Indonesia, Philippine, châu Phi, châu Úc, Braxin..... Nguy n Hình 1.3: Salmonella typhi di đ ng, không sinh nha bƠo... gypseum th ng ch ký sinh và gây b nh da, tóc.
Trang 1B́O ĆO KHÓA LU N T T NGHI P
Tên đ tài:
PHÂN L P VÀ KH O SÁT HO T TÍNH KHÁNG N M, KHÁNG KHU N C A VI
(Catharanthus roseus L.)
KHOA CÔNG NGH SINH H C
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH H C PHÂN T
GVHD: ThS D NG NH T LINH SVTH : LÊ SANH B O
MSSV : 1053010038
Bình D ng, tháng 05 n m 2014
Trang 2t o m i đi u ki n c ng nh s h ng d n t n t̀nh đ em ć th hoƠn thƠnh chuyên
đ khóa lu n t t nghi p nƠy m t ćch t t nh t
u tiên, Em xin g i c m n sơu s c t i cô D ng Nh t Linh đư t n tình
h ng d n, ch b o em trong su t th i gian th c hi n đ tài Em xin c m n th y
Nguy n V n Minh, ng i đư truy n đ t cho chúng em nhi u kinh nghi m quý báu
c u này
Bênh c nh đ́, tôi xin c m n ćc b n, ćc em đư luôn gíp đ , đ ng viên vƠ
ph gíp tôi th c hi n đ tƠi nƠy
luôn luôn h nh ph́c vƠ ngày càng g t h́i đ c nhi u thành công
Em xin g i l i ch́c đ n ćc anh, ćc ch trong phòng thí nghi m Công ngh Vi sinh, Tr ng i h c M Thành ph H Chí Minh trƠn đ y s c kh e, h nh ph́c vƠ thƠnh công trong công vi c
b n đư ch n, c ng hi n tƠi n ng vƠ s c tr c a m̀nh cho t ng lai, cho đ t n c
Bình D ng, ng̀y 19 tháng 05, n m 2014
Lê Sanh B o
Trang 3SVTH LÊ SANH BAO
M C L C
M C L C I DANH M C HÌNH IV DANH M C B NG VI DANH M C S VII DANH M C CH VI T T T VIII
T V N 1
PH N 1: T NG QUAN T̀I LI U 4
1.1 S L C V VI SINH V T N I SINH 5
1.2 GI I THI U V CÂY D A C N 6
1.2.1 S l c v h Apocynaceae 6
1.2.2 V tŕ phơn lo i cơy d a c n 6
1.2.3 c đi m th c v t 7
1.2.4 Phơn b 7
1.3 QUAN H GI A VI SINH V T N I SINH V̀ TH C VÂT, ĆC C I M TH C V T 8
1.3.1 Quan h gi a vi sinh v t n i sinh vƠ th c v t 8
1.3.2 Nguyên t c c b n trong ch n l a th c v t đ phơn l p vi sinh v t n i sinh 9
1.4 T NG QUAN V M T S VI KHU N GÂY B NH TRÊN NG I 11
1.4.1 Escherichia coli 11
1.4.2 Salmonella typhi 12
1.4.3 Staphylococcus aureus 12
1.4.4 Pseudomonas aeruginosa 13
Trang 41.5 T NG QUAN V M T S VI N M GÂY B NH TRÊN NG I 14
1.5.1 Candida albicans 14
1.5.2 Dermatophytes 17
1.6 T̀NH H̀NH NGHIÊN C U TRONG V̀ NGÒI N C 19
1.6.1 NgoƠi n c 19
1.6.2 Trong n c 20
PH N 2: V T LI U V̀ PH NG PH́P NGHIÊN C U 21
2.1 A I M V̀ TH I GIAN NGHIÊN C U 22
2.2 V T LI U 22
2.3 THI T B , D NG C , MÔI TR NG 22
2.3.1 Thi t b 22
2.3.2 D ng c 23
2.3.3 Môi tr ng – H́a ch t 23
2.4 B TŔ TH́ NGHI M 23
2.5 PH NG PH́P 24
2.5.1 L y m u 24
2.5.2 X ĺ m u 25
2.5.3 Phơn l p 26
2.5.4 LƠm thu n 26
2.5.5 Quan śt đ i th , vi th 29
2.5.6 Ph ng ph́p th đ i kh́ng gi a vi khu n n i sinh vƠ vi khu n, vi n m gơy b nh 30
2.5.7 Ph ng ph́p th đ i kh́ng gi a vi n m n i sinh vƠ vi khu n, vi n m gơy b nh 34
2.5.8 nh danh vi khu n n i sinh ć ho t t́nh cao 38
2.5.9 nh danh vi n m n i sinh ć ho t t́nh cao 46
2.5.10 Ph ng ph́p th ng kê s li u 47
Trang 5SVTH LÊ SANH BAO
PH N 3: K T QU NGHIÊN C U V̀ TH O LU N 48
3.1 K T QU PHÂN L P VI SINH V T N I SINH T CÂY D A C N 49
3.2 K T QU KH́NG N M, KH́NG KHU N GÂY B NH C A VI KHU N N I SINH CÂY D A C N 52
3.2.1 K t qu ch ng vi khu n n i sinh ć ho t t́nh kh́ng vi khu n gây b nh 53
3.2.2 K t qu ch ng vi khu n n i sinh ć ho t t́nh kh́ng vi n m gây b nh
57
3.3 K T QU KH́NG VI KHU N, VI N M GÂY B NH C A ĆC CH NG VI N M N I SINH 61
3.3.1 K t qu ch ng vi n m n i sinh ć ho t t́nh kh́ng vi khu n gây b nh
64
3.3.2 K t qu ch ng vi n m n i sinh ć ho t t́nh kh́ng vi n m gây b nh 67 3.4 K T QU NH DANH 72
3.4.1 nh danh vi khu n 72
3.4.2 K t qu đ nh danh n m 75
3.5 TH O LU N 79
PH N 4: K T LU N V̀ NGH 80
4.1 K T LU N 81
4.2 NGH 82
T̀I LI U THAM KH O 83
Trang 6DANH M C HÌNH
Hình 1.1: Cây d a c n 7
Hình 1.2: Escherichia coli 11
Hình 1.3: Salmonella typhi 12
Hình 1.4: Staphylococcus aureus 13
Hình 1.5: Pseudomonas aeruginosa 14
Hình 1.6: Candida 15
Hình 1.7: Microsporum 17
Hình 1.8: Trichophyton 18
H̀nh 2.1: Ćc b c ti n hƠnh ph ng ph́p c y đ n bƠo t 28
Hình 2.2: K t qu vòng kháng khu n gây b nh 32
Hình 2.3: K t qu vòng kháng 34
Hình 2.4: Cách b trí m u đ i kháng 35
Hình 3.1: nh đ i th ch ng BVR7 sau 24 gi nu i c y trên môi tr ng NA 49
Hình 3.2: nh đ i th ch ng DVT63 sau 24 gi nu i c y trên môi tr ng NA 50
Hình 3.3: nh đ i th ch ng HVT83 sau 24 gi nu i c y trên môi tr ng NA 50
Hình 3.4: nh đ i th ch ng BNT41 sau 3 ngày nu i c y trên môi tr ng PDA 50
Hình 3.5: nh đ i th ch ng DNT47 sau 3ngày nu i c y trên môi tr ng PDA 51
Hình 3.6: nh đ i th ch ng DNT47 sau 3 ngày nu i c y trên môi tr ng PDA 51
H̀nh 3.7: Ch ng DVR12 kh́ng Escherichia coli 55
H̀nh 3.8: Kh́ng Pseudomonas aeruginosa c a ch ng n i sinh GVT70, DVT66 55 H̀nh 3.9: Ch ng DVR12 kh́ng Staphylococcus aureus 56
H̀nh 3.10: Kh́ng Salmonella typhi c a ch ng n i sinh GVT70, DVT66, DVT68 56
H̀nh 3.11: Ćc ch ng VVL131, HVR26 kh́ng Candida albicans 59
H̀nh 3.12: Kh́ng n m Trichophyton mentagrophytes c a ch ng HVR26 59
H̀nh 3.13: Kh́ng n m Trichophyton rubrum c a ch ng HVR26 60
Trang 7SVTH LÊ SANH BAO
Hình 3.14: Kháng n m Microsporum gypseum c a ch ng HVR26 60
H̀nh 3.15: Ch ng vi n m n i sinh BNT41, DNT51, HNT60 kh́ng Escherichia coli 65
H̀nh 3.16: H̀nh nh kh́ng Staphylococcus aureus c a ćc ch ng HNT60, DNT51, BNT41 66
H̀nh 3.17: K t qu kh́ng Salmonella typhi c a ch ng BNR3, BNR5, BNL77 66
H̀nh 3.18 : N m Trichophyton mentagrophytes đ i ch ng 68
H̀nh 3.19: N m BNT43 kh́ng n m Trichophyton mentagrophytes 69
H̀nh 3.20 : N m Trichophyton rubrum đ i ch ng 70
H̀nh 3.21: Ch ng HNT60 kh́ng n m Trichophyton rubrum 70
H̀nh 3.22: N m Microsporum gypseum đ i ch ng 71
H̀nh 3.23: Ch ng BNT43 kh́ng n m Microsporum gypseum 71
H̀nh 3.24: K t qu nhu m Gram vƠ h̀nh th́i khu n l c trên môi tr ng NA c a ch ng DVR12 72
H̀nh 3.25: K t qu nhu m Gram vƠ khu n l c ch ng VVL131 trên môi tr ng NA 73
H̀nh 3.26: K t qu nhu m Gram vƠ khu n l c ch ng HVR26 trên môi tr ng NA 74
H̀nh 3.27: K t qu nhu m Gram vƠ khu n l c ch ng GVT70 trên môi tr ng NA 75
H̀nh 3.28: Quan śt khu n l c BNR3 trên môi tr ng PDA 76
H̀nh 3.29 : Quan x́c bƠo t n m BNR3 d i ḱnh hi n vi 77
Hình 3.30: Quan sát khu n l c BNT43 trên PDA 77
Hình 3.31: Bào t ch ng BNT43 d i kính hi n vi 78
Hình 3.32: Quan sát khu n l c HNT60 trên môi tr ng PDA 78
Hình 3.33: Ch ng HNT60 d i kình hi n vi 79
Trang 8DANH M C B NG
B ng 2.1: Bi u hi n các m c phát tri n c a khóm n m 47
B ng 3.1: K t qu phơn l p vi sinh v t n i sinh t cơy d a c n 49
B ng 3.2: K t qu sƠng l c ch ng vi khu n n i sinh ć ho t t́nh 52
B ng 3.9: K t qu x́c đ nh kh n ng kh́ng n m Trichophyton rubrum c a ćc
ch ng vi n m n i sinh 69
B ng 3.10: K t qu x́c đ nh kh n ng kh́ng n m Microsporum gypseum c a ćc
ch ng vi n m n i sinh 71
Trang 9DANH M C S
S đ 2.1: Quy tr̀nh th́ nghi m 24
S đ 2.2: Quy trình th kháng khu n 37
Trang 10DANH M C CH VI T
T T
khu n l c
Trang 11T V N
Trang 12Cơy d a c n hay c̀n g i lƠ cơy tr ng xuơn, ć tên khoa h c Catharanthus
đ c tr ng nhi u n c nhi t đ i nh Vi t Nam, n Ð , Indonesia, Philippine,
châu Phi, châu Úc, Braxin Vi t Nam, d a c n là cây hoang d i có vùng phân b
đ c tr ng t t nh Qu ng Ninh cho đ n Kiên Giang d c theo vùng ven bi n, t ng
đ i t p trung nhi u các t nh mi n trung nh : Thanh Hóa, Ngh An, Th a Thiên
th́o đ ng, tiêu hóa kém và l ( oƠn Th Nhu, 2012) Hi n nay, cơy d a c n đang thu h́t s ch́ ́ c a ćc nhƠ khoa h c nh nghiên c u ng d ng ćc h p ch t trong cơy d a c n nh alkaloid ng d ng trong đi u tr ung th , cao huy t ́p ( Ơo H̀ng
C ng vƠ cs., 2011), các h p ch t vincristine, vinblastine có tác d ng ch ng ung
th (Gupta và cs., 2005) Bên c nh đ́, m t h ng đi m i đang đ c quan tơm lƠ phơn l p vi sinh v t n i sinh ć kh n ng kh́ng khu n, kh́ng n m gơy b nh trên
ng i N m 2010, Roy vƠ cs đư kh o sát h p ch t ti t ra t ćc ch ng vi khu n n i
đư phơn l p đ c 38 ch ng x khu n ć kh n ng kh́ng Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans,…
trong mô th c v t kh e m nh, không gơy ra ćc t́c đ ng tiêu c c đ n ḱ ch (Sturz
vƠ cs., 2000; Wellington vƠ Marcela, 2004) Trong nh ng n m g n đơy, nhi u
n i sinh ć th có nhi u ho t tính sinh h c h n ćc vi khu n vùng r ho c ćc vi
Trang 13đ s n xu t ćc ch t ć ho t t́nh sinh h c N m 2012, Tr n Thanh Long đư ć nghiên c u đ́nh gí kh n ng c đ nh đ m c a vi sinh v t n i sinh đ n n ng su t,
ch t l ng c a tŕi kh́m Bên c nh đ́ c̀n ć ćc nghiên c u v vi sinh v t n i
ti m n ng quan tr ng c a ch t kháng khu n (Ryan vƠ cs., 2008) N m 2013, Idris nghiên c u ho t t́nh kh́ng khu n t n m n i sinh phơn l p t cơy thu c Kigelia
s n xu t ćc h p ch t kháng n m, kháng khu n có ho t t́nh cao ng d ng đ lƠm
T nh ng ĺ do trên, chúng tôi ti n hƠnh th c hi n đ tƠi “PHÂN L P VÀ
KH O SÁT HO T TÍNH KHÁNG N M, KHÁNG KHU N C A VI SINH
V T N I SINH TRÊN CÂY D A C N (Catharanthus roseus L.)”
N i dung nghiên c u:
- Phân l p vi khu n, vi n m n i sinh
- Th nghi m đ i kh́ng gi a vi sinh v t n i sinh v i vi khu n, vi n m gơy
b nh
- nh danh vi sinh v t n i sinh ć ho t t́nh kh́ng khu n, kh́ng n m cao
nh t
Trang 14PH N 1:
T NG QUAN TÀI LI U
Trang 151.1 S L C V VI SINH V T N I SINH
Vi sinh v t n i sinh là nh ng nh ng vi sinh v t (ch y u là n m và vi khu n)
s ng trong mô th c v t kh e m nh, không gơy ra ćc t́c đ ng tiêu c c đ n ḱ ch (Sturz vƠ cs., 2000; Wellington và Marcela, 2004) t b o v m̀nh tr c nh ng t́c đ ng c a môi tr ng, vi khu n n i sinh th c v t t o thành nh ng vi khu n,
đ c tìm th y trong h u h t các loài th c v t s ng trên Tŕi đ t, gi a chúng hình
d ng, h i sinh,… ( Strobel vƠ cs., 2003)
h n vƠ m nh m h n so v i th c v t không đ c h sinh (Bandara và cs, 2006;
th c p t nhiên có l i cho th c v t ký ch mà ta có th ng d ng trong y h c, nông
trong đ t b ng ćch t ng c ng kh n ng kh đ c trên th c v t vƠ lƠm cho đ t tr
sinh trung gian, qua đ́ đ ti p t c t ng h p các ch t chuy n hóa và các h p ch t
h u c m i Bên c nh đ́, vi sinh v t n i sinh ć kh n ng t ng h p t h p s n xu t
Trang 16nghi, đ c tr ng cho m i môi tr ng t sinh th́i nh t đ nh Vi c tìm ki m các ch t
chuy n h́a th c p m i nên t p trung vƠo ćc đ i t ng s ng trong nh ng môi
tr ng kh́c nhau ć t́nh ch n l c t nhiên M t s nghiên c u t̀m th y thu c
khi phơn l p, lƠm thu n vƠ kh o śt ho t t́nh đ c tính c a m t s vi sinh v t n i sinh trong th i gian qua (Schutz, 2001) Nghiên c u c ch s n sinh ch t chuy n
n ng l n đ phơn l p t̀m ra ćc h p ch t ć kh n ng ng d ng cao, thu h́t không
́t ćc nhƠ nghiên c u (Strobel, 2003)
1.2 GI I THI U V CÂY D A C N
Tên khoa h c: Catharanthus roseus L., Vinca rosea L
Tên th ng g i: Bông d a, d a c n, hoa h i đ ng, tr ng xuơn, d ng gíc
Trang 17Hình 1.1: Cây d a c n
Ti ng Anh t Catharanthus ngh a lƠ “pure flower”: hoa tinh khi t, hoa tinh khôi vƠ roceus ć ngh a lƠ “rose coloured flower”: hoa ć mƠu s c h ng (Nguy n HoƠng Lôc, 1999)
1.2.3 c đi m th c v t
Cơy d a c n lƠ cơy thơn th o s ng lơu n m, m c đ ng, phơn nhi u cƠnh, cơy
nh t, chuy n d n sang mƠu h ng t́m theo th i gian ph́t tri n c a cơy B r r t ph́t tri n, thơn g ph́a g c vƠ ph n trên m m Cơy m c thƠnh b i dƠy, ć cƠnh đ ng Ĺ
đ n nguyên, m c đ i ch́o ch th p, h̀nh tr ng, đ u h i nh n, dƠi 4-7 cm, r ng 2-3
cm, m t trên s m, m t d i nh t, ć lông Cu ng ĺ ng n dƠi 3-5 mm Gơn ĺ h̀nh lông chim l i m t d i, 12-14 c p gơn ph h i l i m t d i, cong h ng lên trên
R th ng ch ć m t r ch́nh vƠ nhi u r ph R ch́nh đơm th ng xu ng đ t, ć
th đ t chi u dƠi 30-40 cm, r ph m c thƠnh ch̀m th a, ng n, ph́t tri n theo chi u
d i, trên chia thƠnh 5 th̀y h̀nh tam gíc h p Hoa ć mƠu t́m ( T t L i,
1991; Ơo H̀ng C ng, 2011)
1.2.4 Phơn b
Chi d a c n Catharanthus rosesus ć ngu n g c t đ o Madagasca Chơu Phi
Nh ng ń đư m c hoang d i vƠ đ c tr ng nhi u n c nhi t đ i nh n Ð ,
Trang 18Indonesia, Philippine, châu Phi, châu Úc, Braxin T i châu Âu và châu M
( oƠn Th Nhu, 2012)
ki n đ t đai khô c n c a vùng cát ven bi n D a c n có vùng phân b t nhiên
t ng đ i đ c tr ng t t nh Qu ng Ninh đ n Kiên Giang d c theo vùng ven bi n,
t ng đ i t p trung nhi u các t nh mi n Trung nh Thanh H́a, Ngh An, Th a
Tr c đơy, d a c n ch đ c tr ng làm c nh, nh ng g n đơy đư đ c tr ng đ thu
1.3 QUAN H GI A VI SINH V T N I SINH VÀ TH C VÂT,
1.3.1 Quan h gi a vi sinh v t n i sinh vƠ th c v t
c a cơy Trên cơy ć nh ng h vi sinh v t trong đ́ ć nh ng ch ng t n t i im l̀m vƠ
ch gơy b nh khi cơy giƠ y u ho c đi u ki n b t l i S t ng t́c gi a th c v t ch
vƠ vi sinh v t gơy b nh trong su t qú tr̀nh ph́t tri n lơu dƠi d n đ n vi c xu t hi n
đ t bi n gen t nh ng vi sinh v t gơy b nh thƠnh nh ng ch ng vi sinh v t h u ́ch
Vi sinh v t n i sinh lƠ m t t́c nhơn cơn b ng h vi sinh trên th c v t ch nh m
ng n ch n nh ng t́c nhơn vi sinh v t gơy b nh (Strobel, 2003)
Vi sinh v t n i sinh đ c t̀m th y trong h u h t ćc lo i th c v t trên Tŕi
đ t, ch́ng c tŕ trong n i mô vƠ gi a ch́ng h̀nh thƠnh m t lo t ćc m i quan h kh́c nhau nh c ng sinh, t ng h , c ng sinh dinh d ng, h i sinh… Ćc d ng n i ḱ sinh nƠy đa ph n xu t hi n t v̀ng r hay b m t ĺ Tuy nhiên, m t s loƠi ć
Trang 19th ḱ sinh trong h t Vi sinh v t n i sinh th́c đ y th c v t t ng tr ng, t ng n ng
su t vƠ đ́ng vai tr̀ nh lƠ m t t́c nhơn đi u h̀a sinh h c (Strobel, 2003)
Nh ng t ng t́c ć l i gi a th c v t – vi sinh v t n i sinh nh th́c đ y s ph́t tri n, t ng s c đ kh́ng c a cơy tr ng, v n đ nƠy đang đ c ćc nhƠ nghiên
c u quan tơm nh nghiên c u vi sinh v t n i sinh và các h p ch t hóa h c có ho t
Hu (Ph m Quang Thu 2012) G n đơy, h đang nghiên c u ti m n ng cho gi i ph́p nơng cao kh n ng phơn h y sinh h c ćc ch t ô nhi m trong đ t Ć kho ng 300.000 loƠi th c v t t n t i trên Tŕi đ t, m i loƠi lƠ m t ḱ ch cho m t đ n nhi u ćc d ng n i sinh c tŕ Ch ć m t s loƠi th c v t đ c nghiên c u hoƠn ch nh v
m i quan h n i ḱ sinh c a ch́ng Do đ́ c h i nghiên c u vƠ t̀m ra ćc d ng n i ḱ sinh m i vƠ ć l i trong s đa d ng sinh h c c a ćc h sinh th́i kh́c lƠ r t đ́ng
k (Strobel, 2003)
Vi sinh v t n i sinh c tŕ trong h sinh th́i th́ch h p t ng t nh ćc ch i
m m th c v t, đi u nƠy lƠm cho ch́ng tr thƠnh ćc t́c nhơn ki m sót sinh h c
(Berg vƠ cs., 2005) Nhi u nghiên c u đư ch ra r ng vi sinh v t n i sinh ć kh
n ng ki m sót m m b nh trên th c v t N m 2009, Gazis vƠ c ng s đư phơn l p vi
khu n n i sinh m i Hevea brasiliensis ki m soát sinh h c ch ng l i các tác nhân
t c đ n y m m c a h t, th́c đ y s h̀nh thƠnh cơy con trong đi u ki n b t l i vƠ nơng cao kh n ng t ng tr ng c a th c v t ( Chanway, 1997) Bên c nh đ́, vi sinh
v t n i sinh c̀n ć kh n ng ng n ch n m m b nh ph́t tri n b ng ćch t ng h p ćc ch t n i sinh trung gian, qua đ́ đ ti p t c t ng h p ćc ch t chuy n h́a vƠ ćc
h p ch t h u c m i Nghiên c u ch ph m s n sinh ch t chuy n h́a m i trong s
đa d ng sinh h c c a vi sinh v t n i sinh ć th ph́t hi n ćc lo i thu c m i đ đi u
tr ć hi u qu ć b nh ng i, th c v t vƠ đ ng v t ( Strobel vƠ cs., 2003)
1.3.2 Nguyên t c c b n trong ch n l a th c v t đ phơn l p vi sinh v t
n i sinh
Trang 20Trên th gi i ć vô s loƠi th c v t v i s l ng kh ng l , do đ́ ta không th
đ a vƠo th́ nghi m m t ćch ch quan hay ng u nhiên V̀ v y, đ̀i h i ph i ć nguyên t c l a ch n nh t đ nh, ph̀ h p v i m c đ́ch đ ć đ c ngu n vi sinh v t
n i sinh h u ́ch, ć t́nh ng d ng cao (Strobel vƠ cs., 2003)
Khi th c v t s ng trong môi tr ng b t th ng, ćc đi u ki n t nhiên kh c nghi t s t o cho ch́ng ć kh n ng ch ng ch u cao
V́ d : Rhyncholacis penicillata lƠ m t loƠi th c v t s ng d i n c Southwest Venezuela, n i mƠ môi tr ng n c r t bi n đ ng, cơy luôn b va đ p
b i n c cu n, m nh v ng, đ́, s i,… lƠm cho cơy th ng xuyên b t n th ng Tuy nhiên, s l ng cơy nƠy không gi m śt vƠ v n kh e m nh, ć th ń đ c b o v
b i vi sinh v t n i sinh D a vƠo m i liên h nƠy mƠ ch ng Serratia marcescens đư phơn l p t cây R penicillata ć kh n ng ng d ng đ s n xu t Oocydin A, m t
M t s loƠi th c v t đư đ c s d ng theo kinh nghi m dơn gian t đ i nƠy sang đ i kh́c đ ch a lƠnh v t th ng, kh́ng khu n, kh́ng n m,… thu đ c k t
qu kh quan V́ d : Kennedia nigriscan, m t lo i cơy leo ́c đưn đ c dơn gian
s d ng śp nh a đ đi u tr v t th ng, śt tr̀ng T cơy nƠy đư phơn l p đ c
ch ng Streptomyces sp NRRL 30562 m i ng d ng s n xu t kh́ng sinh ( Strobel
vƠ cs., 2003) Cơy d a c n, m t loƠi cơy thơn th o theo kinh nghi m y h c dân gian
ho t t́nh kh́ng Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Vibrio cholerae,
Ćc th c v t ć tu i th b t th ng, ph́t tri n trong ćc v̀ng bi n đ i sinh
h c l n hay s ng trong khu v c đ t đai c x a,… c ng lƠ đ i t ng nghiên c u r t ĺ t ng cho vi sinh v t n i sinh m i l (Strobel vƠ cs, 2003)
Trang 211.4 T NG QUAN V M T S VI KHU N GÂY B NH TRÊN
Loài : Escherichia coli
Ph ng, 2012)
Hình 1.2: Escherichia coli
tùy nghi, nhi t đ t 5 – 40oC Trong đi u ki n thích h p E coli phát tri n r t
th mƠ b̀nh th ng chúng không hi n di n
h th ng mi n d ch c a ký ch b suy y u
Trang 22E coli gây b nh đ ng ru t Tác nhân gây b nh qua đ ng tiêu hóa b t c khi
n c u ng b nhi m vi khu n hay truy n t ng i nƠy qua ng i khác (Nguy n
Hình 1.3: Salmonella typhi
di đ ng, không sinh nha bƠo Ḱch th c kho ng 0,4 - 0,6 x 2 - 3 m S typhi là vi
Trong môi tr ng thích h p sau 24 gi khu n l c ć ḱch th c trung bình 2 – 4
mm
Kh n ng gơy b nh c a S typhi:
hàn có th gây bi n ch ng ch y u là xu t huy t tiêu hóa và th ng ru t M t s bi n
1.4.3 Staphylococcus aureus
Gi i : Prokaryote
Phân ngành : Firmicute
Trang 23L p : Firmibacteria
Loài : Staphylococcus aureus
Hình 1.4: Staphylococcus aureus
đ ng riêng l , t ng đôi, t ng chu i ng n, ho c t ng ch̀m không đ u gi ng nh ch̀m nho ơy lƠ lo i vi khu n không di đ ng và không sinh bào t , th ng c tŕ
(đ c t ) mà không c n có s hi n di n c a vi khu n Nh h i ch ng s c nhi m đ c,
t n th ng hay gi m ch c n ng Nh nhi m trùng da và mô m m, nhi m trùng h
(Nguy n Thanh B o, 2008)
Phân lo i
Phân ngành : Proteobacteria
Trang 24xo n, hai đ u tròn, dài 1 - 5 µm, r ng 0,5 - 1 µm, ít khi có v có m t ít lông m t
đ u, di đ ng, không sinh nha bào, b t màu Gram âm Chúng m c biên đ nhi t
khu n l c: m t lo i to, nh n, b tr i d t, gi a l i lên; m t lo i khác thì xù xì
Kh n ng gơy b nh c a P aeruginosa:
suy gi m mi n d ch, b b nh ác tính hay mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, vi c
huy t, d ch não t y, ti t ni u và hô h p
1.5 T NG QUAN V M T S VI N M GÂY B NH TRÊN
Trang 25N m men Candida có hình tròn hay hình b u d c, sinh s n b ng cách n y ch i
C albicans là thành viên c a h vi sinh v t da và niêm m c Nó là nhân t
đ ng v t máu nóng (mi ng, ru t, ơm đ o) vƠ không th ng xuyên trên da d ng
đ n bƠo nh ng đi u ki n nh t đ nh, n m men phân hóa thành d ng s i đ xâm
men” kh́ nghiêm tr ng
C albicans là tác nhân gây b nh da, móng, niêm m c (Candidasis,
thay đ i t đ n bƠo h̀nh b u d c sang d ng s i, đơy lƠ loƠi eukaryote l ng b i
đ n gi n, ch a ć chu k sinh s n h u tính, có th s n sinh ng m m và bào t vách
Trang 26m t s môi tr ng nuôi c y khác nhau thì c u t o hình th c a C albicans
c ng ć thay đ i Trên môi tr ng th ch đ a sabourard, C albicans d ng n m
th ch b t ngô ch a 1% tween 80, C albicans phát tri n thành s i n m gi và bào t
v́ch dƠy th ng n m đ u hay gi a ćc v́ch ng n s i n m gi (maheshwari,
2010)
c th gi m s c đ kháng s chuy n sang d ng gây b nh nh ( Maheshwari, 2010):
h , viêm h u môn và quanh h u môn
ti u, b nh candida lan t a
ng i kh e m nh b̀nh th ng, n m Candida tìm th y đ c 30% mi ng,
th ng d̀ng kh́ng sinh đ tiêu di t m t cách an toàn Candida spp c ng gơy ra
Trang 271.5.2 Dermatophytes
g i là b nh n m ngoài da Nhóm này bao g m chi Epidermophyton, Trichophyton
a con ng i (ch gây b nh và lây tr c ti p ng i qua ng i) i v i nh́m a đ t,
Diego , 2011)
c ng nh ćc s n ph m chuy n hóa c a n m có th gây ra nh ng ph n ng viêm, d
Trang 28Vi n m M.gypseum th ng s ng trong đ t, t c đ phát tri n nhanh C u trúc
d i màu nâu nh t M gypseum th ng ch ký sinh và gây b nh da, tóc
Quan sát hi n vi:
+ i đ́nh bƠo t : nhi u, đ c s c h̀nh thoi, ḱch th c 10 x 40 µm thành
+ Ti u đ́nh bƠo t : hi m
B nh do n m Microsporum gypseum gây ra:
ch c hay h c lào
kính kho ng 5 - 8 µm, nh ng bào t này ph n bao tóc (Molina de Diego, 2011)
th ng có t 1 đ n 12 v́ch ng n m ng Ch́ng đ c t o ra đ n l ho c thành các
– 86 µm, chi u r ng 4 – 14 µm Bào t đ́nh nh , th ng nhi u h n bƠo t đ́nh
Trang 29l n, chúng có th là hình c u, hình qu lê ho c hình chùm, không cu ng, vƠ đ c
t o ra đ n l d c theo 2 bên s i n m ho c thành c m gi ng nh ch̀m nho
viêm B nh gây ng a ngáy và khó ch u
mi n d ch suy y u b nh do n m T rubrum gây ra chi m 35,7 %
v c l̀ng bƠn tay vƠ ph́a trong nǵn tay lƠ n i th ng b nh h ng nh t, d u hi u
th ng th y nh t là s phân b dày s ng lan t a l̀ng bƠn tay sau đ́ ra mu tay, r̀a
ng d ng vƠo th c ti n Sturz vƠ Matheson (1996), Duijff vƠ c ng s (1997), Krishnamurthy vƠ Gnanamanickam (1997) đư ch ra r ng vi khu n n i sinh có kh
n ng ki m sót đ c m m b nh trên th c v t, nghiên c u c a Azevedo và c ng s
đơy, v n đ v vi sinh v t n i sinh đang đ c m r ng nghiên c u nh ki m tra s
t ng t́c c a n m n i sinh đ i v i th c v t (Hyde và Soytong, 2008) Nghiên c u
ph ng ph́p phơn l p và mô t đ c đi m vi khu n n i sinh t các loài th c v t khác
Trang 30nhau Rosenblueth và Martinez-Romero (2006) đư công b m t danh sách toàn di n
đ nh danh đ c ch ng n m n i sinh Curvularia lunata t cơy d a c n ć kh n ng kh́ng Bacillus subtilis, Salmonella paratyphi, Proteus vulgaris, Vibrio cholerae,
chi t đ c các h p ch t Vincristine, Vinblastine, Catharanthine, and Vindoline t lá
minh đ c vi n m n i sinh Fusarium oxysporum phân l p t cây d a c n có kh
n ng sinh h p vincristine và vinblastine ng d ng đ s n xu t thu c ch ng ung th
1.6.2 Trong n c
T i Vi t Nam, đư ć nhi u nghiên c u v vi sinh v t n i sinh trong các loài
i p và Nguy n ThƠnh D ng (2010) phơn l p vi khu n n i sinh trong cây khóm
tr ng trên đ t phèn huy n B n L c, t nh Long An và huy n V nh Thu n, t nh Kiên
đ c s n (Oryza sativa L.) tr ng đ ng b ng sông C u Long Nghiên c u c a
L ng Th H ng Hi p và Cao Ng c i p (2011), phân l p và nh n di n vi khu n
n i sinh và các h p ch t hóa h c có ho t tính kháng n m gây b nh các dòng Keo
tai t ng kh o nghi m t i Th a Thiên Hu
Trang 31PH N 2:
NGHIÊN C U
Trang 322.1 A I M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U
tƠi đ c th c hi n trong th i gian t 05/11/2013 – 25/05/2014 t i phòng thí
2.2 V T LI U
28 m u cơy d a c n kh e m nh đ c l y đ phơn l p vi sinh v t n i sinh t 7
t nh g m B̀nh D ng, ng Nai, Long An, Ti n Giang, Tơy Ninh, ThƠnh ph H Ch́ Minh, V ng TƠu
Trang 33 Môi tr ng Nutrient Agar (NA)
Môi tr ng Potato Dextrose Agar (PDA)
Môi tr ng Trypticase soya Agar (TSA)
Môi tr ng Pseudomonas F
Môi tr ng Pseudomonas P
Môi tr ng Barid- Parker
Thu c nhu m t́m k t tinh( Crystal violet)
Thu c nhu m lugol
Trang 34đ m b o sao cho kh n ng ć s hi n di n c a ch ng vi sinh v t là cao nh t M u
d a c n đ c ch n lƠ nh ng cây kh e m nh, ĺ xanh t t, thơn cơy c ng ch c, r ph́t
M u d a c n kh e m nh
X lý m u
Trang 35tri n t t, không m c sơu b nh vƠ t ng tr ng t t Nên ch n nh ng cơy ć c m quan
t i u nh t t i v tŕ l y m u (Shivas, 2005)
M u đ c thu nh ng n i cây m c hoang d i t i các t nh lúc sáng s m hay
s ng c a cơy d a c n kh e m nh, không m c sơu b nh ́nh d u m u vƠ b o qu n
mƠng l c sau đ t lên ćc đ a môi tr ng TSA và 30oC, sau 24 gi đ i v i vi khu n T ng t , c y trang trên môi tr ng PDA vƠ trong 27oC trong vƠi ngƠy,
n u không th y s xu t hi n c a khu n l c th̀ m u đư kh tr̀ng đ t yêu c u
Trang 362.5.3 Phân l p
M u sau khi m u đư x ĺ xong, ti n hƠnh phơn l p trên môi tr ng Trypticase
tri n c a vi khu n n i sinh (Roy, 2010)
M u sau khi đư x ĺ xong, ti n hƠnh phơn l p trên môi tr ng Potato
Dextrose Agar (PDA) có b sung kháng sinh Chloramphenicol 0,05 % và b c kín
n i sinh (Kafur, 2011; Idris, 2013)
Ti p đ n ch́ng tôi ti n hƠnh lƠm thu n vi n m n i sinh Quan śt, nh n x́t, đ́nh d u ćc v̀ng khu n l c xung quanh m u v h̀nh d nh, mƠu s c, ḱch th c…
vƠ ti n hƠnh c y sang ćc đ a môi tr ng PDA cho đ n khi thu đ c khu n l c thu n L u ́, t m t khu n l c l y t m u th́ nghi m ta ć th ć đ c ́t nh t m t
ch ng n i sinh (Dokata, 2013)
i v i vi khu n: Ch́ng tôi ti n hƠnh lƠm thu n vi khu n n i sinh
Quan śt, nh n x́t, đ́nh d u ćc v̀ng khu n l c xung quanh m u v h̀nh d nh, mƠu s c, ḱch th c,…sau 48 gi trên môi tr ng TSA Ti n hƠnh c y ria nhi u l n trên môi tr ng NA cho đ n khi thu đ c khu n l c ć đ đ ng đ u v h̀nh d ng, mƠu s c (Ph m Quang Thu, 2012) L u ́, t m t khu n l c l y t m u th́ nghi m
ta ć th ć đ c ́t nh t m t chu n n i sinh (Dokata, 2013)
i v i vi n m: Ch́ng tôi ti n hƠnh ćc ph ng ph́p sau:
Cách 1: khi n m n i sinh đư m c t m u th́ nghi m, ti n hành tách n m và c y
sang ćc đ a môi tr ng PDA kh́c, l p l i cho t i khi đ c s i n m thu n khi t
- B c 1 ki m tra ćc đ a c y hƠng ngƠy d i kính lúp soi n i vƠ đ́nh gí
s phát tri n c a s i n m t các mi ng c y
- B c 2 x́c đ nh xem có nhi u h n m t loài n m m c lên hay không
Trang 37- B c 3 c y truy n khi s i n m m c đ c kho ng 5mm t mi ng c y
- B c 4 c t m t mi ng th ch nh (2 × 2 mm) t rìa m i t n n m và c y sang môi tr ng PDA
Cách 2: c y đ n bƠo t t ćc t n n m m c lên t l n phân l p đ u tiên lên môi
tr ng PDA cho đ n khi thu đ c nh ng khu n l c ć đ đ ng đ u v hình d ng vƠ
màu s c ( Lester, 2008)
nh s i n m trên m t th ch có l n bào t ho c l y m t chút bào t kh i
Trang 38ảình 2.1: Các b c ti n h̀nh ph ng pháp c y đ n b̀o t
(Ngu n: Lester, 2008)
Trang 392.5.5 Quan śt đ i th , vi th
Quan śt đ i th : b ng m t th ng, hay dùng kính lúp c m tay nh n xét v ḱch th c, màu s c… c a khu n l c vi sinh v t n i sinh
quan śt d i kính hi n vi v t kính 100X , làm tiêu b n n m m c, r i quan sát hình
- t tiêu b n đư ph t kính và c đ nh m u lên thanh th y tinh ch U
tr ng PDA (c ph n m c trên vƠ d i m t th ch) đ vào gi t dung d ch
lactophenol Dùng kim có cán hay que c y nh n dìm n m vào gi t dung d ch
lactophenol đ th m t Khi n m b th m t hoƠn toƠn th̀ đ y lá kính lên trên và
ép nh
L u ́:
- Khi đ y ĺ ḱnh đ ng đ có b t khí, n u có s g p kh́ kh n trong khi soi
kính
Trang 40- Khi ép nh lá kính, nên dùng gi y th m b t dung d ch Lactophenol th a đ
dung d ch không tràn lên trên m t lá kính
- Ph ng ph́p nƠy d̀ng trong tr ng h p c n quan sát ngay các m u n m
m c
đơy s d ng đ a petri bên trong ć ch a bông g̀n t bên trên ć đ t thanh ch U
nhu m b ng lactophenol và quan sát
L u ́:
Chu n b d ch vi khu n n i sinh th nghi m:
