PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA NHÓM VI KHUẨN SINH ACID LACTIC ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA NHĨM VI KHUẨN SINH ACID LACTIC ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THU HÀ Niên khóa: 2010 – 2014 Tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA NHĨM VI KHUẨN SINH ACID LACTIC ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH NGUYỄN THỊ THU HÀ Tháng 12/2013 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khố luận này, lời xin gửi lời cám ơn đến cha mẹ có cơng ni dưỡng, dạy dỗ tơi thành người tạo điều kiện cho bước chân vào ngưỡng cửa Đại học Cám ơn anh chị em gia đình ln động viên, giúp đỡ tơi lúc khó khăn Cám ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh tạo mơi trường học tập cho suốt năm ngồi giảng đường Xin chân thành cám ơn Cô Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh - Trưởng Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II hướng dẫn tơi thực khố luận, đồng thời giúp tơi chỉnh sửa hồn thành báo cáo khố luận Cám ơn thầy Lê Đình Đơn - Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Tơn Bảo Linh – giáo viên chủ nhiệm quan tâm đóng góp ý kiến để khố luận tơi hồn chỉnh Cám ơn thầy Bộ mơn giảng viên giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tơi để tơi áp dụng kiến thức q trình thực khố luận Cám ơn anh Kiên, anh Chắc, chị Thúy giúp thời gian tơi thực khố luận Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II Cám ơn bạn Nguyên, Hương, Trâm, Thảo, Hiếu, Thái tập thể DH10SH tơi vượt qua khó khăn suốt năm Đại học chia sẻ niềm vui, nỗi buồn i TÓM TẮT Sự phát triển nhanh chóng ngành ni trồng thủy sản với xuất vấn đề sức khỏe trang trại ni thuỷ sản khuyến khích nhà nghiên cứu phát triển phương pháp kiểm soát vi sinh vật môi trường Một phương pháp cơng nhận để kiểm sốt mầm bệnh ngành nuôi trồng thủy sản sử dụng chế phẩm sinh học Vi khuẩn sinh acid lactic trở thành mục tiêu để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng ni trồng thủy sản chúng nghiên cứu rộng rãi coi sinh vật GRAS Đề tài “Phân lập khảo sát đặc tính nhóm vi khuẩn sinh acid lactic ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học dùng nuôi trồng thủy sản” tiến hành phân lập chủng vi khuẩn sinh acid lactic có tính cạnh tranh ức chế tăng trưởng vi khuẩn gây bệnh cách sản xuất hợp chất đối kháng ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học Trong đề tài này, vi khuẩn sinh acid lactic phân lập từ hệ tiêu hoá cá tra, tôm sú tôm thẻ chân trắng thu từ tỉnh Đồng Tháp Cà Mau Sau đó, hoạt tính đối kháng xác định phương pháp thạch khuếch tán, phương pháp vạch thẳng vng góc phương pháp nhỏ giọt Kết nghiên cứu phân lập 34 chủng vi khuẩn sinh acid lactic Trong đó, 28 chủng có hoạt tính đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh khảo sát phương pháp khuếch tán thạch, khơng có chủng có hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh khảo sát phương pháp vạch thẳng vng góc 19 chủng vi khuẩn tiết hợp chất đối kháng ức chế với chủng vi khuẩn gây bệnh khảo sát phương pháp nhỏ giọt Từ khóa: ni trồng thủy sản, chế phẩm sinh học, vi khuẩn sinh acid lactic, hợp chất đối kháng ii SUMMARY The rapid development of aquaculture and the occurrence of health problems on farms encourage researchers to develop alternative methods for controlling the microbial environment One of the methods gaining recognition for controlling pathogens within the aquaculture industry is the use of probiotic Lactic acid bacteria (LAB) have been proposed as good probiotic candidates to be used in aquaculture because they have been extensively studied and are considered as GRAS (generally recognized as safe) microorganisms The study “Isolation and investigation of antagonism activity of lactic acid bacteria with potential use as probiotic in aquaculture” was conducted to isolate the lactic acid bacteria for use as probiotics based on their competitive exclusion and inhibition of pathogenic bacteria growth by production of antagonistic compounds In this study, lactic acid bacteria were isolated from the gastrointestinal tract of Pangasianodon hypophthalmus, Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei, which were sampled from Dong Thap and Ca Mau provinces Then, the antibacterial activity was determined by agar diffusion, cross-streak and agar spot testing method As a result, we isolated 34 strains of lactic acid bacteria Among them, 28 strains showed antibacterial activity against at least one pathogenic bacterium by agar diffusion method; no strain showed antibacterial activity against all pathogenic bacteria by cross-streak method and 19 strains produced of antagonistic compounds against at least one pathogenic bacterium by agar spot testing method Keywords: aquaculture, probiotic, latic acid bacteria, antagonistic compounds iii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Chế phẩm sinh học (Probiotic) 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Các nhóm vi sinh vật sử dụng làm chế phẩm probiotic 2.1.3 Cơ chế tác động probiotic 2.1.4 Tác dụng chế phẩm probiotic nuôi trồng thủy sản 2.1.5 Một số chế phẩm probiotic sử dụng cho động vật thủy sản 2.2 Vi khuẩn sinh acid lactic 2.2.1 Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic 2.2.2 Sự phân bố nhóm vi khuẩn sinh acid lactic 2.2.3 Ứng dụng nhóm vi khuẩn sinh acid lactic 10 2.2.4 Các chi điển hình nhóm vi khuẩn sinh acid lactic 10 2.2.5 Một số nghiên cứu chứng minh vi khuẩn LAB kháng lồi vi khuẩn gây bệnh ni trồng thủy sản 12 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 13 3.2 Vật liệu 13 3.2.1 Nguồn gốc mẫu khảo sát 13 iv 3.2.2 Hóa chất 15 3.2.3 Dụng cụ thiết bị 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Phương pháp xử lí mẫu lưu giữ hỗn hợp vi sinh vật 16 3.3.2 Phương pháp phân lập nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (vi khuẩn LAB) 16 3.3.3 Phương pháp thử catalase 17 3.3.4 Phương pháp nhuộm Gram 17 3.3.5 Phương pháp khảo sát hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh 18 3.3.5.1 Phương pháp khuếch tán thạch (agar diffusion) 18 3.3.5.2 Phương pháp vạch thẳng vng góc (cross-streak) 19 3.3.5.3 Phương pháp nhỏ giọt (agar spot testing) 20 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Kết 21 4.1.1 Kết phân lập 21 4.1.2 Kết thử catalase nhuộm Gram 23 4.1.3 Kết khảo sát hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh 25 4.1.3.1 Hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa tơm 25 4.1.3.2 Hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra 28 4.2 Thảo luận 31 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 34 Tài liệu tham khảo 35 Phụ lục v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐKVVK: đường kính vòng vơ khuẩn GRAS: Generally recognized as safe LAB: Lactic Acid Bacteria MRSA: de Man, Rogosa, Sharpe Agar MRSB: de Man, Rogosa, Sharpe Broth NA: Nutrien Agar NB: Nutrien Broth vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Nguồn gốc mẫu tôm dùng nghiên cứu 14 Bảng 3.2 Nguồn gốc mẫu cá tra dùng nghiên cứu 15 Bảng 4.1 Hình thái khuẩn lạc phân lập từ hệ tiêu hóa tơm thu Cà Mau 22 Bảng 4.2 Hình thái khuẩn lạc phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra thu Đồng Tháp 23 Bảng 4.3 Kết catalase nhuộm Gram khuẩn lạc phân lập từ hệ tiêu hóa tơm 24 Bảng 4.4 Kết catalase nhuộm Gram khuẩn lạc phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra 25 Bảng 4.5 Kết khảo sát tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa tôm phương pháp khuếch tán thạch 27 Bảng 4.6 Kết khảo sát tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa tơm phương pháp nhỏ giọt 28 Bảng 4.7 Giá trị pH dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa tơm 28 Bảng 4.8 Kết khảo sát tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra phương pháp khuếch tán thạch 30 Bảng 4.9 Kết khảo sát tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra phương pháp nhỏ giọt 31 Bảng 4.10 Giá trị pH dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra .31 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát trình lên men đường glucose LAB Hình 3.1 Mẫu tôm sú thương phẩm 16 Hình 3.2 Mẫu cá tra thương phẩm cá tra giống 16 Hình 3.3 Phương pháp khuếch tán thạnh 20 Hình 3.4 Phương pháp vạch thẳng vng góc 21 Hình 4.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn môi trường MRS Agar 23 Hình 4.2 Vi khuẩn Gram dương quan sát kính hiển vi 25 viii phát triển chúng Các chủng vi khuẩn khảo sát mọc bình thường môi trường NA môi trường không tối ưu để chúng tiết hợp chất ức chế mơi trường Vị trí tiếp xúc ngun nhân khiến chúng khơng thể tính đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh Bảng 4.8 Kết khảo sát tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra phương pháp khuếch tán thạch Ký hiệu khuẩn lạc ĐT.LA1 ĐT.LA2 ĐT.LA4 ĐT.LA9 ĐT.LA10 ĐT.LA11 ĐT.LA12 ĐT.LA13 ĐT.LA15 ĐT.LA16 ĐT.LA17 ĐT.LA18 ĐT.LA20 V harveyi Khoảng Mức cách độ đối kháng kháng khuẩn (D,mm) + 1,830,29  + 1,170,29 + 1,000 ++ 2,670,29 + 0,830,76 ++ 2,170,29 1,33+0,29 + ++ 2,500 + 1,670,29 + 1,001,73 + 0,671,15 + 1,001,73 V parahaemolyticus Khoảng Mức độ cách đối kháng kháng khuẩn (D,mm) + 1,330,58 + 1,170,29 + 0,670,58 + 0,670,58 + 1,330,29  + 0,330,58 + 0,500,87 + 1,830,29 + 1,000    V alginolyticus Khoảng Mức cách độ đối kháng kháng khuẩn (D, mm) ++ 3,672,08 ++ 3,673,79 ++ 2,331,04 + 0,671,15 ++ 2,001,32 + 1,001,73 + 1,172,02 + 1,001,73 ++ 2,170,76 + 1,330,58 + 0,831,44 + 0,671,15 + 1,172,02 A hydrophila Khoảng Mức cách độ đối kháng kháng khuẩn (D,mm) + 1,000 + 1,000 + 1,000 + 1,170,29 + 1,830,29  + 1,330,29 + 1,170,29 ++ 2,170,29 + 0,670,58    Edw ictaluri Khoảng Mức cách độ đối kháng kháng khuẩn (D,mm)              Số liệu trình bày dạng giá trị trung bình  độ lệch chuẩn lần lặp lại : không đối kháng; +: đối kháng yếu; ++: đối kháng trung bình b) Kết khảo sát hoạt tính đối kháng phương pháp nhỏ giọt Theo bảng 4.9, tổng số 13 chủng vi khuẩn có tính đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh, có chủng vi khuẩn tiết hợp chất đối kháng với V harveyi; chủng vi khuẩn tiết hợp chất đối kháng với V parahaemolyticus; chủng vi khuẩn tiết hợp chất đối kháng với V alginolyticus chủng vi khuẩn tiết hợp chất đối kháng với A hydrophila Các chủng lại cho kết chúng khơng tiết hợp chất đối kháng ngồi mơi trường mà chúng đối kháng trực tiếp (theo kết khảo sát phương pháp khuếch tán thạch) Chỉ có chủng ĐT.LA4 tiết hợp chất đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh chủng tiết hợp chất đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh 29 Bảng 4.9 Kết khảo sát tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra phương pháp nhỏ giọt Ký hiệu khuẩn lạc ĐT.LA1 ĐT.LA2 ĐT.LA4 ĐT.LA9 ĐT.LA10 ĐT.LA11 ĐT.LA12 ĐT.LA13 ĐT.LA15 ĐT.LA16 ĐT.LA17 ĐT.LA18 ĐT.LA20 Đường kính vòng vơ khuẩn (D, mm) tạo dịch sau ly tâm V harveyi V parahaemolyticus V alginolyticus A hydrophila 0 0 6,000 7,000 4,170,76  8,170,76 5,000,87 5,330,58 6,830,29 0 8,170,29 8,671,15 6,830,29 6,330,29 6,000 0   5,670,76 6,000 4,170,29 6,001,00 7,170,29 4,170,76 6,330,58 5,000 5,170,76 8,671,15 5,170,29 4,171,04 7,331,53 4,001,73   7,000,50 4,330,58   0   Số liệu trình bày dạng giá trị trung bình  độ lệch chuẩn lần lặp lại : chủng khơng có đối kháng khảo sát phương pháp khuếch tán thạch nên không tiến hành khảo sát Bảng 4.10 Giá trị pH dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra pH 5,91 5,97 4,43 4,60 5,83 4,68 5,27 4,38 4,50 4,49 4,68 4,63 4,61 4,91 Ký hiệu khuẩn lạc Đối chứng ĐT.LA1 ĐT.LA2 ĐT.LA4 ĐT.LA9 ĐT.LA10 ĐT.LA11 ĐT.LA12 ĐT.LA13 ĐT.LA15 ĐT.LA16 ĐT.LA17 ĐT.LA18 ĐT.LA20 Giá trị pH dịch nuôi cấy chủng khảo sát thấp đối chứng chứng tỏ hầu hết chủng khảo sát tiết acid hữu ngồi mơi trường, lý khiến chủng vi khuẩn gây bệnh bị ức chế Giá trị pH dịch nuôi cấy chủng ĐT.LA1 (pH = 5,97) chủng ĐT.LA11 (pH = 5,27) không khác biệt nhiều so với đối chứng (pH = 5,91) cho thấy chủng vi 30 khuẩn không tiết acid hữu môi trường Dịch sau ly tâm chủng không tạo vòng vơ khuẩn chủng vi khuẩn gây bệnh nên nói chủng khơng tiết hợp chất ức chế ngồi mơi trường mà đối kháng trực tiếp Giá trị pH dịch nuôi cấy chủng ĐT.LA9 (pH = 5,83) không khác biệt nhiều so với giá trị pH đối chứng (pH = 5,91) nên chủng khơng tiết acid hữu ngồi mơi trường Tuy nhiên, dịch sau ly tâm chủng vi khuẩn lại đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn gây bệnh (V harveyi V parahaemolyticus), nên có khả chủng tiết hợp chất ức chế khác bacteriocin, H2O2, … ngồi mơi trường 4.2 Thảo luận Kết nghiên cứu phân lập khảo sát hoạt tính chủng vi khuẩn LAB phân lập từ hệ tiêu hố tơm cá tra cho thấy 28/34 chủng khảo sát có tính đối kháng với số chủng vi khuẩn gây bệnh Điều phù hợp với nghiên cứu trước đây, nghiên cứu Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai (2011) nghiên cứu Galindo ctv (2004) cho thấy vi khuẩn LAB đối kháng với A hydrophila Edw ictaluri; nghiên cứu Gatesoupe (1994) báo cáo Schroder (1980) cho thấy chủng vi khuẩn LAB có tác dụng ức chế Vibrio sp.; nghiên cứu Lewus ctv (1991) chứng minh chủng vi khuẩn LAB có tính kháng với A hydrophila Nghiên cứu Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai (2011) tiến hành phân lập chủng vi khuẩn LAB từ dày ruột mẫu cá tra cá rô phi Mẫu thu chợ ao nuôi cá theo mơ hình quảng canh, bán thâm canh thâm canh tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh, Bến Tre Hậu Giang Môi trường phân lập Lactobacillus Anaerobic MRS bổ sung Vancomycin Bromocresol green (LAMVAB) Kết phân lập 45 chủng vi khuẩn Lactobacillus spp Tất chúng ức chế Aeromonas hydrophila 43 chủng có khả ức chế Edwardsiella ictaluri kiểm tra phương pháp thạch lớp kép Chỉ chủng sinh bacteriocin ức chế hai loài vi khuẩn gây bệnh khảo sát phương pháp khuếch tán thạch Khả ức chế Ewd ictaluri khảo sát phương pháp thạch lớp kép: chủng Lb12 tạo đường kính vòng vơ khuẩn (ĐKVVK) lớn (18,7 mm), hai chủng Lb19 Lb26 tạo ĐKVVK nhỏ (0,3 mm) 45 chủng Lactobacillus spp 31 kiểm tra Xét khả ức chế theo quy ước Galindo (2004) chủng (Lb19 Lb26) khơng có khả ức chế Ewd ictaluri (ĐKVVK < mm), chủng (Lb02, Lb04, Lb06, Lb07, Lb13, Lb15, Lb29 Lb39) ức chế yếu (1 mm ≤ ĐKVVK ≤ mm) 35 chủng ức chế với mức độ trung bình (6 mm ≤ ĐKVVK ≤ 20 mm), khơng có chủng Lactobacillus sp phân lập ức chế mạnh Ewd ictaluri Khả ức chế A hydrophila khảo sát phương pháp thạch lớp kép: chủng Lb11 tạo ĐKVVK lớn (22,7 mm), chủng Lb26 tạo ĐKVVK nhỏ (0,7 mm) 45 chủng Lactobacillus spp phân lập Mặc dù ĐKVVK chủng Lb11 tạo khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với ĐKVVK tạo chủng Lb09 (21,3 mm), Lb10 (20,3 mm), Lb35 (20,0 mm), Lb44 (20,3 mm) so với chủng lại giá trị có khác biệt ý nghĩa Xét khả ức chế theo quy ước Galindo (2004) 45 chủng Lactobacillus spp phân lập ức chế A hydrophila.Trong đó, chủng (Lb11 Lb09) ức chế mạnh A hydrophila (ĐKVVK ≥ 21 mm), chủng (Lb02, Lb04, Lb07, Lb19, Lb26 Lb39) ức chế yếu A hydrophila (1 mm ≤ ĐKVVK ≤5 mm) lại 37 chủng ức chế A hydrophila với mức độ trung bình (6 mm ≤ ĐKVVK ≤ 20 mm) Kết cho thấy chủng vi khuẩn LAB nghiên cứu Nguyễn Ngọc Trai Nguyễn Văn Thành, có khả ức chế A hydrophila mạnh so với chủng vi khuẩn LAB phân lập nghiên cứu (khoảng cách kháng khuẩn nghiên cứu chúng tôi: 0,67 – 2,50 mm) Trong số 45 chủng Lactobacillus spp phân lập chủng Lb12 sinh bacteriocin bacteriocin ức chế Ewd ictaluri A hydrophila khảo sát phương pháp khuếch tán thạch ĐKVVK tạo A hydrophila 8,3mm ĐKVVK bacteriocin tạo Ewd ictaluri 4,7mm Nghiên cứu Galindo ctv (2004) tiến hành phân lập chủng vi khuẩn LAB từ hệ tiêu hoá cá da trơn Châu Phi, cá chình Châu Âu, cá tráp, cá rơ (sơng Maas) Mơi trường nuôi cấy sử dụng môi trường MRS biến đổi có bổ sung glucose với nồng độ 2,0; 0,2 % Kết sàng lọc 55 chủng vi khuẩn tổng số 156 chủng vi khuẩn phân lập Khi tiến hành khảo sát phương pháp thạch lớp kép, 52/55 chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng với Aromonas hydrophila chúng ni cấy môi trường MRS bổ sung 2,0 % glucose Trong đó, có chủng đối kháng trung bình (6 ≤ ĐKVVK ≤ 20 mm), 50 chủng có tính đối kháng mạnh (21 ≤ ĐKVVK ≤ 60 mm) Trên 32 mơi trường MRS bổ sung 0,2 % glucose, có chủng vi khuẩn có tính đối kháng với A hydrophila, đó, chủng có tính đối kháng yếu (1 ≤ ĐKVVK ≤ mm), chủng có tính đối kháng trung bình Khơng có chủng vi khuẩn thể hoạt tính đối kháng mơi trường MRS khơng bổ sung glucose Các chủng vi khuẩn LAB nghiên cứu Galindo có khả ức chế A hydrophila mạnh so với chủng vi khuẩn LAB phân lập đề tài chúng tơi Chỉ có chủng Lactobacillus plantarum 44a ức chế tác nhân gây bệnh nuôi cấy môi trường MRS bổ sung glucose với nồng độ ≥ 0,4 %, nên chủng vi khuẩn tiến hành khảo sát khả ức chế với A hydrophila phương pháp khuếch tán thạch, pH điều chỉnh mức 3,7; 4,5; Kết cho thấy, pH 3,7 ĐKVVK L plantarum 44a tạo 12,4  1,30; pH 4,5 ĐKVVK 7,30  0,90; hai giá trị pH lại chủng vi khuẩn khơng tạo vòng vơ khuẩn ức chế A.hydrophila Nghiên cứu Gatesoupe (2004) tiến hành phân lập chủng vi khuẩn LAB từ luân trùng, Brachionus plicatilis Kết cho thấy, mẫu luân trùng có chứa mật độ vi khuẩn LAB cao có khả làm tăng tỉ lệ sống sót ấu trùng cá bơn cá bị gây nhiễm Vibrio sp Nghiên cứu đề tài có tính thực khảo sát hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn LAB với chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến nuôi trồng thuỷ sản Cơ chế đối kháng hầu hết chủng khảo sát tiết acid hữu ngồi mơi trường Có chủng (ĐT.LA9) có khả tiết bacteriocin vào môi trường 16 chủng vi khuẩn khảo sát có tính đối kháng với – chủng vi khuẩn gây bệnh, có tiềm lớn để sản xuất chế phẩm sinh học dùng cho nuôi trồng thuỷ sản Tuy nhiên, hoạt tính chủng vi khuẩn lại không ổn định (thể qua khác biệt kết khảo sát lần lặp lại), kết nghiên cứu cần lặp lại trước ứng dụng quy mô sản xuất 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Từ mẫu hệ tiêu hố tơm (thu Cà Mau) hệ tiêu hoá cá tra (thu Đồng Tháp), sau cấy trải môi trường MRS Agar, phân lập tổng cộng 34 chủng vi khuẩn Trong đó, có 28 chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh khảo sát phương pháp khuếch tán thạch, khơng có chủng có tính đối kháng khảo sát phương pháp vạch thẳng vng góc; 19 chủng vi khuẩn tiết hợp chất đối kháng ngồi mơi trường thể qua kết khảo sát phương pháp nhỏ giọt Các chủng vi khuẩn khảo sát tính đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh ni trồng thủy sản Có 16 chủng đối kháng với – chủng vi khuẩn gây bệnh, chủng tiết hợp chất đối kháng với – chủng vi khuẩn gây bệnh Thông qua kết khảo sát pH dịch khuẩn sau nuôi cấy, hợp chất đối kháng đa số trường hợp có khả acid hữu Có trường hợp chủng ĐT.LA9 có khả tiết hợp chất khác (bacteriocin, H2O2 hay kháng sinh tự nhiên) Qua kết nhuộm Gram khảo sát catalase, chủng vi khuẩn phân lập nghiên cứu thuộc nhóm vi khuẩn sinh acid lactic có tiềm ứng dụng làm chế phẩm sinh học dùng nuôi trồng thủy sản 4.2 Đề nghị Kết khảo sát hoạt tính đối kháng cho thấy chủng vi khuẩn khảo sát có tính ổn định khơng cao thể qua giá trị độ lệch chuẩn đường kính kháng khuẩn lớn Vì thế, cần lặp lại thí nghiệm khảo sát để chọn chủng vi khuẩn có tính đối kháng mạnh ổn định Cần khảo sát để xác định chất hợp chất đối kháng tiết môi trường Các chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng mạnh nên thử nghiệm thực tế quy mô lớn để theo dõi hiệu động vật thuỷ sản trước sử dụng làm chế phẩm sinh học 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt FICen 2007 Ghi nhận từ mơ hình ni tơm thâm canh chế phẩm sinh học EM.ZEO Trung tâm tin học (FICen), Bộ Thủy Sản Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trương Thị Hồng Vân, Võ Minh Sơn 2003 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic BIO II kết thử nghiệm ao nuôi tôm Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 75-79 Nguyễn La Anh, Đinh Mỹ Hằng, Vũ Quỳnh Hương, Nguyễn Hương Giang, Nguyễn Thị Lộc 2003 Đặc điểm chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có ứng dụng cơng nghệ sản xuất nước CVAS Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 159-161 Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Ngọc Trai 2012 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ đốm đỏ cá tra, Trường Đại học Cần Thơ, pp 224 – 234 Trung tâm phát triển công nghệ Việt – Nhật 2004 Giới thiệu công nghệ vi sinh vật hữu hiệu EM Võ Thị Thứ, Lã Thị Nga, Trương Ba Hùng, Nguyễn Minh Dương, Nguyễn Liễu Ba 2003 Nghiên cứu tạo chế phẩm BIOCHIE đánh giá tác dụng chế phẩm đến môi trường nước nuôi tôm cá Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 119-122 Vũ Thị Thứ ctv 2004 Lên men chế phẩm sinh học BioF ứng dụng nuôi trồng thủy sản Tuyển tập Hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản Tài liệu tiếng nước Balcázar, J.L., de Blas, I., Zarzuela-Ruiz, I., Cunningham, D., Vendrell, D., Múzquiz, J.L 2006 The role of probiotics in aquaculture (Review) Vet Microbiol 114, 173–186 Brunt, J., Austin, B., 2005 Use of a probiotic to control lactococcosis and streptococcosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) J Fish Dis 12, 693–701 10 Dalmin, G., Kathiresan, K., Purushothaman, A., 2001 Effect of probiotics on bacterial population and health status of shrimp in culture pond ecosystem Indian J Exp Biol 39, 939–942 11 Finegold, S.M., Sutter, V.L., Mathisen, G.E 1983 Normal indigenous intestinal flora In: Hentgens, D.J (Ed.) , Human Intestinal Microflora in Health and Disease Academic Press, New York, pp 3–31 12 Fuller.R 1992 History and development of probiotic.In: Fuller R (Ed.), Probiotics: The Scientific Basis Chapman and Hall, London, pp 1-8 13 Gatesoupe, F.J 1994 Lactic acid bacteria increase the resistance of turbot larvae, Scophthalmus maximus, against pathogenic vibrio Aquatic Living Resour 7: 277–282 14 Gatesoupe, F.J 2008 Updating the importance of lactic acid bacteria infish farming: natural occurrence and probiotic treatments.J.Mol Microbiol.Biotechnol 14 (1–3), 107–114 35 15 Gibbs, P.A 1987 Novel uses for lactic acid fermentation in food preservation J Appl Bacteriol Symp Supp., 51S–58S 16 Holzapfel, W.H., Geisen, R., Schillinger, U 1995 Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food grade enzymes Int J Food Microbiol 24, 343–362 17 Hurst, A 1981 Nisin Adv Appl Microbiol 27, 85–119 18 Huys, G., Bartie, K., Cnockaert, M., Oanh, D., Thanh, P.N., Somsiri, T., Chinabut, S., Yusoff, F., Shariff, M.,Giacomini,M., Teale, A., Swings,J., 2007 Biodiversity of chloramphenicol-resistant mesophilic heterotrophs from Southeast Asian aquaculture environments Res Microbiol 158, 228–235 19 Klaenhammer 1988 Bacteriocins of lactic acid bacteria Biochimie 70: 337349 20 Lewus, C B., A Kaiser, and T J Montville 1991 Inhibition of Food – borne bacterial pathogens by bacteriocin from lactic acid bacteria isolated from meat Applied and Environmental Microbiology, 57: 1683 – 1688 21 Lilly D.M and R.H Stillwell 1965 Probiotics: Growth-promoting factors produced by microorganisms, Science147, pp 747-748 22 Mauguin, S., Novel, G 1994 Characterization of lactic acid bacteria isolated from seafood J Appl Bacteriol 76, 616–625 23 McKay, L.L., Baldwin, K.A 1990 Applications for biotechnology: present and future improvements in lactic acid bacteria FEMS Microbiol Rev 87, 3–14 24 Nikoskelainen, S., Ouwehand, A., Bylund, G., Salminen, S., Lilius, E.M 2003 Immune enhancement in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by potential probiotic bacteria (Lactobacillus rhamnosus) Fish Shellfish Immunol 15, 443– 452 25 Pilet, M.F., Dousset, X., Barre, R., Novel, G., Desmazeaud, M., Piard, J.C 1995 Evidence for two bacteriocins produced by Carnobacterium piscicola and Carnobacterium divergens isolated from fish and active against Listeria monocytogenes J Food Protect 58, 256–262 26 Prieur, G., Nicolas, J.L., Plusquellec, A., Vigneulle, M., 1990 Interactions between bivalves molluscs and bacteria in the marine environment Oceanogr Mar Biol Annu Rev 28, 227–352 27 Ringo, E., Strom, E., Tabachek, J.-A 1995 Intestinal microflora of salmonids: a review Aquacult Res 26, 773–789 28 Sakai M., T Yoshida, S Astuta, M Kobayashi 1995 Enhancement of resistance to vibriosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) by oral administration of Clostridium butyricum bacteria J Fish Dis 18, 187-190 29 Sakata, T 1990 Microflora in the digestive tract of fish and shell-fish In: Lesel, R (Ed.), Microbiology in Poecilotherms Else-vier, Amsterdam, pp 171– 176 30 Schleifer KH, Kraus J, Dvorak C, Kilpper-Balz R, Collins MD, Fischer W 1985 Transfer of Streptococcus lactis and related streptococci to the genus Lactococcus gen nov Syst Appl Microbiol 6: 183–195 31 Schroder, K., Clausen, E., Sandberg, A.M., Raa, J 1980 Psychrotrophic Lactobacillus plantarum from fish and its ability to produce antibiotic substances In: Connell, J.J (Ed.), Advances in Fish Science and Technology Fishing News Books, Farnham, Surrey, England, pp 480–483 36 32 Shahani, K.M., Vakil, J.R., Kilara, A 1977 Natural antibiotic activity of Lactobacillus acidophilus and bulgaricus Cult Dairy Prod 7, 11–14 33 Sharp, M.E., 1981 The genus Lactobacillus In: Starr, M.P., Stolp, H., Truper, H.G., Balows, A., Schlegel, H.G (Eds.) , The Prokaryotes A Handbook on Habitat, Isolation and Identification of Bacteria, Vol I Springer, Berlin, pp 1653–1679 34 Smith, P., Hiney, M.P., Samuelsen, D.B 1994 Bacterial resistance to antimicrobial agents used infish farming: a critical evaluation of method and meaning Ann Rev J Fish Dis 4, 273–313 35 Stoffels, G., Nissen-Meyer, Gudmundsdottir, A., Sletten, K., Holo, H., Nes, I.F 1992 Purification and characterization of a new bacteriocin isolated from a Carnobacterium sp Appl Environ Microbiol 58, 1417–1422 36 Strom, E 1988 Melkesyrebakterier i fisketarm Isolasjon, karakterisering og egenskaper MSci thesis The Norwegian College of Fishery Science In Norwegian , pp 88 37 Tannock, G.W., Szylit, O., Duval, Y., Raibaud, P 1982 Colonization of tissue surface in the gastrointestinal tract of gnotobiotic animals by Lactobacillus strains Can J Microbiol 28, 1196–1198 38 Tannock, G.W 1988 The normal microflora: new concepts in health promotion Microbiol Sci 5, 4–8 39 Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P., Verstraete W 2000 Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture Microbiology and Molecular Biology Review 64: 655 – 671 40 Vine, N.G., Leukes, W.D., Kaiser, H 2006 Probiotics in marine larviculture FEMS Microbiol Rev 30 (3), 404–427 41 Vo Minh Son, Chin-Chyuan Chang, Mi-Chen Wu, Yuan-Kuang Guu, ChiuHsia Chiu, Winton Cheng 2009 Dietary administration of the probiotic, Lactobacilus plantarum, enhanced the growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouper Epinephelus coioides Fish & Shellfish Immunology 26 691 – 698 37 Phụ lục 1) Thành phần môi trường MRSB Thành phần g/l Dextrose 20,00 Proteose peptone 10,00 Beef extract 10,00 Yeast extract 5,00 Sodium acetate 5,00 Ammonium citrate 2,00 Dipotassium phosphate 2,00 Tween 80 1,00 Magnesium sulphate 0,10 Manganese sulphate 0,05 pH 6,5  0,2 (250C) 2) Thành phần môi trường NB Thành phần g/l Peptic digest of animal tissue 5,00 Sodium chloride 5,00 Beef extract 1,50 Yeast extract 1,50 pH 7,4  0,2 (250C) Phụ lục Bảng Kết khảo sát phương pháp khuếch tán thạch chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hố tơm thu Cà Mau V V.alginolyticus A.hydrophila V harveyi parahaemolyticus Kí hiệu khuẩn lạc Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 3 3 CM.LA6 2,5     1 CM.LA7 1,5 2       CM.LA8 1,5 0       CM.LA9 0       CM.LA10 1,5 3       CM.LA11 2,5 3,5 1,5 0 1,5 1,5 1 CM.LA12 3,5 1,5 0 1,5 1,5 1,5 1,5 CM.LA13 4 0   2,5 CM.LA14 3,5       CM.LA17 3,5 3,5 0 1,5 1,5 2 CM.LA18 2 0   1 0,8 CM.LA19 3 1,5 0   2 2,5 CM.LA20 0 0   2,5 CM.LA21   1,5 0     CM.LA25 0       Số liệu trình bày dạng đường kính vơ khuẩn (D, mm) tạo sinh khối vi khuẩn với lần lặp lại : không khảo sát Bảng Kết khảo sát phương pháp nhỏ giọt chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hố tơm thu Cà Mau V V.alginolyticus A.hydrophila V.harveyi parahaemolyticus Kí hiệu khuẩn lạc Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 3 3 CM.LA6 8.5 8.5 8.5       10,5 CM.LA7 11 0          CM.LA8 0          CM.LA9 10 0          CM.LA10 0          CM.LA11 8 4,5 4,5 0 0 0 CM.LA12 10 10 8,5 6,5 6,5 0 CM.LA13 0 0 0    0 CM.LA14 0          CM.LA17 9 8.5 7,5 6,5 6,5 0 CM.LA18 10 10 9.5    0 CM.LA19 0 6,5    0 CM.LA20 0 6,5    0 CM.LA21    0       CM.LA25 0          Số liệu trình bày dạng đường kính vòng vơ khuẩn (D, mm) tạo dịch sau ly tâm với lần lặp lại : không khảo sát Bảng Kết khảo sát phương pháp khuếch tán thạch chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hoá cá tra thu Đồng Tháp V V.alginolyticus A.hydrophila V.harveyi parahaemolyticus Kí hiệu khuẩn lạc Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 3 3 ĐT.LA1 2 1,5 1 1 ĐT.LA2   1,5 1 1 1 ĐT.LA4 1,5 1 3,5 1,5 1 ĐT.LA9 1 1 0 1,5 1 ĐT.LA10 2,5 2,5 1,5 2 3,5 1,5 1,5 2 ĐT.LA11 1,5 0   0   ĐT.LA12 2,5 2 1 3,5 0 1,5 1,5 ĐT.LA13 1,5 1,5 1,5 1 0 1,5 ĐT.LA15 2,5 2,5 2,5 1,5 1,5 1,5 2,5 ĐT.LA16 1,5 1,5 1 1 1 ĐT.LA17 0   2,5 0   ĐT.LA18 0   0   ĐT.LA20 0   3,5 0   Số liệu trình bày dạng đường kính vơ khuẩn (D, mm) tạo sinh khối vi khuẩn với lần lặp lại : không khảo sát Bảng Kết khảo sát phương pháp nhỏ giọt chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hoá cá tra thu Đồng Tháp V V.alginolyticus A.hydrophila V.harveyi parahaemolyticus Kí hiệu khuẩn lạc Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 3 3 ĐT.LA1 0 0 0 0 0 0 ĐT.LA2    3,5 6 7 ĐT.LA4 7,5 4,5 4,5 5 6,5 ĐT.LA9 8,5 8 8 10 0 0 0 ĐT.LA10 7 6,5 6,5 6,5 6 6 0 ĐT.LA11 0    0    ĐT.LA12 6,5 5,5 6 4,5 0 ĐT.LA13 7 7,5 3,5 0 ĐT.LA15 6 5 4,5 0 ĐT.LA16 8 10 5,5 5 4,5 0 ĐT.LA17    3    ĐT.LA18 6,5 7,5    4    ĐT.LA20 0    0    Số liệu trình bày dạng đường kính vơ khuẩn (D, mm) tạo dịch sau ly tâm với lần lặp lại : không khảo sát Phụ lục c Hình Kết khảo sát tính đối kháng (1) Phương pháp khuếch tán thạch; (2) Phương pháp vạch thẳng vng góc; (3) Phương pháp nhỏ giọt; (a) vòng vơ khuẩn tạo sinh khối vi khuẩn; (b) vòng vơ khuẩn tạo dịch sau ly tâm; (c) Đối chứng ... sinh học sử dụng nuôi trồng thủy sản chúng nghiên cứu rộng rãi coi sinh vật GRAS Đề tài Phân lập khảo sát đặc tính nhóm vi khuẩn sinh acid lactic ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học dùng nuôi trồng. .. xem vi sinh vật GRAS (cơng nhận an tồn) (Holzapfel, 1995) Vì thế, đề tài: Phân lập khảo sát đặc tính nhóm vi khuẩn sinh acid lactic ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học dùng nuôi trồng thủy sản ... thực để tìm chủng vi khuẩn sinh acid lactic có tiềm sản xuất chế phẩm sinh học 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập khảo sát hoạt tính kháng khuẩn nhóm vi khuẩn sinh acid lactic phân lập từ hệ tiêu