ã xác nh ng axit amin, hàm l ng (b ng 3.9) s ut ng b ng ch hình (hình 3.11) mô t s phân nhóm c a gi ng ng trình NTSYS pc 2.02i B ng 3.9 H s khác gi a gi ng DL DL 0,000 ST 6,697 ST CNg Hình 3.9 S ut ng (%) NH9 UT AZP 4,756 2,012 0,000 8,161 8,175 4,548 3,857 5,175 1,157 ut 0,000 Ch mnga- 8,918 kh i m m, gi ng có kh n ng ch u h n t t giai u có h s khác cao h n c p v i gi ng u ph n ánh m c ph n ng i v i h n c a gi ng nghiên c u khác s khác ki u gen quy k L k, Az mpa – Gia Lai gi ng ut n nh dung d ch i 6M, CTAB 4% ng nh C p gi ng có h s khác th p nh t AZP- CNg (1,157%), cao nh t c p AZP- NH9 (8,918%) Hình 3.9 cho th y, gi ng ut ut ng phân b nhóm chính: nhóm I gi ng DL, nhóm II phân thành nhóm ph (nhóm ph I gi ng AZP; nhóm ph II -85°C cho g m ba gi ng ST, NH9, CNg) CÂY ng i ch ng NH9 M m n s d ng M m tách chi t c tách c nghi n thành d ng b t l nh -85°C ADN c a h gen c bi t v i ut c chi t kh i t bào ng t bào c a chúng ch a nhi u protein nên c b ng chloroform ph m ADN T 0,5g m i lo i thu m u ADN có u t ng, Sa Th y – Kon Tum, m chi t có ch a Tris HCL 1M, pH 8,0; EDTA 0,5M pH 8,0; NaCL x lý d ch chi t thu c sóng ng ng ADN t ng s bao g m gi ng: Duy Linh – Lâm 0,000 ut N NG CH U H N NG m n c i chày x B ng 3.9 cho th y, gi ng h t n y m m non N KH Chúng s d ng m m ngày tu i c a gi ng 0,000 CNg ch ng NH9 mô t m i quan h c a gi ng 3.3 PHÂN L P GEN LIÊN QUAN 3.3.1 Tách chi t ADN t h gen c a gi ng NH9 AZP ng ng prolin, t l thi t h i c h s khác v kh n ng ph n ng c a gi ng ut Gi ng i v i tác ng, d a s bi u hi n c a tính tr ng nh : hàm l tinh s ch nh n ng c 200µl d ch chi t ADN Các c ki m tra b ng ph = 260 nm 280 nm ADN h p th Sau xác lo i b protein kh i ch ng pháp quang ph h p th b c sóng 260 nm , ki m tra ch ph m ADN b ng ph ng pháp i n di gel agarose 0,8% K t qu cho th y, ch có m t b ng t p 43 44 trung phân t ADN, có phân t l c tách chi t t gi ng ch t ut ng m b o cho vi c s d ng M ng l n (hình 3.10) ut ng i u ch ng t , ADN i s ch, không b M t gãy, t p nhân b n gen b ng k thu t PCR 1.6kb Hình 3.11 Hình nh gi ng ut n di n gen chaperonin c nhân lên b ng k thu t PCR ng (M: Thang ADN chu n; 1- DL: 2- ST; 3- CNg; 4- NH9; 5- AZP) 3.3.3 Tách dòng s n ph m PCR ki m tra vect tái t h p mang Hình 3.10 nh n di ADN t ng s t gi ng ut ng chaperonin b ng enzym gi i M- Thang ADN chu n; 1- DL ;2 – ST; 3- CNg; –NH9; – AZP 3.3.2 Nhân gen chaperonin t bào ch t gi ng S d ng ADN h gen làm khuôn ut nm i t ng h p d a vào trình t cADN c a chaperonin t bào ch t gi ng l nh Nh t B n Trên c s xác nh c n ng ng, Sa Th y - Kon Tum, Ch mnga xác ut g nm i c ng ch u ng (Duy Linh - Lâm k L k Az mpa – Gia Lai), m c ích nh s có m t c a gen chaperonin c a gi ng nhi t, nhi t ut 3.3.3.1 Tách dòng khuôn t i u cho ph n ng PCR, ã ti n hành nhân gen chaperonin c a gi ng ut c h xu ng 550C ây nhi t ADN c a h gen Sau 32 chu k ph n ng, s n ph m PCR ng Trong chu trình t i u g n m i vào c ki m tra b ng n di gel agaroza 1% (hình 3.11) K t qu nhân gen cho th y, c gi ng PCR v i kích th c phân t 1,6 kb Kích th ut ng c phân t c a cADN gen chaperonin gi ng Nh t B n u ch ng t u t chaperonin intro c u trúc gen L ph n ng PCR ut ng ADN c ng Bonminori - ng nghiên c u th c hi n nghiên c u ti p theo 45 c s n ph m c s n ph m PCR nh n b ng kích th c gi ng u thu u t n gen ng Duy Linh – Lâm ng (DL) NH9 ng b ng k thu t PCR nhân gen chaperonin v i n c a hai gi ng u có gen c nhân lên qua n ph m PCR a hai gi ng ut ng DL NH9 t o c s cho vi c xác nh trình t gen chaperonin sau ã nhân cm ts l ti n hành tách dòng phân t 1.2 Tách dòng ng l n a hai gi ng n gen b ng u t ng thu t PCR Chúng n gen ã nhân v i vi c s d ng vet tách dòng Pjet c th c hi n b ng cách g n tr c ti p s n ph m PCR vào vect tách dòng plasmit Pjet 1.2 sau ó bi n n p vào ch ng E coli c y môi tr l c có ampixillin Trên môi tr ng này, ã thu ng ch n c nhi u khu n c tr ng m t s khu n c xanh Theo lý thuy t, khu n c tr ng c o t t bào mang vet có g n ADN ngo i lai Nh m xác nh xác khu n c ó có mang n ph m PCR mong mu n hay không, ti n hành tách chi t ADN plasmit a m t s khu n c tr ng ch n pCR15(NH9) có ADN plasmit v i c khu n l c pCR9(DL), pCR11(DL), di 3.3.3.2 Ki m tra vet tái t h p mang ki m tra kích th ng i n di cao h n i ch ng n gen chaperonin b ng enzym gi i c th c t c a c t ki m tra m u ADN plasmit thu c b ng enzym EcoRI 46 n n ADN xen vào, ti n hành trí c a enzym plasmit Pjet 1.2 n m bên a 10 n g n N u vect tái t h p g n 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | n gen mong mu n sau c t b ng enzym gi i m t n plasmit tái t h p v ng n ADN dài kho ng 1,6kb K t qu n di sau c t cho th y, tái t h p có KTPT 1,6 kb t n ADN ng ng v i kích th tách dòng Vì v y, có th kh ng c c t v ng kh i vect c c a o n gen chaperonin c n nh r ng ã ch n c dòng plasmit AB004233 ATGTCGGCAA TCGCGGCTCC CCAACACAGA TCCTCGAAGA CAGAGTCCTA CGTGGACAAT M103 .G T C Cuc vang .G C .G T C DL-CHAP1 DL-CHAP2 .G C .G T C NH9 70 tái t h p (2,3) c a m u DL dòng plasmit tái t h p (4) c a m u NH9 có ch a o n chaperonin có kích th c 1,6 kb (hình 3.12) M 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | AB004233 AAGCGCAAGG AGGATATCCG CCATGCCAAC ATCGTGGCCG CACGCTCAGT CGCCAACGCG M103 .T C C G C Cuc vang .T C C C DL-CHAP1 DL-CHAP2 .T C C C NH9 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | 1,6kb Hình 3.12 i n di M: Marker kích th n ph m c t plasmit tái t h p b ng enzym gi i c phân t ; 1: Plasmit Trình t gen chaperonin c a hai gi ng u t ng DL NH9 ng pháp Sanger máy xác c Clustal trình gen chaperonin c a gi ng ut t bi n ch u nóng M103 gi ng Vàng (CV) (hình 3.13) 47 nh trình t ADN t ki m tra k t qu chaperonin, s d ng ph n m m sinh gi ng C C DL-CHAP2 C NH9 190 u ng DL NH9 ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analizer Cuc vang DL-CHAP1 i ch ng âm; 2: plasmit pDL- Chap1; 3.3.4 K t qu gi i trình t nucleotit c a gen chaperonin c a hai gi ng nh theo ph GTTCGCACCA GTCTGGGCCC TAAGGGCATG GACAAGATGA TCTCCACCTC CTCCGACGAG n 3: Plasmit Pdl - Chap2; 4: Plasmit pNH9 hành xác AB004233 M103 c ti n u t ng a ph ng ch u h n Cúc 220 230 240 AB004233 GTCATCATCA CCAACGACGG CGCCACCATC CTCAACAAGA TGCAGGTCCT CCAGCCCGCC T Cuc vang T T G G DL-CHAP1 LD-CHAP2 T NH9 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | c trình t gen ng ch u l nh Bominori – Nh t B n, 210 M103 ng so sánh trình t gen v i 200 | | | | | | | | | | | | AB004233 GCCAAGATGC TCGTCGAGCT CTCCAAGTCC CAGGACTCCG CCGCCGGCGA CGGCAGCACC M103 C T Cuc vang C TT DL-CHAP1 C DL-CHAP2 C T NH9 C 48 310 320 330 340 350 360 610 | | | | | | | | | | | | 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | AB004233 ACCGTCGTCG TCATCGCTGG CGCCCTCCAC GAGCAGTGCC TCCTCCTCCT TTCCCACGGC AB004233 GTCAAGATCG TGAAGAAACT CGGCGGCACC GTCGACGACA CCGAGCTCGT GAAAGGTCTC M103 T C M103 G G T C .C Cuc vang T Cuc vang DL-CHAP1 T DL-CHAP1 G DL-CHAP2 T T C DL-CHAP2 G G NH9 T C NH9 370 380 390 400 410 420 670 | | | | | | | | | | | | 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | AB004233 ATCCACCCCA CCGTCGTCTC CGAGCCCCTC CACAAGGCTG CCGTCAAGGC CGTTGACGTT AB004233 GTCTTTGACA AGAAGGTCAG CCACGCCGCC GGGGGACCCA CCCGCATGGA GAACGCCAAG M103 .CGG G C M103 Cuc vang .CG C Cuc vang T DL-CHAP1 .CG C DL-CHAP1 DL-CHAP2 .CG G C DL-CHAP2 T NH9 .CG C NH9 C 430 440 450 460 470 480 730 | | | | | | | | | | | | 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | AB004233 CTCACCGCCA TGGCCGTCCC CGTCGAACTC TCCGACCGCG ACTCCCTCGT GAAGTCCGCC AB004233 ATCGCCGTCA TTCAATTCCA GATTTCGCCG CCCAAAACCG ACATCGAACA GAGCATTGTG M103 G M103 T A Cuc vang Cuc vang .A G T A DL-CHAP1 DL-CHAP1 DL-CHAP2 G T T DL-CHAP2 .A G G T A NH9 NH9 490 500 510 520 530 540 790 | | | | | | | | | | | | 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | AB004233 AGCACTTCCC TCAACAGCAA GGTCGTCAGC CAATACTCCA CGCTCCTCGC TCCCCTCGCC AB004233 GTGAGTGATT ACTCTCAGAT GGATAGGATT CTAAAAGAAG AGCGTAGTTA TATTCTCAGC M103 .A G G M103 G .G Cuc vang Cuc vang G .G DL-CHAP1 DL-CHAP1 DL-CHAP2 .A G G DL-CHAP2 G .G NH9 NH9 550 560 570 580 590 600 850 | | | | | | | | | | | | 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | AB004233 GTCGACGCCG TTCTCTCCGT CGTGGATGCC CCCAAGCCCG ACATGGTCGA TCTCCGCGAT AB004233 ATGATTAAGA AGATCAAGGC CACTGGTTGT AATGTGTTGT TGATTCAGAA GAGTATTTTG M103 G M103 Cuc vang Cuc vang DL-CHAP1 DL-CHAP1 DL-CHAP2 T C G C DL-CHAP2 NH9 NH9 49 50 910 920 930 940 950 960 1210 | | | | | | | | | | | | 1220 1230 1240 1250 1260 | | | | | | | | | | | | AB004233 AGGGATGCGG TTACTGATTT GTCCTTGCAT TACCTTGCAA AAGCTAAGAT TTTGGTCATT AB004233 GATGCTTTGT GTGTTGTTAG GTGTTTGGTT GCCAAGAGGT TTCTCATTGC CGGCGGTGGT M103 G C M103 Cuc vang T C Cuc vang DL-CHAP1 DL-CHAP1 DL-CHAP2 T C DL-CHAP2 NH9 NH9 970 980 990 1000 1010 1020 1270 | | | | | | | | | | | | 1280 1290 1300 1310 1320 | | | | | | | | | | | | AB004233 AAGGATGTGG AGAGGGATGA GATTGAGTTC ATTACCAAGA CACTGAATTG TTTGCCCATT AB004233 GCCCCTGAGA TTGAGCTCTC CAGGCAGCTG GGTGCCTGGG CTAAGGTGTT GCATGGGATG M103 M103 Cuc vang Cuc vang G DL-CHAP1 DL-CHAP1 DL-CHAP2 DL-CHAP2 G NH9 NH9 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1330 | | | | | | | | | | | | 1340 1350 1360 1370 1380 | | | | | | | | | | | | AB004233 GCTAACATTG AGCATTTTCG CACTGAGAAG TTGGGTTATG CTGATCTTGT GGAAGAGTTT AB004233 GAGGGTTACT GTGTGAGGGC ATTCGCTGAG GCGCTTGAAG TTATTCCCTA TACTCTGGCT M103 M103 .T .T Cuc vang C .G Cuc vang DL-CHAP1 DL-CHAP1 DL-CHAP1 C .G DL-CHAP2 .T NH9 NH9 1090 1100 1110 1120 1130 1140 1390 | | | | | | | | | | | | AB004233 TCTCTTGGGG ATGGGAAGAT TGTGAAGATT ACTGGTATTA AGGAGATGGG GAAGACCACC M103 G Cuc vang G DL-CHAP1 DL-CHAP2 G NH9 1150 1160 1170 1180 1190 ACTGTGCTTG TACGTGGGTC TAATCAGCTT GTGCTCGATG AGGCTGAGCG GAGTTTGCAC Cuc vang T C A DL-CHAP1 DL-CHAP2 T C A NH9 1420 1430 1440 AB004233 GAAAATGCTG GTTTGAACCC GATTGCCATT GTTACTGAGC TAAGGAATCG TCATGCACAG C .G Cuc vang G C .G DL-CHAP1 DL-CHAP2 G C .G NH9 1200 AB004233 1410 M103 1450 | | | | | | | | | | | | M103 1400 | | | | | | | | | | | | 1460 1470 1480 1490 1500 | | | | | | | | | | | | AB004233 GGTGAGATAA ATGCTGGAAT AAATGTAAGG AAGGGGCAGA TTACCAACAT CTTGGAGGAG M103 G .T Cuc vang G .T DL-CHAP1 DL-CHAP2 G .T NH9 51 52 1510 1520 1530 1540 1550 1560 T k t qu th ng kê th y So sánh v i gen chapronin c a gi ng u | | | | | | | | | | | | AB004233 AATGTGGTGC AGCCCCTGCT TGTGAGCACC AGTGCGATCA CCTTGGCGAC AGAGTGTGTG M103 CT .T Cuc vang .T .T A TG DL-CHAP1 DL-CHAP2 .T .T A TG NH9 1570 1580 1590 1600 CGGATGATTT TGAAGATTGA TGATATTGTA ACTGTGAGGT AG M103 Cuc vang DL-CHAP1 DL-CHAP2 NH9 Hình 3.13 Trình t gien chaperonin t bào ch t gi ng NH9, gi ng ut ng ch u gi ng ut ng ch u nh Nh t T gi ng DL nhân ng 3.10 Th ng kê trí nucleotit thay STT ut ng DL, gi ng DL- Chap1 DL- Chap2 i trí nucleotit gen a gi ng ng 3.10 i gen chaperonin DL- Chap 1, n i) Trình t gien chaperonin ng 99,56% (v i ut ng ch u nóng M103 a DL- Chap1 có t l t trí nucleotit axit amin thay amin thay trí axit amin thay ng i) Còn so v i gi ng ng t , gen chaperonin ng i) Gen chaperonin DL- trí nucleotit 10 a gi ng NH9 có t l t ng ng ng 97,81% i) Gen chaperonin c a DL- Chap2 có ng 99,06% (v i 15 v trí nucleotit axit amin thay ng i) ng 97,94% (v i 33 v trí nucleotit axit i) ( v i 47 a gi ng Cúc Vàng: DL- Chap1 có t l trí nucleotit 98,74% ( v i 20 i i) DL- Chap2 có t l trí nucleotit axit amim thay ng nh t 97,06% ( v i 47 amin thay trí axit amin thay ng nh t i) gi ng NH9 có t l trí nucleotit 10 axit amin thay a trình t gen ng nh t 97,06% c trình bày i) trí axit ng 3.11 T b ng 3.11, so sánh v i trình t axit amin a gi ng ut ng Bonminori trình t axit amin a gen chaperonin DL- Chap1, DL- Chap2 G196C, A329T, G384C, C385G, T114C, A617G NH9 có s thay ng t nh gi ng ch u A24G, A28C, A42G, G54C, T60G, G72T, T75G,T84C, A108C, T141C, C195T, G196C, C300T, C315T, A329T, T351C, G384C, ch u nóng M103 C385G, C405G, T414C, A447G, C453T, C480T, T486A, A513G, C528G, C555T, G564C, C571G, T591C, C603G, A618G, G693T, DL- Chap2, NH9, Cúc vàng M103) Gi ng Bonminori trí 128 Glu → Asp (DL- Chap1, DL- Chap2, NH9, Cúc Vàng M103) Ngoài ra, v trí 110 His → Leu trí nucleotit thay i C1189A, C1263G, C1344T, A1383G, T1416C, A1422G, A1467G, G1476T, G1518T, G1524T, C1530A, C1541T, C1542G NH9 ng 96,25% (v i 60 V i trình t gen T732A, A735G, A740G, G750T, C759A, A816G, A838G, G909T, A939C, T1059C, T1078G, T1116G, G1173T, T1185C, trí axit amin thay ng t bi n M103 n – Bonminori DL- Chap2 NH9 so v i Bonminori – Nh t Ký hi u ng Chaperonin gi ng NH9 có t l t a gi ng n Cúc Vàng, gi ng c th hi n Chap2 có t l t l a DL- Chap1, DL- Chap2 gi ng NH9 so v i cADN n trí nucleotit (v i 35 c gen khác (chaperonin h gen), Bonminori (AB004233) Nh t n, gen chaperonin DL- Chap1 có t l t 99,68% (v i th ng kê t t tên DL-Chap1 DL-Chap2 Th ng kê i m thay chaperonin ng Bonminori- Nh t trí nucleotit axit amin thay | | | | | | | | AB004233 t i m t s v trí t th , gi ng ch u nh Bonminori có Ser 99 → Thr (DL- Chap1, 110 (DL- Chap1, DL- Chap2, NH9, Cúc Vàng M103) (DL- Chap1, DL- Chap2, NH9 Cúc vàng) G296C, A329T, T350C, G384C, C385G, T414C, T707C 53 n Cúc Vàng gi ng 54 v trí 129 Pro → Ala ng 3.11 Trình t axit amin a gen chaperonin thay i gi ng ut ng Trình t axit amin gen chaperonin amin thay TT trí Boniminori M103 Cúc Vàng DL- Chap1 DL-Chap2 NH9 24 Glu (E) Asp (D) Asp (D) Glu (E) Asp (D) Glu (E) 54 Ile (I) Ile (I) Thr (T) Ile (I) Ile (I) Ile(I) 76 Val (V) Val (V) Gly (G) Val (V) Val (V) Val (V) 99 Ser (S) Thr (T) Thr (T) Thr (T) Thr (T) Thr (T) 100 Thr (T) Ile(I) Thr (T) Thr (T) Thr (T) Thr (T) 110 His (H) Leu (L) Leu (L) Leu (L) Leu (L) Leu (L) i so v i gi ng a DL- Chap2 có 10 ng ch u trí axit amin thay gi ng v i Cúc Vàng gi ng c bi t, có ut ut a gi ng Cúc Vàng có 12 trí axit nh Bonminori Còn gen chaperonin i, ó có ng ã trí thay i hoàn toàn c ánh giá có kh n ng ch u n trí Ser99→ Thr, Ser 280 → Gly tuân theo quy lu t t ng kh n ng ch u nhi t Trong c u trúc phân t c a gen chaperonin có vùng ch c n ng - Vùng ho t tính ATPaza vùng b o th thay - Vùng g n v i ATP, ây vùng t (Gly96 n Vall102 ut 117 Leu (L) Leu (L) Leu (L) Leu (L) Leu (L) Pro (P) 128 Glu (E) Asp (D) Asp (D) Asp (D) Asp (D) Asp (D) 129 Pro (P) Gly (G) Ala (A) Ala (A) Ala (A) Ala (A) 10 191 Pro (P) Pro (P) Pro (P) Pro (P) Ala (A) Pro (P) nh c a chaperonin t bào ch t, n m n Leu 306 u t ng) Trong vùng gen chaperonin Bonminori có v trí axit amin 280 Ser, v trí DL- Chap2 thay b ng Gly Hai v trí axit amin thay gen chaperonin c a i trình t DL- Chap2 vùng ch c n ng tuân theo quy lu t bi n 11 204 Val (V) Val (V) Leu (L) Val (V) Val (V) i a enzym Val (V) ch u nhiêt C ch t ch y u c a chaperonin t bào ch t protein t o khung t bào: tubulin actin [19] V y, s thay 12 206 Lys (K) Lys (K) Lys (K) Arg (R) Lys (K) Lys (K) 13 220 Leu (L) Leu (L) Pro (P) Leu (L) Leu (L) Leu (L) 14 236 Met (M) Met (M) Met (M) Met (M) Met (M) Thr (T) 15 247 Gln (Q) Gln (Q) Gln (Q) Gln (Q) Arg (R) Gln (Q) 16 280 Ser (S) Gly (G) Gly (G) Ser (S) Gly (G) Ser (S) 17 308 Ser (S) Ala (A) Ser (S) Ser (S) Ser (S) Ser (S) 18 360 Phe (F) Phe (F) Val (V) Phe (F) Val (V) Phe (F) 19 506 Leu (L) Pro (P) Leu (L) Leu (L) Leu (L) Leu (L) 20 514 Thr (T) Thr (T) Met (M) Thr (T) Met (M) Thr (T) i axit amin theo kh n ng ch u nhi t c a protein có th nguyên nhân t o tính ch u h n c a gi ng DL Tuy nhiên kh ng 55 v trí axit amin t v trí DL- Chap2 thay b ng Thr - Vùng g n c ch t ph c CCT t i ví trí v trí axit amin (Glu 209 i i b o th n m ng) Trong vùng gen chaperonin gi ng Bonminori - Nh t B n có axit amin 99 Ser, c ng ng nh u c n ph i nghiên c u sâu h n v protein 56 c u trúc s bi u hi n c a T LU N VÀ Gen chaperonin DL- Chap2 có NGH Nh t K T LU N 1.1.Các gi ng ut ng a ph phong phú v hình thái, kích th Hàm l ng lipit dao ã xác nh ut ng dao ng 1000 a ng t 33,12% ng kho ng t 12,53% ng protein lipit h t có m i t 1.3 trí thay i t n 18,33% ng t nh gen chaperonin a gi ng ch u n i a enzym ch u nhi t NGH 1.1 Trên c s k t qu nghiên c u c a lu n v n, có th ti p t c m HSP… i v i 1.2 Gi ng ut ut a ph ng Duy Linh - Lâm gi ng ut ng có m i t proteaza giai ng quan thu n, liên quan ut ng n h tn ym m c a n kh n ng ch u h n c a t ng gi ng Gi ng DL có kh n ng ch u h n t t nh t sau ó gi ng AZP, CNg, ST cu i gi ng NH9 1.5.Các gi ng bi u hi n h nt ng ch u h n ng nghiên c u có ph n ng khác i cao nh t ( 8972,53), th p nh t gi ng NH9 (3529,76) Kh n ng giai c a gi ng 1.6 n non c a gi ng ut ã xác ng nh giai ut ng có th x p theo th t t n non 1.7 ut ã tách dòng xác ng Chap2) gi ng a ph ng prolin thân, u t ng theo th i gian gây h n c s có m t c a gen chaperonin t bào ch t v i kích c phân t kho ng 1,6 kb t gi ng gi ng i v i h n, c c a Gi ng DL có ch s ch u n th p nh sau: DL > AZP > CNg > ST > NH9 Hàm l cao th u t t l s ng kh n ng gi n nh ut ng nghiên c u c trình t gen chaperonin t bào ch t t ng Duy Linh – Lâm ng g m gen (DL- Chap1, DL- i ch ng NH9 Trình t g m 1602 nucleotit mã hóa cho 533 axit amin 57 ng có ch t l ng h t t t có kh n ng ch u h n, có th s d ng làm v t li u cho ch n t o gi ng m i ng quan ngh ch c 17 lo i axit amin h t c a gi ng ng protein tan ho t r ng n tính ch u h n nh : dehydrin, ng ng nghiên c u, ó có lo i axit amin không thay th 1.4 Hàm l i so v i Bominori- trí Ser99→ Thr, Ser 280 → Gly theo quy lu t bi n nghiên c u v nhóm gen khác có liên quan ng protein h t c a gi ng n 38,35%, hàm l a d ng ng h t Gi ng có kh i l ng (65,26g ± 0,34) ng Duy Linh – Lâm 1.2 Hàm l ng c a vùng Tây Nguyên có s c kh i l i ch ng NH9 (145,34g ± 0,04) th p nh t gi ng h t cao nh t gi ng ph n Cúc Vàng Trong ó có trí axit amin thay 58 12 Nông V n TÀI LI U THAM KH O i, Arahira M, Phan V n Chi, Kim CS, Zhang D, Udaka K, Fukazawa C (1997), PH N TI NG VI T Lê Tr n Bình cs (1997), Công ngh sinh h c th c v t c i ti n gi ng tr ng, Giáo trình cao h c nông nghi p, NXB Nông nghi p Hà N i lúa, Nxb i h c Qu c gia, Hà N i Nguy n H u C ch ng ch u ng (1998), Th c ng proline tính lúa ”, T p chí Công Ngh sinh h c, 1(1), Tr 85 – 95 ình Long, Nguy n Th thu t inh Th Phòng, Lê Th ng quan gi a hàm l Ngô Th Dân, Nguy n Xuân H ng, t n ng su t l c cao ào, Ph m V n To n, Gowda C L L (2000), K ng a hình protein ng i h c Thái Nguyên ng V n Hoàng V n ut n, Nguy n Bá Trinh (1989), Nâng cao ch t ng), NXB Nông nghi p, Hà N i, c, K t qu nghiên c u qu c t v t ng, NXB Nông nghi p, 10 Nguy n Huy Hoàng (1992), Nghiên c u kh n ng ch u h n c a gi ng mi n B c Vi t Nam, Lu n án phó ti n s , Hà N i 11 Nguy n Thu Hi n (2005), Nghiên c u dehydrin liên quan ph n kh n ng ch u n a m t s gi ng i c Thái Nguyên 59 sinh u thu t, tr 54-58 ng Liên, Nguy n Huy Hoàng, inh Duy Kháng, Nông V n gi ng ut ng ch u nóng M103 ”, T p chí khoa h c công ngh , 36(5), – 14 17 Tr n Th Ph ng Liên, Lê Th Thu Hi n, Nguy n ng Tôn, Cao Xuân Hi u, i, Lê Th Mu i, Tr n ình Long (2003), Nghiên c u s a gen chaperonin CCTδ ut ng, p chí Sinh ng Liên (1999), Nghiên c u phân t c a m t s gi ng 19 Tr n Th Ph ut a ng c 25 (3): 77- 82 c tính hoá sinh sinh h c ng có kh n ng ch u nóng, ch u h n ng Liên ( 2006), Bài gi ng – Proteinliên quan 21 Tr n Vi t ut ng a c, tr ng i tri n ut n tính ch ng ch u ng, NXB Nông Nghi p ình Long, Nguy n Th Chinh, Hoàng Minh Tâm, Nguy n V n Th ng, Lê Kh T c i m hóa sinh vf phân l p gen ng vùng núi phía B c Vi t nam”, Lu n v n th c c s ph m, ng Liên, Nông V n H i, Lê Th Mu i (1996), Nghiên c u 20 Tr n ình Long (2000), Cây ng nh p n i 1991- 1995, Hà N i Nam, Lu n án ti n s sinh h c, Vi n công ngh sinh h c, Hà N i Hà N i, 1986 ut u proteaza s phânn h y protein trình n y m m c a h t gi ng 18 Tr n Th Ph Lê Doãn Diên, Tr , K t qu nghiên c u khoa h c 15 Tr n Th Ph Nông V n Lê Song D , Nguy n Th Côn (1979), Giáo trình l c NXB Nông ng nông s n, t p 2, ( u H i, Lê Th Mu i (1998), ” Phân l p gen chaperonin nghi p, Hà N i truy n 16 Tr n Th Ph Vi t Nam, NXB Nông nghi p, Hà N i m t s ch tiêu hóa sinh c a gi ng l c, Lu n v n th c s sinh h c, tr Vi t Nam”, T p chí Sinh ng M103, K y u Vi n công ngh sinh h c 1996, NXB Khoa h c k Th Dung, Nguy n Th Chinh, Tr n Nguy n Th Kim Dung ( 2003), Nghiên c u hi n t i h c s ph m, u nh t 9- 1995, tr 5-6 ng, Nguy n Th Kim Anh, Mu i, Lê Tr n Bình (2003), "M i t ng Khôi (1997), “Các h c, 19, N02, tr 5-10 14 Tr n V n Lài (1995), Thu th p, ánh giá b o qu n ngu n th c li u di Ph m Th Trân Châu, Nguy n Th Hi n ,Phùng Gia T hành hoá sinh h c, NXB Giáo d c, 54 -55 No AB004233 13 Nguy n Lê Tr n Bình , Lê Th Mu i (1998), Phân l p gen ch n dòng ch ng ch u ngo i c nh b t l i Glycine max cct-d gene (cDNA) for group II- chaperonin delta-subunit complete cds Genbank/EBI/DDBJ databases, Acc u ng, Tr n Th Tr Vi t Nam (giai ng cs,K t qu nghiên c u phát n 2001-2005), Vi n khoa h c Nông nghi p Vi t Nam 22 Chu V n M n ( 2001), ng d ng tin h c sinh h c, NXB h c T nhiên, Hà N i, 60 i h c Khoa 23 Chu Hoàng M u, Nông Th Man, Lê Tr n Bình (2000), “ ánh giá m t s tính tr ng kinh t quan tr ng kh n ng ch u h n c a dòng (Glycine max (L.) Merrill) ut PH N TI NG ANH ng t bi n”, T p chí khoa h c công ngh , 1(13), Plant ADN Soil, 39: 205-207 i h c Thái Nguyên, 16-21 24 Chu Hoàng M u (2001), S d ng ph dòng ut ng ng pháp t bi n th c nghi m u xanh thích h p cho mi n núi t o ông B c Vi t Nam, 25 Chu Hoàng M u ( 2005), C s ph ng pháp sinh h c phân t , NXB i 26 Chu Hoàng M u, Nguy n Th Thúy H kh n ng ch u h n c a m t s gi ng (1991), enomic DNA isolation http:// www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/htm/dna.htm specific heat- shock proteins in soybean, Plant Physiol., 114, , pp 429 – 438 ut embryogennesis – abudant protein”, Plant physiol., 106, 805 - 806 ng a ph ng c a T nh S n 37 Nanjo T, Koayashi M, Yoshiba Y, Wada K, Tsukaya H, Kakubari Y, i h c qu c gia, Yamaguchi – Shinozaki K (2000) “ Biological funtions of prolinne in morphogenesis and osmotolerance revealed in antiense transgenic Arabidopsis Hà N i 28 Tr nh Th Nh t, Tr n H ng Uy Tr n ut ng ình Long (1997), n th i gian sinh tr nh h ng ng n ng su t c a h th ng tr ng, Nông nghi p Công nghi p th c ph m, N 426, tr 537- 538 29 Nguy n Th Thu Ngà ( 2007), ánh giá kh n ng ch u h n s a d ng di truy n c a gi ng l c L12, L14, L15, V79, Lu n v n th c s sinh h c, ng h c S ph m, i h c Thái Nguyên inh Th Phòng ( 2001), Nghiên c u kh n ng ch u h n ch n dòng ch u lúa b ng công ngh t bào th c v t, Lu n án Ti n S Sinh h c, Vi n công ngh sinh h c, Hà N i ut báo khoa h c c a tr ng (Glycine max) có tính ch ng ch u khác nhau, Thông ng thaliana” – http:www.sovgegenetics.org/ articles/sgu2000-001.htm 38 Soulage JL, Kim K, Arrese EL, Walters C, Cushman JC (2003), “Conformation of a group late embryogennesis abudant protein from Soybean Evidence of poly ( L – proline) – Type II Structure Plant”, Physiol., 131 (3), 963 –75 39 Szoke A, Miao GH, hong Z, verma DPS (1992), “Subcellular location of delta1-pyrroline-5-carboxylate reductase in root/nodule ADN leaf of soybean”, Plant physoil 99: 1642 – 1649 40 Serrtti C., Schapaugh W T ADN Leffel R C (1994), Amino acid profile 31 Lê Tr ng Quang, Ph m Th Trân Châu (1994), M t s ch tiêu sinh hóa m t s dòng R.L drought – induced Soybean cDNA encoding a D95 famyly late – 27 Nguy n V n Mùi ( 2001), Th c hành hóa sinh h c NXB h n Jart ng (2006), Thành ph n axit amin La T p chí nông nghi p phát tri n nông thôn kì II tháng 10 30 N.J 36 Maitra N ADN Cushman J, C (1994), “Ioslation ADN characterization h c S ph m Tr 34 Gawel 35 Jinn T., Chang P L., Chen Y., Key J L ADN Lin C (1997), Tissue-type Lu n án ti n s sinh h c, Vi n công ngh sinh h c, Hà N i tr ng xen ngô- 33 Bates L.S (1973), Rapid determination of free protein for water-stress studies, i h c, tr 66- 75 32 Nguy n H i Tu t, Ngô Kim Khôi (1996), X lý th ng kê k t qu nghiên c u th c nghi m nông lâm ng nghi p máy tính, NXB Nông Nghi p, Hà N i 61 of high seed protein soybean, Crop Sci., 34, , pp 207- 209 41 Senger F., Nicken S ADN Coulson A R (1977), ADN sequencing ith chain mination inhibitors, Proc Natl Acad Sci A, 74, 1977, pp 5463- 5467 42 Verma DPS, Hu C-AA, Delauney AJ, Miao G-H, Hong Z (1992), Deciphering proline biosynthesis pathway in plants by direct, trans-, ADN co- 62 complementation in bacteria In “Biosynthesis ADN Molecular Regulation of I CAM OAN Amino Acids in Plants (BK Singh, HE Flores, JC Shannon eds), American Society of Plant Physiologists, Warerly Press, Baltimore, MD, pp, 128-138 43 Wakabayashi Y, Jones ME (1983), “Pyrroline-5-carboxylate synthesis from glutamate by rat intestinal mucosa J biol”, Chem.258: 3865-3872 Tôi xin cam oan ây công trình công b c a riêng Các s li u, k t qu nghiên c u lu n v n trung th c ch a t ng có công b b t kì công trình 44 www worldoil.com 45 www.ncbi.nih.gov/index.html Tác gi inh Th Ng c 63 64 CL C IC M Tôi xin bày t lòng bi t n sâu s c ch b o h t lòng giúp N n PGS.TS Chu Hoàng M u ã t n tình trình hoàn thành lu n v n Tôi xin chân thành c m n ThS Ph m Th Thanh Nhàn (Gi ng viên khoa sinh - KTNN tr ng i h c S ph m - i H c Thái Nguyên), CN Nguy n Ích Chi n (Phòng thí nghi m Di truy n h c) ã t o hi n thí nghi m u ki n giúp trình th c tài lu n v n o tr ng i h c S ph m - ih c Thái Nguyên, Ban ch nhi m khoa Sinh – KTNN th y cô giáo, cán b khoa u ki n giúp U ng T NG QUAN TÀI LI U 1.1 CÂY UT 1.1.1 m sinh h c c a c NG 1.1.2 Gía tr kinh t c a 1.1.3 Tình hình s n xu t ut ut ut 1.1.4 Thành ph n hóa sinh h t 1.2 NGHIÊN C U V Tôi xin chân thành c m n Ban lãnh ãt o M Ch ng ng ng th gi i ut Vi t Nam ng C TÍNH CH U H N C A CÂY 1.2.1 Khái ni m v h n tác ng c a h n UT NG n th c v t 1.2.2 C s sinh lý, sinh hóa sinh h c phân t c a tính ch u h n 1.2.2.1 C s sinh lý, sinh hóa c a tính ch u h n trình h c t p hoàn thành lu n v n 1.2.2.2 C s phân t c a tính ch u h n Tôi xin chân thành c m n Ban giám hi u tr S Giáo d c - t o ng THPT Buôn Ma Thu t, k L k, gia ình, b n bè ã t o u ki n giúp , viên khích l su t trình h c t p hoàn thành lu n v n ng 1.2.3 Nghiên c u v tính ch u h n ut ng 1.3 NH N XÉT CHUNG Ch ng NGUYÊN LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 NGUYÊN LI U Tác gi lu n v n 2.1.1 Nguyên li u th c v t 2.1.2 Hóa ch t, thi t bi va inh Th Ng c a i m nghiên c 2.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1 Ph ng pháp hoá sinh 2.2.1.1 Phân tích hóa sinh 2.2.1.2 giai n h t ti m sinh ánh giá kh n ng ch u h n thông qua phân tích m t s ch tiêu hóa sinh giai o n h t n y m m 2.2.2 ánh gía kh n ng ch u h n giai n non b ng ph ng pháp gây h n nhân t o 2.2.3 X lý k t qu tính toán s li u 2.2.4.Ph 65 ng pháp sinh h c phân t 66 2.2.4.1 Ph ng pháp tách chi t ADN t ng s t m m nh hàm l ng ut ng tinh s ch ADN 3.2.2.3 ánh gía kh n ng ch u h n thông qua xác nh hàm l ng prolin giai 2.2.4.2 Ph ng pháp xác 2.2.4.3 Ph ng pháp nhân b n 2.2.4.4.Ph ng pháp tách dòng o n gen chaperonin 3.2.3 M i quan h gi a gi ng 2.2.4.5 Ph ng pháp bi n n p ADN plasmit vào t bào E coli ch ng DH5α tr ng n ADN thu c gen mã hóa cho chaperonin o n non 3.2.2.4 Nh n xét v kh n ng ch u h n 2.2.4.6 Ph ng pháp tách chi t ADN plasmit t vi khu n 3.3 PHÂN L P GEN LIÊN QUAN 2.2.4.7 Ph ng pháp xác T CH 3.1 nh trình t gen b ng thi t b t ng NG K T QU VÀ TH O LU N ÁNH GIÁ CH T L NG H T C A GI NG UT NG NGHIÊN C U 3.1.1 c m hình thái, kích th c kh i l ng h t gi ng ut ng nghiên c u 3.1.2 Hàm l ng protein lipit h t ti m sinh 3.1.3 Thành ph n axit amin protein h t c a 3.1.4 Nh n xét v c ut ng m hình thái, hóa sinh h t c a gi ng ut ng nghiên c u 3.2 ÁNH GIÁ KH N NG CH U H N C A GI NG 3.2.1 Kh n ng ch u h n c a gi ng ut UT ng nghiên c u NG giai nh tn y gai u t proteaza hàm l N KH 3.3.1 Tách chi t ADN t h gen c a gi ng 3.3.2 Nhân gen chaperonin t bào ch t proteaza hàm l ut ng Duy Linh – Lâm 3.3.3.1 Tách dòng 3.2.2 Kh n ng ch u h n c a gi ng ng nghiên c u ng giai giai 3.3.3.2 Ki m tra vect tái t h p mang i tác gi ng ut c ch s ch u h n t ng K T LU N VÀ ng DL NH9 ut n ng NGHI CÔNG TRÌNH CÔNG B CÓ LIÊN QUAN TÀI LI U THAM KH O ng ic a5 ng nghiên c u 67 ut DL NH9 c a h n 3.2.2.2 T l s ng, kh n ng gi n ng b ng k thu t PCR n gen chaperonin b ng enzym gi i n non n non d ng ut 3.3.4 K t qu gi i trình t nucleotit c a gen chaperonin c a hai gi ng n h t n y m m ut ut ut a hai gi ng x lý b i sorbitol 7% 3.2.2.1 T l thi t h i c a gi ng U ng (DL) NH9 n ph m PCR ng protein tan h t n y m m không gai CÂY 3.3.3.Tách dòng s n ph m PCR o n c t b ng ezim gi i h n c a hai gi ng ng protein tan h t n y m m x lý b i 3.2.1.3 Nh n xét v kh n ng ch u h n N NG CH U H N gi ng sorbitol 7% 3.2.1.2 Ho t ng d a s bi u hi n c a tính NG m m 3.2.1.1 Ho t n non 68 DANH M C CÁC CH ABA Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic Tên ng Axit abscisic (Abscisis acid) ADN DANH M C CÁC B NG VI T T T 1.1 S nl ng ut ng ng c a m t s n Trang c th gi i niên v 2006-2007 ASTT Áp su t th m th u 1.2 ATP- aza Enzym phân gi i ATP 1.3 Di n tích, n ng su t, s n l ng ut Bp C p baz 2.1 Ngu n g c c a gi ng ut ng cADN S i ADN b sung 2.2 Thành ph n ph n ng c a PCR c t ng h p t mARN nh enzyme phiên ng c Di n tích, n ng su t, s n l ng ut ng c n c ng c n c 17 24 CCT Chaperonin ch a polypeptit –1 c a ph c t ( chaperonin t bào ch t) dNTP Deoxynucleotid DHA Docosa Hexaenoic Axit 3.2 Hàm l ng protein lipit c a gi ng EDTA Ethylendiamin tetraacetic axit 3.3 Hàm l ng axit amin h t c a gi ng EPA Eicosa Pentaenoic axit 3.4 HSP Heat shock protein - Protein s c nhi t HSG Heat Shock Granules HSPL H s pha loãng Kb Kilo baz = 1000 bp LEA Late embryogenesis abundant MGPT Môi gi i phân t - Molecular chaperone MW Molecular weight - Kh i l P5CS Delta pyrroline - - Carborxylate Synthetase 3.8 Hàm l PCR Polymeraza chain reaction - Ph n ng chu i polimeraza 3.9 H s khác gi a gi ng 3.1 Màu s c, hình d ng, kích th gi ng Ho t ut c kh i l ng h t c a 27 ng nghiên c u a proteaza hàm l ut ng ut 29 ng 31 ng protein tan giai nh t 36 ng protein tan giai nh t 37 n y m m x lý b i sorbitol 3.5 Ho t a proteaza hàm l n y m m không x lý b i sorbitol 3.6 T l thi t h i ut 3.7 ng phân t n non c a gi ng T l s ng, kh n ng gi n ng 3.10 giai i c a gi ng ng prolin Th ng kê th i ut c ch s ch u h n 40 c sau b h n 41 ng m tr ut trí nucleotit thay ng 43 i gen chaperonin DL- Chap1, DL- Chap2 NH9 so v i Bonminori – Nh t 3.11 Trình t axit amin gi ng 69 38 ng nghiên c u ut a gen chaperonin thay ng 70 i 53 n 54 DANH M C CÁC HÌNH Hình Tên Hình 3.1 Hình thái h t c a gi ng 3.2 S c ký axit amin c a b t gi ng ut ng DL 30 3.3 S c ký axit amin c a b t gi ng ut ng ST 30 3.4 S c ký axit amin c a b t gi ng ut ng CNg 32 3.5 S c ký axit amin c a b t gi ng ut ng NH9 32 3.6 S c ký axit amin c a b t gi ng ut ng AZP 3.7 T l thi t h i c a gi ng 3.8 Hàm l 3.9 3.10 3.11 3.13 ng nghiên c u ut ng prolin c a gi ng 28 33 ng nghiên c u 5, 7, ngày h n ut ng nghiên c u 39 42 mô t m i quan h c a gi ng ut ng 44 n di ADN t ng s t gi ng ut n 45 c nhân lên b ng k 46 nh Hình nh n di thu t PCR 3.12 ut Trang i n di n gen chaperonin gi ng ut ng n ph m c t plasmit tái t h p b ng enzim gi i Trình t gien chaperonin t bào ch t gi ng NH9, gi ng M103 gi ng ut ut ng ch u u t ng DL, n Cúc Vàng, gi ng ng ch u nh Nh t 71 a gi ng n n – Bonminori t bi n 47 48 [...]... n xu t ut ut ut 1.1.4 Thành ph n hóa sinh h t 1.2 NGHIÊN C U V Tôi xin chân thành c m n Ban lãnh ãt o M Ch ng ng ng trên th gi i và ut Vi t Nam ng C TÍNH CH U H N C A CÂY 1.2.1 Khái ni m v h n và tác ng c a h n UT NG n th c v t 1.2.2 C s sinh lý, sinh hóa và sinh h c phân t c a tính ch u h n 1.2.2.1 C s sinh lý, sinh hóa c a tính ch u h n tôi trong quá... 54-58 ng Liên, Nguy n Huy Hoàng, inh Duy Kháng, Nông V n gi ng ut ng ch u nóng M103 ”, T p chí khoa h c công ngh , 36(5), 8 – 14 17 Tr n Th Ph ng Liên, Lê Th Thu Hi n, Nguy n ng Tôn, Cao Xuân Hi u, i, Lê Th Mu i, Tr n ình Long (2003), Nghiên c u s a gen chaperonin CCTδ cây ut ng, p chí Sinh ng Liên (1999), Nghiên c u phân t c a m t s gi ng 19 Tr n Th Ph ut a ng c 25 (3): 77- 82 c tính hoá sinh và sinh. .. 2.1 NGUYÊN LI U Tác gi lu n v n 2.1.1 Nguyên li u th c v t 2.1.2 Hóa ch t, thi t bi va inh Th Ng c a i m nghiên c 2.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1 Ph ng pháp hoá sinh 2.2.1.1 Phân tích hóa sinh 2.2.1.2 giai n h t ti m sinh ánh giá kh n ng ch u h n thông qua phân tích m t s ch tiêu hóa sinh giai o n h t n y m m 2.2.2 ánh gía kh... ut ut a gi ng Cúc Vàng có 12 trí axit nh Bonminori Còn gen chaperonin i, trong ó có 7 ng ã trí thay i hoàn toàn c ánh giá là có kh n ng ch u n trí Ser99→ Thr, Ser 280 → Gly tuân theo quy lu t t ng kh n ng ch u nhi t Trong c u trúc phân t c a gen chaperonin có 3 vùng ch c n ng - Vùng ho t tính ATPaza là vùng b o th ít thay - Vùng g n v i ATP, ây là vùng t (Gly96 n Vall102 ut 117 Leu (L) Leu (L) Leu (L)... h c ng có kh n ng ch u nóng, ch u h n ng Liên ( 2006), Bài gi ng – Proteinliên quan 21 Tr n Vi t ut ng a c, tr ng i tri n ut n tính ch ng ch u ng, NXB Nông Nghi p ình Long, Nguy n Th Chinh, Hoàng Minh Tâm, Nguy n V n Th ng, Lê Kh T c i m hóa sinh vf phân l p gen ng vùng núi phía B c Vi t nam”, Lu n v n th c c s ph m, ng Liên, Nông V n H i, Lê Th Mu i (1996), Nghiên c u 20 Tr n ình Long (2000), Cây ng... 2 DL- Chap2 i trí nucleotit gen a gi ng ng 3.10 i trong gen chaperonin DL- Chap 1, n i) Trình t gien chaperonin ng 99,56% (v i 7 ut ng ch u nóng M103 a DL- Chap1 có t l t trí nucleotit và 6 axit amin thay amin thay trí axit amin thay ng i) Còn so v i gi ng ng t , gen chaperonin ng i) Gen chaperonin DL- trí nucleotit và 10 a gi ng NH9 có t l t ng là ng ng là 97,81% i) Gen chaperonin c a DL- Chap2 có... nhân gen chaperonin c a 5 gi ng ut c h xu ng 550C ây là nhi t ADN c a h gen Sau 32 chu k ph n ng, s n ph m PCR ng Trong chu trình t i u g n m i vào c ki m tra b ng n di trên gel agaroza 1% (hình 3.11) K t qu nhân gen cho th y, c 5 gi ng PCR v i kích th c phân t là 1,6 kb Kích th ut ng c phân t c a cADN gen chaperonin gi ng Nh t B n u này ch ng t u t chaperonin và không có intro trong c u trúc gen L... Bonminori - ng nghiên c u th c hi n các nghiên c u ti p theo 45 c s n ph m c s n ph m PCR nh n b ng kích th c 5 gi ng u thu u t n gen ng Duy Linh – Lâm ng (DL) và NH9 ng b ng k thu t PCR nhân gen chaperonin v i n c a hai gi ng u có gen c nhân lên qua n ph m PCR a hai gi ng ut ng DL và NH9 t o c s cho vi c xác nh trình t gen chaperonin trên sau khi ã nhân cm ts l tôi ti n hành tách dòng phân t 1.2 Tách... có th là nguyên nhân t o ra tính ch u h n c a gi ng DL Tuy nhiên kh ng 55 v trí axit amin t v trí này DL- Chap2 thay b ng Thr - Vùng g n c ch t ph c CCT t i ví trí v trí axit amin (Glu 209 i i b o th n m ng) Trong vùng này gen chaperonin gi ng Bonminori - Nh t B n có axit amin 99 là Ser, c ng 7 ng nh u này c n ph i nghiên c u sâu h n v protein trên 56 c u trúc và s bi u hi n c a T LU N VÀ Gen chaperonin. .. DH5α tr ng n ADN thu c gen mã hóa cho chaperonin o n cây non 3.2.2.4 Nh n xét v kh n ng ch u h n 2.2.4.6 Ph ng pháp tách chi t ADN plasmit t vi khu n 3.3 PHÂN L P GEN LIÊN QUAN 2.2.4.7 Ph ng pháp xác T CH 3.1 nh trình t gen b ng thi t b t ng NG 3 K T QU VÀ TH O LU N ÁNH GIÁ CH T L NG H T C A 5 GI NG UT NG NGHIÊN C U 3.1.1 c m hình