phân lập vi khuẩn bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (penaeus monodon) tại sóc trăng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN LÊ MỸ PHƯƠNG PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TRONG AO NUÔI TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI SÓC TRĂNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN Cần Thơ, 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN LÊ MỸ PHƯƠNG PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TRONG AO NUÔI TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI SÓC TRĂNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN Cần Thơ, 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu DANH MỤC HÌNH Hình Trang Hình 4.1: Khuẩn lạc sau 24 giờ ở độ pha loãng 10 -2 21 Hình 4.2: Khuẩn lạc thuần trên TSA sau 24 giờ 21 Hình 4.3: Vi khuẩn gram dương 22 Hình 4.4: Bào tử sau 28 giờ 22 Hình 4.5: Các bào tử tự do sau 36 giờ 22 Hình 4.6: Thủy phân Starch 24 Hình 4.7: Thuỷ phân Casein 24 Hình 4.8: Thuỷ phân Gelatin 24 Hình 4.9: Phản ứng V-P dương tính 25 Hình 4.10: Tạo Nitrite từ Nitrate dương tính 25 Hình 4.11: Methyl red dương tính 25 Hình 4.12: Vi khuẩn phát triển ở các nồg độ muối 2%, 5%, 7%, 10% 26 Hình 4.13: Xylose (+), Arabinose (+), Mannitol (+), Glucose (+), Sucrose (-) 26 Hình 4.14: Kết quả chạy điện di ADN dòng chuẩn Bacillus subtilis 27 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu MỤC LỤC Phần I: GIỚI THIỆU 1 Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Ứng dụng của vi sinh vật đối với đời sống con người 3 2.2 Các vấn đề phát sinh trong ao nuôi tôm thâm canh 4 2.3 Probiotic trong thuỷ sản 6 2.3.1 Khái niệm và ứng dụng của probiotic 6 2.3.2 Cơ chế tác dụng của probiotic 7 2.4 Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 8 2.4.1 Vị trí phân loại 8 2.4.2 Quá trình hình thành bào tử 9 2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis 10 2.5 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn 11 2.6 Phương pháp PCR 12 Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 14 3.2 Môi trường, hóa chất và thiết bị 14 3.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu 15 3.3.1 Thu mẫu 15 3.3.2 Phân tích mẫu 15 3.4 Phân lập vi khuẩn 15 3.5 Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khuẩn 15 3.6 Phương pháp PCR 17 3.6.1 Ly trích ADN 17 3.6.2 Qui trình chạy PCR 18 3.6.3 Chạy điện di và đọc kết quả 18 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 19 4.2 Kết quả về hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khuẩn 19 4.3 Kết quả PCR dòng chuẩn 26 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 28 5.1 Kết luận 28 5.1 Đề xuất 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ. Đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng cùng gia đình và các bạn lớp Bệnh học Thủy sản K30 đã động viên và hỗ trợ cho em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp. Sinh viên thực hiện Lê Mỹ Phương Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TÓM TẮT Bacillus subtilis là vi khuẩn có lợi, có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Phần lớn các sản phẩm men vi sinh bán trên thị trường đều có thành phần là B. subtilis. Đề tài được thực hiện nhằm phân lập và xác định đặc tính sinh hoá vi khuẩn phân lập để định danh vi khuẩn B. subtilis trong ao nuôi tôm sú thâm canh. Thu mẫu bùn tại 4 ao nuôi tôm thâm canh tại Sóc Trăng với nhịp thu 2 tuần/lần và phân tích tại phòng thí nghiệm. Kết quả phân lập được 39 chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus, trong đó có 8 chủng cho kết quả các đặc tính sinh hoá gần giống với Bacillus subtilis. Tám chủng vi khuẩn này sẽ được trữ lại và tiếp tục định danh theo phương pháp PCR. Tuy nhiên do thời gian có hạn đề tài chỉ thực hiện đến việc xác định chủng vi khuẩn chuẩn B. subtilis S19 (bằng phương pháp PCR) sử dụng làm đối chứng dương. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 1 Phần I: GIỚI THIỆU Trong những năm gần đây, thuỷ sản đã trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của nước ta. Sản lượng thuỷ sản không chỉ đáp ứng được nhu cầu thực phẩm trong nước mà còn xuất khẩu sang thị trường các nước như Nhật, Nga, Mỹ, Úc,… Năm 2007, xuất khẩu thuỷ sản nước ta đạt 3,7 tỷ USD, vượt 2,78% so với kế hoạch, tăng 10,45% so với năm 2006 (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2007). Trong đó tôm Sú (Penaeus monodon) là một trong những sản phẩm xuất khẩu chủ lực, chiếm 39,9% tổng sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu. Tuy nhiên để tăng năng xuất và lợi nhuận, người nuôi đã không ngừng tăng mật độ giống thả, sử dụng thuốc, hoá chất trong phòng và trị bệnh chưa hợp lý, thiếu sót trong quản lý môi trường… Vấn đề trên không chỉ làm xáo trộn sự cân bằng sinh học của hệ sinh thái trong ao nuôi mà còn tạo điều kiện cho dịch bệnh bùng phát ảnh hưởng đến sức khoẻ vật nuôi, đồng thời gây ô nhiễm môi trường. Trước tình hình trên, xu hướng chung của thế giới là “phòng bệnh hơn chữa bệnh”. Hiện nay nhiều mô hình nuôi bền vững được đề xuất và áp dụng như nuôi tôm thân thiện môi trường, nuôi sinh thái, nuôi an toàn sinh học… Gần đây các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu việc tận dụng các vi sinh vật hữu ích để tạo các chế phẩm sinh học (như: Bio-remediation, Bio-control, Probiotics) thông qua cơ chế tác động của chúng như: sản xuất các hợp chất ức chế hoặc vi sinh vật gây hại, cạnh tranh về dinh dưỡng, nơi cư trú, tiết enzym phân huỷ hợp chất hữu cơ giúp cải thiện môi trường ao nuôi, hỗ trợ quá trình tiêu hoá cho đối tượng nuôi… Một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất là Bacillus. Hầu hết các loài Bacillus không độc hại đối với động vật kể cả người. Nó có vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hoá chất và enzym (trích dẫn bởi Olmos, 2005). Đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) tại Sóc Trăng” được thực hiện với mục tiêu và nội dung: Mục tiêu Phân lập và xác định các đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú thâm canh. Từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2 Nội dung Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn trong ao nuôi tôm sú thâm canh. Khảo sát các đặc điểm sinh học của vi khuẩn theo phương pháp truyền thống. Nhận diện dòng vi khuẩn chuẩn Bacillus subtilis S19 bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3 Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Ứng dụng vi sinh vật đối với đời sống con người Việc nghiên cứu vi sinh vật phát triển rất nhanh đã dẫn đến việc hình thành các lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học (Bacteriology); nấm học (Mycology); tảo học (Phicology); virus học (Virology),…Chúng được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như: y học, thú y, công nghiệp, nông nghiệp, môi trường,…(Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2005). Đa số vi sinh vật trong tự nhiên là có lợi, do đó cần nghiên cứu vai trò to lớn về nhiều mặt của các nhóm vi sinh vật trong tự nhiên và trong công nghiệp. Trên cơ sở đó tìm kiếm các phương pháp nhằm khai thác đầy đủ nhất những tác động tích cực của vi sinh vật và ngăn chặn một cách hiệu quả nhất các tác động có hại của chúng. Định hướng nghiên cứu về các lĩnh vực của công nghiệp vi sinh vật nhằm tạo ra nhiều chế phẩm vi sinh vật hữu ích ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp, công nghiệp, phục vụ đắc lực cho hoạt động sống của con người (Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2005). Vi sinh vật tham gia vào việc khép kín vòng tuần hoàn các vật chất và giữ cân bằng sinh thái trong tự nhiên. Một số chủng vi sinh vật tiết ra chất kháng sinh, vitamin, chất kích thích sinh trưởng, hoặc trong tế bào chứa tinh thể diệt côn trùng áp dụng trong công nghệ sản xuất chất kháng sinh, vitamin, thuốc bảo vệ thực vật,… Ngoài ra, vi sinh vật còn phân huỷ các chất độc hại, các phế thải nông nghiệp, công nghiệp, làm sạch môi trường,…(Nguyễn Khắc Thái Sơn, 2007) Trong y học, công nghệ vi sinh đã góp phần trong việc tìm kiếm nhiều loại dược phẩm quan trọng, chẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh hiểm nghèo cho người, gia súc, gia cầm. Đặc biệt trong quá trình tìm kiếm các biện pháp, thuốc phòng trị các loại bệnh truyền nhiễm, công nghệ vi sinh đã tạo ra vacxin từ vi sinh vật như: vacxin tạo từ riboxom của từng loài vi khuẩn gây bệnh, có ưu điểm ít độc và tính miễn dịch cao hoặc vacxin được tạo từ các mảnh của vỏ virus gây bệnh. Ngoài ra vacxin còn được chế tạo từ vi khuẩn hoặc nấm men tái tổ hợp có mang gen mã hoá việc tổng hợp protein của kháng nguyên gây bệnh (Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2005). Công nghệ vi sinh còn được ứng dụng để sản xuất men tiêu hóa cho con người. Hầu hết các men tiêu hóa hiện nay dùng cho con người trên thị trường đều có chứa các vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 4 subtilis như: Biosubtilic, Bidisubtilic, Antibio, Biofidin, Biobaby,…(Nguyễn Khắc Thái Sơn, 2007). Vi sinh vật còn có vai trò trong việc tạo ra nguồn năng lượng cho con người như lên men nguyên liệu rẻ tiền như rỉ đường để sản xuất cồn chạy xe thay xăng. Nhờ quá trình lên men yếm khí của vi sinh vật đã chuyển hoá vật chất hữu cơ tạo Biogas làm khí đốt. Đặc biệt, vi sinh vật có vai trò rất lớn trong việc bảo vệ môi trường, tham gia tích cực trong việc xử lý phế thải nông nghiệp, công nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải,…làm sạch môi trường. Trong tự nhiên, nhờ hoạt động sống của vi sinh vật nên một lượng lớn các chất hữu cơ bị khoáng hoá. Các hợp chất hữu cơ được chuyển hoá qua hàng loạt các phản ứng hoá học, xúc tác mỗi phản ứng là một enzyme (Nguyễn Xuân Thành, 2005). Trong chuyển hoá các hợp chất trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật cùng tham gia, sản phẩm chuyển hoá của vi sinh vật này lại là cơ chất cho vi sinh vật khác, hoạt động của chúng diễn ra phức tạp và có mối liên hệ chặt chẽ với nhau. Sự phân huỷ các chất hữu cơ diễn ra với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào thành phần, số lượng và điều kiện môi trường. Thành phần chủ yếu của hợp chất hữu cơ trong nước và bùn ao nuôi tôm bao gồm: protein, lipit, hydratcacbon, kitin. Các vi khuẩn có khả năng phân huỷ protein thường gặp thuộc chi Pseudomonas, Clostridium, Bacillus. Chúng phân giải protein thành polypeptit, axit amin, NH 3 . Nhóm vi sinh vật phân huỷ các hydratcacbon bao gồm chi Bacillus, Aspegilus streptomyces, Streptocococus, Clostrium,… Trong quá trình này các hydratcacbon (tinh bột, xenluloza, pectin, hemixenluloza,…) được phân giải thành những phần nhỏ hơn, tạo ra các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như các khí (NH 3 , CO 2 ), axit formic, axit acetic, axit propinic, axit béo, axit lactic, các chất khoáng và sinh khối mới của vi sinh vật (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm). Một trong những đặc điểm quan trọng của vi sinh vật là chúng sinh trưởng nhanh. Khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp chỉ sau 24 giờ từ một tế bào vi sinh vật có thể thu được một sinh khối lớn. Hơn nữa chúng có thể nuôi cấy dễ dàng trên các cơ chất rẻ tiền, không tốn nhiều diện tích và việc sản xuất không phụ thuộc vào sự thay đổi của thời tiết (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm). [...]... ư c vi khu n Listonella anguillarum xu t hi n trong nư c, bùn áy ao nuôi và trong các cơ quan c a tôm sú Tác gi cho bi t trên mang, cơ, d dày và gan t y c a tôm sú trong ao nuôi có s d ng probiotic, s lư ng vi khu n Listonella anguillarum th p hơn so v i ao i ch ng K t qu này ch ng minh các s n ph m bài ti t c a Bacillus trong th c ăn và ru t tôm c ch s phát tri n c a L anguillarum trong cơ th tôm. .. phát sinh trong nuôi tôm thâm canh Trong nuôi tôm thâm canh, vi c làm s ch và duy trì ao nuôi s ch v n còn nhi u khó khăn, khi n cho nh ng ngư i nuôi tôm g p r t nhi u r i ro Tình tr ng nhi m b n n ng c a ao nuôi tôm m c dù ã ư c kh c ph c b ng gi i pháp thay nư c s ch thư ng xuyên hay nư c ã ư c x lý, song ph n bùn ao nơi các ch t th i tích t trong quá trình nuôi là môi trư ng lý tư ng cho các vi trùng... (1998), m m b nh do vi khu n Vibrio spp ã ư c xem là m t trong nh ng nguyên nhân làm tôm ch t hàng lo t Tuy nhiên, các ly trích t bào t do Bacillus subtilis BT23 cho th y có hi u qu cao trong vi c ch ng l i s tăng trư ng c a Vibrio harveyi phân l p t tôm sú b nh en mang, t l ch t c a tôm gi m 90% (Vaseeharan and Ramasamy, 2002) Nghiên c u này cho th y m m b nh Vibrio b ki m soát b i Bacillus trong i u ki... dòng chu n Bacillus subtilis S19 và s ư c dùng làm i ch ng dương nh n nh s n ph m PCR cho vi c nh danh ti p 8 ch ng phân l p theo phương pháp phân t 5.2 xu t Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Ti p t c nh danh các ch ng vi khu n phân l p theo phương pháp PCR Nghiên c u kh năng phân hu các ch t h u cơ và kh năng di t khu n c a Bacillus subtilis phân l p t ao nuôi tôm TÀI... tăng trư ng, nâng cao t l s ng c a tôm sú (Vaseeharan et al., 2004) K t qu này cũng trùng v i nghiên c u c a Moriarty (1998), sau khi s d ng probiotic (ch a ch ng Bacillus spp.) t l s ng c a tôm sú tăng, h n ch ư c m m b nh vi khu n phát sáng Vibrio spp trong nư c và bùn áy ao 2.3.2 Cơ ch tác d ng c a Probiotic Nhóm vi sinh v t d dư ng ho i sinh như m t s loài thu c nhóm Bacillus (B subtilis, B licheniformis,... ti m năng c a các vi khu n ch ng các m m b nh gây r i lá trà Nhi u dòng vi khu n B subtilis ã ư c xác nh là có kh năng ch ng m m bào t c a m m b nh Hi n nay các nhà nghiên c u ang ti n hành các thí nghi m nâng cao hi u qu th c a c a nh ng dòng vi khu n ch n l c (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin) B subtilis là m t trong nh ng vi khu n có ti m năng nh t, thu n l i trong vi c c i thi n s... qu phân tích cho th y th i gian nuôi vi khu n càng lâu thì bào t hình thành càng nhi u T Hình 4.4, sau 28 gi , bào t còn n m trong t bào, s lư ng bào t ít (9 bào t /th trư ng kính hi n vi) Trong khi vi khu n sau th i gian nuôi 36 gi cho th y thành t bào ã b phân h y và ch còn các bào t t do v i s lư ng tương i nhi u (130 bào t / th trư ng kính hi n vi) i u này có th ư c gi i thích do th i gian nuôi. .. n ra trong th i gian dài giúp tôm h p thu ch t dinh dư ng t t hơn 2.4 c i m sinh h c Bacillus subtilis 2.4.1 V trí phân lo i Gi i Ngành L p B Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillates H Bacillaceae Gi ng Bacillus Loài Bacillus subtilis (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin) Năm 1872, Ferdinand Cohn (cùng th i Robert Koch), ã phát hi n và t tên là B subtilis B subtilis là tr c khu n Gram dương,... (hình c u) s b lo i b Tên c a các ch ng phân l p ư c t theo mã s a-b-c-d và li t kê trong B ng 4.1 V i: a : t thu m u (I: t 1, II: t 2, III: t 3, IV: t 4) Trung tâmthu m uliệu ĐH1,Cầnao 2, A3: aoTàiA4: ao học b: Ao Học (A1: ao A2: Thơ @ 3, liệu 4) c: S th t c a ch ng phân l p (t 1 n 39) d: Lo i m u (S: m u bùn) tập và nghiên cứu B ng 4.1 Danh m c các ch ng vi khu n phân l p ư c STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10... m u bùn trong m i ao cho vào các ĩa môi trư ng TSA (thêm 1,5% NaCl), dùng que th y tinh trãi u M i n ng pha loãng l p l i 3 l n o 30 C trong 24 – 28 gi 3.4 Phân l p vi khu n Ch n các khu n l c c trưng m c trên các ĩa môi trư ng sau khi , c y sang ĩa môi trư ng TSA (thêm 1,5% NaCl) 30ºC trong 24 gi Ti p t c tách ròng cho n khi thu ư c dòng thu n Các dòng vi khu n phân l p ư c nuôi tăng sinh trong môi . Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) tại Sóc Trăng được thực hiện với mục tiêu và nội dung: Mục tiêu Phân lập. LÊ MỸ PHƯƠNG PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TRONG AO NUÔI TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI SÓC TRĂNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP