phân lập vi khuẩn bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (penaeus monodon) tại sóc trăng

Tuy nhiên để tăng năng xuất và lợi nhuận, người nuôi đã không ngừng tăng mật độ giống thả, sử dụng thuốc, hoá chất trong phòng và trị bệnh chưa hợp lý, thiếu sót trong quản lý môi trường

Trang 1

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Cần Thơ, 2008

Trang 3

DANH MỤC HÌNH

Hình Trang

Hình 4.1: Khuẩn lạc sau 24 giờ ở độ pha loãng 10-2 21

Hình 4.2: Khuẩn lạc thuần trên TSA sau 24 giờ 21

Hình 4.3: Vi khuẩn gram dương 22

Hình 4.4: Bào tử sau 28 giờ 22

Hình 4.5: Các bào tử tự do sau 36 giờ 22

Hình 4.6: Thủy phân Starch 24

Hình 4.7: Thuỷ phân Casein 24 Hình 4.8: Thuỷ phân Gelatin 24

Hình 4.9: Phản ứng V-P dương tính 25 Hình 4.10: Tạo Nitrite từ Nitrate dương tính 25

Hình 4.11: Methyl red dương tính 25

Hình 4.12: Vi khuẩn phát triển ở các nồg độ muối

2%, 5%, 7%, 10% 26

Hình 4.13: Xylose (+), Arabinose (+), Mannitol (+), Glucose (+), Sucrose (-) 26

Hình 4.14: Kết quả chạy điện di ADN dòng chuẩn Bacillus subtilis 27

Trang 4

MỤC LỤC

Phần I: GIỚI THIỆU - 1

Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU - 3

2.1 Ứng dụng của vi sinh vật đối với đời sống con người - 3

2.2 Các vấn đề phát sinh trong ao nuôi tôm thâm canh - 4

2.3 Probiotic trong thuỷ sản - 6

2.3.1 Khái niệm và ứng dụng của probiotic - 6

2.3.2 Cơ chế tác dụng của probiotic - 7

2.4 Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis - 8

2.4.1 Vị trí phân loại - 8

2.4.2 Quá trình hình thành bào tử - 9

2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis - 10

2.5 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn - 11

2.6 Phương pháp PCR - 12

Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 14

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện - 14

3.2 Môi trường, hóa chất và thiết bị - 14

3.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu - 15

3.3.1 Thu mẫu - 15

3.3.2 Phân tích mẫu - 15

3.4 Phân lập vi khuẩn - 15

3.5 Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khuẩn - 15

3.6 Phương pháp PCR - 17

3.6.1 Ly trích ADN -17

3.6.2 Qui trình chạy PCR -18

3.6.3 Chạy điện di và đọc kết quả - 18

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 19

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn - 19

4.2 Kết quả về hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khuẩn - 19

4.3 Kết quả PCR dòng chuẩn - 26

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT -28

5.1 Kết luận - 28

5.1 Đề xuất - 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO - 29

Trang 5

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ Đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng cùng gia đình

và các bạn lớp Bệnh học Thủy sản K30 đã động viên và hỗ trợ cho em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp

Sinh viên thực hiện

Lê Mỹ Phương

Trang 6

TÓM TẮT

Bacillus subtilis là vi khuẩn có lợi, có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh

vực của đời sống Phần lớn các sản phẩm men vi sinh bán trên thị trường đều

có thành phần là B subtilis Đề tài được thực hiện nhằm phân lập và xác định đặc tính sinh hoá vi khuẩn phân lập để định danh vi khuẩn B subtilis trong ao

nuôi tôm sú thâm canh Thu mẫu bùn tại 4 ao nuôi tôm thâm canh tại Sóc Trăng với nhịp thu 2 tuần/lần và phân tích tại phòng thí nghiệm Kết quả phân

lập được 39 chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus, trong đó có 8 chủng cho kết quả các đặc tính sinh hoá gần giống với Bacillus subtilis Tám chủng vi khuẩn

này sẽ được trữ lại và tiếp tục định danh theo phương pháp PCR Tuy nhiên do thời gian có hạn đề tài chỉ thực hiện đến việc xác định chủng vi khuẩn chuẩn

B subtilis S19 (bằng phương pháp PCR) sử dụng làm đối chứng dương

Trang 7

Phần I: GIỚI THIỆU

Trong những năm gần đây, thuỷ sản đã trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của nước ta Sản lượng thuỷ sản không chỉ đáp ứng được nhu cầu thực phẩm trong nước mà còn xuất khẩu sang thị trường các nước như Nhật, Nga, Mỹ, Úc,… Năm 2007, xuất khẩu thuỷ sản nước ta đạt 3,7 tỷ USD, vượt 2,78% so với kế hoạch, tăng 10,45% so với năm 2006 (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông

Thôn, 2007) Trong đó tôm Sú (Penaeus monodon) là một trong những sản

phẩm xuất khẩu chủ lực, chiếm 39,9% tổng sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu Tuy nhiên để tăng năng xuất và lợi nhuận, người nuôi đã không ngừng tăng mật độ giống thả, sử dụng thuốc, hoá chất trong phòng và trị bệnh chưa hợp lý, thiếu sót trong quản lý môi trường… Vấn đề trên không chỉ làm xáo trộn sự cân bằng sinh học của hệ sinh thái trong ao nuôi mà còn tạo điều kiện cho dịch bệnh bùng phát ảnh hưởng đến sức khoẻ vật nuôi, đồng thời gây ô nhiễm môi trường

Trước tình hình trên, xu hướng chung của thế giới là “phòng bệnh hơn chữa bệnh” Hiện nay nhiều mô hình nuôi bền vững được đề xuất và áp dụng như nuôi tôm thân thiện môi trường, nuôi sinh thái, nuôi an toàn sinh học… Gần đây các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu việc tận dụng các vi sinh vật hữu ích để tạo các chế phẩm sinh học (như: Bio-remediation, Bio-control, Probiotics) thông qua cơ chế tác động của chúng như: sản xuất các hợp chất ức chế hoặc vi sinh vật gây hại, cạnh tranh về dinh dưỡng, nơi cư trú, tiết enzym phân huỷ hợp chất hữu cơ giúp cải thiện môi trường ao nuôi, hỗ trợ quá trình tiêu hoá cho đối tượng nuôi… Một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu

nhiều nhất là Bacillus Hầu hết các loài Bacillus không độc hại đối với động vật

kể cả người Nó có vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hoá chất và enzym (trích dẫn bởi Olmos, 2005)

Đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú (Penaeus

monodon) tại Sóc Trăng” được thực hiện với mục tiêu và nội dung:

Mục tiêu

Phân lập và xác định các đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis trong ao nuôi

tôm sú thâm canh Từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

Trang 8

Nội dung

Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn trong ao nuôi tôm sú thâm canh

Khảo sát các đặc điểm sinh học của vi khuẩn theo phương pháp truyền thống

Nhận diện dòng vi khuẩn chuẩn Bacillus subtilis S19 bằng kỹ thuật PCR

(Polymerase Chain Reaction)

Trang 9

Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Ứng dụng vi sinh vật đối với đời sống con người

Việc nghiên cứu vi sinh vật phát triển rất nhanh đã dẫn đến việc hình thành các lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học (Bacteriology); nấm học (Mycology); tảo học (Phicology); virus học (Virology),…Chúng được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như: y học, thú y, công nghiệp, nông nghiệp, môi trường,…(Nguyễn Xuân

người (Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2005)

Vi sinh vật tham gia vào việc khép kín vòng tuần hoàn các vật chất và giữ cân bằng sinh thái trong tự nhiên Một số chủng vi sinh vật tiết ra chất kháng sinh, vitamin, chất kích thích sinh trưởng, hoặc trong tế bào chứa tinh thể diệt côn trùng áp dụng trong công nghệ sản xuất chất kháng sinh, vitamin, thuốc bảo vệ thực vật,… Ngoài ra, vi sinh vật còn phân huỷ các chất độc hại, các phế thải nông nghiệp, công nghiệp, làm sạch môi trường,…(Nguyễn Khắc Thái Sơn, 2007)

Trong y học, công nghệ vi sinh đã góp phần trong việc tìm kiếm nhiều loại

dược phẩm quan trọng, chẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh hiểm nghèo cho người, gia súc, gia cầm Đặc biệt trong quá trình tìm kiếm các biện pháp, thuốc phòng trị các loại bệnh truyền nhiễm, công nghệ vi sinh đã tạo ra vacxin từ vi sinh vật như: vacxin tạo từ riboxom của từng loài vi khuẩn gây bệnh, có ưu điểm ít độc và tính miễn dịch cao hoặc vacxin được tạo từ các mảnh của vỏ virus gây bệnh Ngoài ra vacxin còn được chế tạo từ vi khuẩn hoặc nấm men tái

tổ hợp có mang gen mã hoá việc tổng hợp protein của kháng nguyên gây bệnh

(Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2005) Công nghệ vi sinh còn được ứng dụng để

sản xuất men tiêu hóa cho con người Hầu hết các men tiêu hóa hiện nay dùng

cho con người trên thị trường đều có chứa các vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus

Trang 10

subtilis như: Biosubtilic, Bidisubtilic, Antibio, Biofidin, Biobaby,…(Nguyễn Khắc Thái Sơn, 2007)

Vi sinh vật còn có vai trò trong việc tạo ra nguồn năng lượng cho con người như lên men nguyên liệu rẻ tiền như rỉ đường để sản xuất cồn chạy xe thay xăng Nhờ quá trình lên men yếm khí của vi sinh vật đã chuyển hoá vật chất hữu cơ tạo Biogas làm khí đốt

Đặc biệt, vi sinh vật có vai trò rất lớn trong việc bảo vệ môi trường, tham gia tích cực trong việc xử lý phế thải nông nghiệp, công nghiệp, rác thải sinh hoạt, nước thải,…làm sạch môi trường

Trong tự nhiên, nhờ hoạt động sống của vi sinh vật nên một lượng lớn các chất hữu cơ bị khoáng hoá Các hợp chất hữu cơ được chuyển hoá qua hàng loạt các phản ứng hoá học, xúc tác mỗi phản ứng là một enzyme (Nguyễn Xuân Thành, 2005) Trong chuyển hoá các hợp chất trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật cùng tham gia, sản phẩm chuyển hoá của vi sinh vật này lại là cơ chất cho vi sinh vật khác, hoạt động của chúng diễn ra phức tạp và có mối liên hệ chặt chẽ với nhau Sự phân huỷ các chất hữu cơ diễn ra với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào thành phần, số lượng và điều kiện môi trường Thành phần chủ yếu của hợp chất hữu cơ trong nước và bùn ao nuôi tôm bao gồm: protein, lipit, hydratcacbon, kitin Các vi khuẩn có khả năng phân huỷ protein thường gặp

thuộc chi Pseudomonas, Clostridium, Bacillus Chúng phân giải protein thành

polypeptit, axit amin, NH3 Nhóm vi sinh vật phân huỷ các hydratcacbon bao

gồm chi Bacillus, Aspegilus streptomyces, Streptocococus, Clostrium,… Trong

quá trình này các hydratcacbon (tinh bột, xenluloza, pectin, hemixenluloza,…) được phân giải thành những phần nhỏ hơn, tạo ra các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như các khí (NH3, CO2), axit formic, axit acetic, axit propinic, axit béo, axit lactic, các chất khoáng và sinh khối mới của vi sinh vật (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm)

Một trong những đặc điểm quan trọng của vi sinh vật là chúng sinh trưởng nhanh Khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp chỉ sau 24 giờ từ một tế bào vi sinh vật có thể thu được một sinh khối lớn Hơn nữa chúng có thể nuôi cấy dễ dàng trên các cơ chất rẻ tiền, không tốn nhiều diện tích và việc sản xuất không phụ thuộc vào sự thay đổi của thời tiết (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm)

Trang 11

2.2 Các vấn đề phát sinh trong nuôi tôm thâm canh

Trong nuôi tôm thâm canh, việc làm sạch và duy trì ao nuôi sạch vẫn còn nhiều khó khăn, khiến cho những người nuôi tôm gặp rất nhiều rủi ro Tình trạng nhiễm bẩn nặng của ao nuôi tôm mặc dù đã được khắc phục bằng giải pháp thay nước sạch thường xuyên hay nước đã được xử lý, song phần bùn ao nơi các chất thải tích tụ trong quá trình nuôi là môi trường lý tưởng cho các vi trùng và ký sinh trùng gây bệnh phát triển Mỗi năm ở đáy ao nuôi tôm thâm canh hình thành một lớp bùn dày 10-15 cm, tương đương 30-50 tấn/ha chất khô giàu hữu cơ (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm) Bùn có thành phần chủ yếu là chất hữu cơ, bao gồm sinh khối vi sinh vật và xác động thực vật thuỷ sinh Khi phân huỷ tự nhiên sẽ làm cạn kiệt lượng oxy hoà tan và sinh ra các chất độc hại đối với tôm như NH3, H2S,

CH4…(http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm) Từ đó làm phát sinh bệnh và gây thiệt hại lớn Theo Moriarty (1998), bệnh do vi khuẩn gây ra xảy ra ở tất cả các giai đọan phát triển của tôm và sự bùng phát bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn Theo trình bày của Ngân hàng thế giới thiệt hại kinh tế do bệnh gây ra trong nuôi thủy sản khoảng 3 tỷ đô la (Ludin, 1996; trích dẫn bởi

Vaseeharan et al., 2002)

Để kiểm soát và quản lý mầm bệnh người nuôi đã sử dụng thuốc, hóa chất bừa bãi dẫn đến hiện tượng chọn lọc và phát tán các gen kháng thuốc giữa các chủng vi khuẩn nhờ plasmid hoặc thể thực khuẩn (Moriarty, 1999) Điều này

có nguy cơ gây nguy hiểm cho người và các động vật khác Ngoài việc sử dụng kháng sinh, người nuôi còn sử dụng các chất tẩy uế để giết mầm bệnh Các chất như formaline, chlorin có thể ngăn cản sự bùng phát bệnh, nhưng lâu dài sẽ tạo

ra các vấn đề môi trường tiềm tàng (Rosenthal, 1980) Việc sử dụng chlorine kích thích sự phát triển nhiều gen kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn (Murray

et al 1981; trích dẫn bởi Moriarty, 1999)

Bên cạnh các vấn đề về môi trường, thức ăn cho tôm cũng là yếu tố quan trọng

Do thức ăn chiếm chi phí đắt nhất trong nuôi thủy sản, số lượng và chất lượng thức ăn là nhân tố đầu tiên ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tôm (Olmos, 2005) Thức ăn cho tôm chứa hàm lượng protein cao (trên 35%), do đó khi thức

ăn không được tôm tiêu thụ hoặc các chất thải bài tiết từ tôm sẽ phóng thích lượng lớn các hợp chất chứa nitơ vào môi trường nước gây các vấn đề về môi trường và dịch bệnh

Để giải quyết vấn đề chất thải lắng tụ trong ao, vấn đề kiểm soát bệnh sao cho

có hiệu quả và an toàn, đồng thời giảm chi phí về thức ăn cho tôm; các nhà

Trang 12

khoa học hướng tới việc tận dụng các vi sinh vật có lợi mà gần đây được biết như chế phẩm vi sinh (probiotics)

2.3 Probiotic trong thủy sản

2.3.1 Khái niệm và ứng dụng Probiotic

Một thời gian dài trước khi phát hiện ra Probiotic, vi khuẩn chưa được xem như nguồn thức ăn cho sinh vật khác Sau đó những nghiên cứu thực hành cho thấy những kết quả đã góp phần cải thiện sức khỏe con người Vào những năm đầu thế kỷ 20, Metchnikoff đã cấy vi khuẩn lên men acid lactic vào đường tiêu hóa của người với mục đích khống chế họat động của vi khuẩn khác Khái niệm mới về Probiotic đã được hình thành

Yasuda and Taga (1980), công bố sử dụng vi khuẩn như nguồn thức ăn và

là nhân tố sinh học trong phòng trị bệnh cá Vi khuẩn được đề nghị đầu tiên là

Vibrio alginolyticus, sử dụng như một vi sinh vật hữu ích trong các trại giống ở Ecuado từ 1992 giúp giảm thời gian nghỉ của trại từ 21 ngày xuống còn 7 ngày (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2006)

Probiotics hiện nay thường xuyên được sử dụng giúp tăng sự kháng bệnh

cho tôm và như một chất thay thế kháng sinh (Rengpipat et al., 1998)

Probiotics là vi sinh vật hoặc sản phẩm của chúng có lợi cho sức khoẻ của vật chủ Chúng được phát triển trong nuôi trồng thuỷ sản như là phương tiện kiểm soát bệnh, kích thích sự thèm ăn, cải tiến chất dinh dưỡng bằng cách tạo ra vitamin, giải độc các thành phần trong thức ăn và phân huỷ các chất không được tiêu hoá (Irianto and Austin, 2002) Theo Fuller (1987), probiotic là sản phẩm được nuôi hoặc bổ sung thức ăn vi khuẩn sống có lợi cho vật chủ bằng

cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột Theo Gram et al (1999), đề

nghị probiotic là chất bổ sung vi khuẩn sống, tác dụng có lợi đối với động vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn của nó, định nghĩa này không gắn

liền với thức ăn Hơn nữa, Salminen et al (1999), cho rằng probiotic như các

thành phần của tế bào vi khuẩn (nhưng không cần thiết phải sống) có ảnh hưởng tốt đến sức khoẻ vật chủ Tất nhiên probiotic phải không gây hại đến vật chủ (Salminen, 1999) Chúng chịu được ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ muối khác nhau (Fuller, 1987) Ngày nay, Probiotic đã được sử dụng trong thức ăn

nhân tạo (Robertson et al., 2000), thức ăn tươi sống như Artemia, Rotifers

(Gatesoupe, 1991) và sử dụng trong môi trường nước (Austin, 1995)

Hơn 50 năm qua, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu về probiotics để cải tiến các thực phẩm có lợi, góp phần tăng sức khoẻ cho con người và động vật

(Rengpipat et al., 1998) Các loài vi sinh vật thường được dùng để tạo

Trang 13

Probiotics bao gồm Lactobacillus spp., Saccharomyces sp., Bacillus spp (trích

dẫn bởi Irianto and Austin, 2003)

Austin (1995), nghiên cứu sử dụng probiotic (Vibrio alginolyticus) trên cá Hồi, kết quả cho thấy probiotic có thể làm giảm bệnh gây ra bởi Aeromonas salmonicids, Vibrio anguillarium và Vibrio ordalii Một nghiên cứu khác khi ngâm tôm Sú (PL30) 10 ngày với Vibrio harveyi có sử dụng probiotic (Bacillus

S11) cho thấy sự tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm là 100% cao hơn nhiều so

với nhóm đối chứng (không sử dụng probiotic) 26% (Rengpipat et al., 1998) Bên cạnh đó tác giả còn cho rằng Bacillus S11 có thể thay thế cả Vibrio spp., một số loài vi khuẩn khác trong ruột tôm và trong môi trường nước Theo Hasting and Nealson (1981) Bacillus S11 có thể tạo ra một số chất kháng khuẩn hoặc một vài sản phẩm chưa được biết có thể tiêu diệt V harveyi D331 Theo Moriarty (1998), mầm bệnh do vi khuẩn Vibrio spp đã được xem là một

trong những nguyên nhân làm tôm chết hàng loạt Tuy nhiên, các ly trích tế bào

tự do Bacillus subtilis BT23 cho thấy có hiệu quả cao trong việc chống lại sự tăng trưởng của Vibrio harveyi phân lập từ tôm sú bệnh đen mang, tỉ lệ chết của

tôm giảm 90% (Vaseeharan and Ramasamy, 2002) Nghiên cứu này cho thấy

mầm bệnh Vibrio bị kiểm soát bởi Bacillus trong điều kiện phòng thí nghiệm

và ngoài thực tế Theo một nghiên cứu khác của Vaseeharan et al (2004), probiotic giúp kháng được vi khuẩn Listonella anguillarum xuất hiện trong

nước, bùn đáy ao nuôi và trong các cơ quan của tôm sú Tác giả cho biết trên mang, cơ, dạ dày và gan tụy của tôm sú trong ao nuôi có sử dụng probiotic, số

lượng vi khuẩn Listonella anguillarum thấp hơn so với ao đối chứng Kết quả này chứng minh các sản phẩm bài tiết của Bacillus trong thức ăn và ruột tôm ức chế sự phát triển của L anguillarum trong cơ thể tôm đồng thời giúp tăng cường sự tăng trưởng, nâng cao tỉ lệ sống của tôm sú (Vaseeharan et al., 2004)

Kết quả này cũng trùng với nghiên cứu của Moriarty (1998), sau khi sử dụng

probiotic (chứa chủng Bacillus spp.) tỉ lệ sống của tôm sú tăng, hạn chế được mầm bệnh vi khuẩn phát sáng Vibrio spp trong nước và bùn đáy ao

2.3.2 Cơ chế tác dụng của Probiotic

Nhóm vi sinh vật dị dưỡng hoại sinh như một số loài thuộc nhóm Bacillus (B subtilis , B licheniformis, B megaterium,…) làm sạch môi trường nhờ khả năng

sinh các enzyme (protease, amylase, xenlulase, kitinase, lipase) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của các vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm)

Trang 14

Các loài thuộc giống Bacillus, Pseudomonas, Clostridium (B mesentericus, B mycoides , B subtilis, P flourescenc, C sporogenes,…) tham gia vào quá trình

amôn hóa protein, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển nitơ từ dạng khó hấp thu sang dạng muối amôn dễ được thực vật thủy sinh hấp thu và giúp làm sạch các thủy vực (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2006)

Nhóm vi sinh vật Enterococcus faecium, Streptomyces cinnamoensis, B subtilis , Lactobacillus sp., Lactobacillus acidophilus, Pediococcus acidilatici, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lên men acid lactic, có vai trò kiểm soát các sinh vật gây bệnh cho tôm, cá trong môi trường nhờ khả năng sinh các chất

ức chế như acid lactic, bacterioxin Bên cạnh đó chúng cũng được dùng làm thức ăn cho tôm, cá, giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của các vi sinh vật có hại và tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh đường ruột Đồng thời còn có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, hấp thu thức ăn, giúp vật nuôi khỏe mạnh và phát triển nhanh (http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6-08.htm)

Theo Olmos (2005), trong thức ăn nuôi tôm, probiotic có thể giúp phân hủy tất

cả các thành phần protein vì các enzyme được tạo ra bởi vi khuẩn có thể bổ sung các hoạt tính của protease giúp tăng khả năng tiêu hóa thức ăn cho tôm Hơn nữa, enzyme từ probiotic chịu được khoảng pH rộng hơn enzyme của tôm,

do đó quá trình tiêu hóa có thể diễn ra trong thời gian dài giúp tôm hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn

2.4 Đặc điểm sinh học Bacillus subtilis

Năm 1872, Ferdinand Cohn (cùng thời Robert Koch), đã phát hiện và đặt tên là

B subtilis B subtilis là trực khuẩn Gram dương, di động, có kích thước 2-3x

0,7-0,8 µm, nội bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8 µm Ở điều kiện

100oC, bào tử B subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ B subtilis hình thành bào

Trang 15

tử khi môi trường biến đổi đột ngột, cũng như sống thời gian dài dưới những điều kiện bất lợi như khan hiếm chất dinh dưỡng

cũng có thể phản ứng với sự thiếu dinh dưỡng bằng cách di chuyển cơ thể từ

các điều kiện nghèo dinh dưỡng đến nơi tốt hơn nhờ vào các lông roi (Mirel et

al., 2000)

2.4.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis

Khi môi trường bị thay đổi đột ngột hoặc do thiếu thức ăn, các loài thuộc giống

Bacillus và Clostridia khác nhau tạo ra một loại tế bào ngừng hoạt động tạm

thời gọi là nội bào tử, có thể chống lại các tấn công lớn có thể phá hủy thành tế bào (Driks, 1999) Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi nẩy nở mà để chịu đựng được với điều kiện bất lợi Đó là loại tế bào ở trạng thái nghỉ mà trong chúng các quá trình sống bị ức chế rất mạnh (Nguyễn Lân

Dũng, 1983) Cách đây 100 năm, một nghiên cứu của Koch về bào tử của B anthracis có thể sống sót ở điều kiện đun sôi, đã tạo cảm hứng cho các nhà khoa học nghiên cứu về bào tử với mục đích khám phá ra như thế nào loại tế bào ngưng hoạt động đặc biệt có thể chịu nhiệt độ và các điều kiện gây sốc khác Theo Driks (1999), bào tử có khả năng chịu nhiệt là nhờ lớp áo bào tử

Áo bào tử là một cấu trúc gồm nhiều lớp bao quanh bào tử được cấu thành bởi hơn 25 loại polypeptid liên kết chéo chặt chẽ với nhau Tuy nhiên lớp áo bào tử cũng cho phép bào tử hồi sinh khi điều kiện môi trường thích hợp Bào tử có thể chuyển đổi thành tế bào phát triển thông qua một quá trình gọi là sự nảy mầm

Trong quá trình hình thành nội bào tử, vi khuẩn cũng tạo ra các chất kháng sinh Nhiều loài hình thành bào tử có thể phân hủy một cách hiệu quả các polymer sinh học (protein, starch, pectin,…), đóng vai trò quan trọng trong các chu trình sinh học Nitơ và Carbon (http://www.textbookofbacteriology.net/Bacillus.html)

Quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn cần khoảng 8 giờ để hoàn thành (Driks, 1999) Trong quá trình hình thành bào tử, nhiễm sắc thể nhân đôi thành các bản sao riêng biệt Cuối cùng chỉ có một bản sao nhiễm sắc thể nằm trong bào tử, sau đó thành hai tế bào, các phần còn lại bị hủy đi và bào tử được phóng thích Theo Nguyễn Lân Dũng (1983), phần lớn vi khuẩn trong tế bào chỉ có thể có một bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ nảy mầm và mỗi bào

tử chỉ cho ra một tế bào dinh dưỡng

Trong tất cả các loài, không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong bất kỳ điều kiện nào Chưa có thông tin giải thích tại sao một vài tế bào

Trang 16

trong môi trường nuôi hình thành bào tử và một số khác thì không Tuy nhiên

có sự chấp nhận rằng sự hình thành bào tử bắt đầu sau pha tăng trưởng nhanh

và trong suốt pha tĩnh (Banwart, 2000)

2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis

B subtilis tạo protease kiềm (subtilisin) với lượng lớn, có đặc tính bền vững, hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều ngành công nghiệp khác nhau Subtibilin chủ yếu được sử dụng trong các ngành công nghiệp các chất tẩy rửa và cả trong y dược học Ngoài ra subtibilin còn sử dụng trong xử lý phim X quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc, làm nước mắm

cá, làm thức ăn gia xúc, xử lý chất thải từ động vật giáp xác, xử lý rác thải trong lò mổ gia cầm

Trong những năm gần đây tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên

thị trường đều là protease được sản suất từ các chủng Bacillus, mà chủ yếu là

B subtilis Năm 1971, đánh dấu bước mở đầu quan trọng cho những nghiên

cứu về protease kiềm ở Bacillus Horikoshi là người đầu tiên công bố thu nhận

và Markland tìm hiểu cấu trúc cơ bản, tính chất lý hóa của protease kiềm từ

Bacillus (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin) Năm 1972, người

ta đã nghiên cứu và đưa vào sản xuất trên quy mô lớn các protease kiềm ở một

vài loài Bacillus Đến thập kỷ 80, những nghiên cứu về protease kiềm của Bacillus tiếp tục mở rộng và đã tạo ra hàng loạt các sản phẩm trên thị trường

thương mại, vi khuẩn Bacillus trở thành “một thế giới vi sinh vật mới” theo

quan điểm công nghiệp (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin)

Gần đây người ta đã thành công trong nhân dòng phân tử, giải trình tự

nucleotide và biểu hiện gen mã hóa protease kiềm từ nhiều loài Bacillus Nhiều

chủng được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa subtilisin, trong đó chủng

Bacillus được sử dụng nhiều nhất vì đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ về đặc tính sinh lý, sinh hóa và di truyền với toàn bộ genon đã được xác định (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin)

.Ngoài những sản phẩm hóa chất, một số công ty cũng sử dụng B subtilis như tác nhân sinh học để kiểm soát địch hại B subtilis (QST 713) có hiệu quả

đáng kể chống nhiều loại vi khuẩn và bệnh nấm QST 713 hoạt động bằng cách chiếm bề mặt lá cây, cạnh tranh với các mầm bệnh để chiếm không gian và các chất dinh dưỡng, nhờ đó ngăn cản mầm bệnh bằng con đường vật lý Nó cũng sản sinh ra các chất chuyển hóa lipopeptit có tác động kết hợp để phá hủy các

(http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin)

Trang 17

Quỹ nghiên cứu trà USPAI tại Valparai, Ấn Độ đã khảo sát tiềm năng của các

vi khuẩn chống các mầm bệnh gây rụi lá trà Nhiều dòng vi khuẩn B subtilis đã

được xác định là có khả năng chế ngự mầm bào tử của mầm bệnh Hiện nay các nhà nghiên cứu đang tiến hành các thí nghiệm để nâng cao hiệu quả thực địa của những dòng vi khuẩn chọn lọc (http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin)

B subtilis là một trong những vi khuẩn có tiềm năng nhất, thuận lợi trong việc cải thiện sức khỏe và kích thích hệ miễn dịch Theo các nghiên cứu lâm sàng

trong báo cáo khoa học về thuốc “Sự kích thích miễn dịch bởi Bacillus subtilis”

của nhà vi sinh vật học J Harmann, các thành phần của thành tế bào vi khuẩn

B subtilis có thể hoạt hóa gần như tất cả các hệ thống phòng thủ miễn dịch của con người, bao gồm sự hoạt hóa ít nhất 3 kháng thể chuyên biệt (IgM, IgG, IgA) chống lại hiệu quả nhiều virus, nấm, mầm bệnh vi khuẩn gây hại thường xâm nhập và gây nhiễm vào cơ thể người (http://www.upwardquest.com/bacillus-subtilis.html/) Theo một nghiên cứu

của Gong et al (2006), chủng B subtilis PY-1 phân lập từ bó mạch của cây

bông có khả năng kháng mạnh nhiều mầm bệnh nấm trên cây trồng đặc biệt là

nấm Fusarium oxysporum gây ra thiệt hại kinh tế lớn trong nhiều mùa vụ Theo tác giả, các chất kháng sinh tạo ra bởi chủng B subtilis PY-1 ổn định ở các điều

kiện pH trung tính và kiềm, không nhạy với nhiệt độ cao Gần đây các nhà khoa học sử dụng các vi sinh vật này như là một phương pháp bảo vệ sinh học, kiểm soát mầm bệnh và thay thế các thuốc diệt sinh vật (methyl bromide) có nguy cơ gây ra thiệt hại môi trường nghiêm trọng (http://www.upwardquest.com/bacillus-subtilis.html/)

2.5 Các đặc tính sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn

Tổng các phản ứng xảy ra trong tế bào có liên quan đến quá trình trao đổi chất

và các phản ứng hóa học riêng được tạo nên bằng sự xúc tác bởi các phản ứng protein gọi là enzyme Phần lớn các enzyme trong tế bào có chức năng phân cắt các nguyên liệu thức ăn (sự dị hóa) và tổng hợp thành các thành phần của tế bào (sự đồng hóa) Tuy nhiên vi khuẩn không thể thực hiện sự thực bào do thành tế bào cứng Vì thế chúng bài tiết ra các ngoại enzyme có chức năng bên ngoài tế bào để phân cắt các đại phân tử như: protein, tinh bột,… thành các amino acid, monosaccharide,… Sau đó được vận chuyển vào tế bào Điển hình của các ngoại enzyme của vi khuẩn là: protease, amylase, lypase,…

Mục đích đầu tiên của quá trình trao đổi chất là tạo ra năng lượng cần cho sự tổng hợp sinh học và tăng trưởng của tế bào Vi khuẩn có thể đạt được các nhu cầu năng lượng bằng hai phương thức trao đổi chất khác nhau đó là quá trình

Trang 18

hô hấp và quá trình lên men Trong quá trình hô hấp các phân tử hữu cơ được phân hủy một cách hoàn toàn thành carbondioxide (CO2) và nước Ngược lại,

sự lên men là sự phân cắt các phân tử hữu cơ thành các alcohol, aldehyde, acid

và các khí như: CO2, hydrogen Trong quá trình này các phân tử hữu cơ trong con đường trao đổi chất giữ nhiệm vụ như chất nhận electron cuối cùng và trở thành sản phẩm cuối cùng trong con đường lên men Nhiều loài vi khuẩn có khả năng phát triển bằng hai quá trình hô hấp và lên men Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men có thể được sử dụng như một chỉ tiêu để định danh vi khuẩn (Brown, 2005)

Khi vi khuẩn hiếu khí phát triển bằng quá trình hô hấp, chúng tạo ra hydrogen peroxide (H2O2) như một sản phẩm khử O2 thành nước H2O2 có tính phản ứng cao sẽ gây tổn hại đến các enzyme, nucleic acid, các phân tử nhỏ trong tế bào

Để tránh thiệt hại này, các sinh vật hiếu khí tạo ra enzyme catalase chuyển

H2O2 thành O2 vô hại

2H2O2 2H2O + O2↑

Các vi khuẩn kỵ khí bặt buộc thiếu enzyme này vì thế chúng không thể xử lý với H2O2 tạo ra trong môi trường hiếu khí Sự hiện diện của catalase là một cách để phân biệt các vi khuẩn này với vi khuẩn hiếu khí

2.6 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Thế giới khoa học cần có một hệ thống phân loại dựa trên các dấu hiệu có ở các sinh vật sống Trong những năm 1980, nhà khoa học Carl Woese đưa ra một đề nghị mới đó là đi thẳng đến trung tâm của nguồn gốc tính đa dạng Ông đề nghị trình tự deoxyribonucleic acid (ADN) của vài gen thông thường có thể được sử dụng để xác định mối quan hệ của các sinh vật khác nhau Điển hình Woese nhặt một gen mã hóa 1 phân tử RNA tìm thấy trong ribosome (rRNA) Ribosome (phức hợp protein-RNA) tìm thấy trong tất cả prokaryote và eukaryote Mặc dù có sự khác nhau về kích cỡ giữa ribosome của prokaryote và eukaryote, nhưng trình tự của phân tử rRNA thì rất giống nhau (đó là vùng có tính bảo tồn cao) Điều này cho phép các trình tự nucleic được đánh dấu và so sánh Woese chọn 16S rRNA (prokaryote) hoặc 18S rRNA (eukaryote) Phân

tử này đủ lớn để chứa đủ các thông tin cho so sánh di truyền và đủ nhỏ cho gen

để giải trình tự một cách dễ dàng (trích dẫn bởi Salyers and Whitt, 2001)

PCR được Kary Mullis phát minh năm 1985, là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại một đoạn ADN lên đến 106 lần hoặc nhiều

hơn (Marlowe et al., 2005) mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men Theo Marlowe et al (2005), PCR thực chất là một phản ứng

catalase

Trang 19

enzyme đơn giản, sử dụng enzyme ADN-polymerase để sao chép trình tự ADN mong muốn lập lại 25-30 chu kỳ Trong mỗi chu kỳ trình tự ADN được nhân đôi, kết quả lượng ADN tăng theo hàm số mũ Theo giả thiết, 25 chu kỳ tạo ra

sự khuếch đại là 225, nhưng trong thực tế chỉ đạt được tương đương 106 lần lượng ADN ban đầu Theo tác giả đây là do hiệu quả của sự khuếch đại không hoàn hảo

Ngày nay PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như phát hiện các bệnh di truyền; nhận dạng, chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng; tách dòng gen; xác định huyết thống PCR cũng được dùng để phân tích tiến hóa, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ ADN trong và giữa các quần thể Trong thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu cho

việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn (Vibrio) hoặc virus (WSSV, YHV,…), ký

sinh trùng và nấm trên động vật thủy sản (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)

Một chu kỳ thông thường của PCR gồm 3 bước (biến tính ADN, gắn mồi, và

kéo dài ADN) Phần lớn các phản ứng PCR, giai đoạn biến tính được chuẩn

hóa tại nhiệt độ 94oC trong 1,5 phút, vì ở nhiệt độ này đảm bảo sự biến tính

hoàn toàn của các phân tử ADN (Marlowe et al., 2005) Giai đoạn gắn mồi xảy

ra tại nhiệt độ thấp hơn (thông thường khoảng 50-70oC trong 1 phút), mức nhiệt độ ở giai đoạn này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi sử dụng

Bước cuối của PCR là kéo dài mạch ADN, giai đoạn kéo dài thường xảy ra

trong 1 phút tại 72oC Thành phần quan trọng của giai đoạn này là enzyme Taq

polymerase thu từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus Enzyme này phù

hợp với PCR do nó ổn định với nhiệt độ (có thể trên 98oC) và có thể tái sử

dụng cho nhiều chu kỳ (Marlowe et al., 2005)

Trang 20

Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm: Thu mẫu tại các ao nuôi tôm thâm canh ở ấp Tân Tĩnh, xã Vĩnh

Hiệp, huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Khoa Thuỷ Sản, trường Đại Học Cần Thơ

Thời gian: Từ tháng 3 – tháng 7 năm 2008

3.2 Môi trường, hóa chất và thiết bị

Môi trường nuôi: Tripticase soya agar (TSA), Luria-Bertani (LB), Tripticase

Soya Broth (TSB)

Môi trường và hóa chất để xác định các đặc tính sinh lý sinh hóa vi khuẩn:

Môi trường: MR-broth, Nitrate broth, Trypton, Casein, Gelatin, Starch, Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB), Simmon’s citrate agar,…

Hóa chất nhuộm: Crystal violet, iodine, cồn 96%, safranin, malachite green 5% Hóa chất pha thuốc thử: alpha naphthol, KOH, sulphanilic acid, acid acetic, alpha naphthylamine, H2O2 , HgCl2, HCl đậm đặc, phenol red, methyl red

Hóa chất khác: NaCl, K2HPO4, KH2PO4, các loại đường (glucose, arabinose, xylose, sucrose, mannitol), urê,…

Hóa chất trong phương pháp PCR

Hóa chất ly trích ADN : Na3PO4, Tris-HCl (10mM, pH 9), Lysozyme,

CH3COONH4, Chloroform, TE (pH 8, Tris 10 mM, EDTA 1 mM), isopropanol,…

Hóa chất trong phản ứng PCR: nước cất 2 lần, MgCl2 (1,5 mM), buffer

Hóa chất trong điện di: dung dịch TAE 1X, agarose, ethidium bromide

Trang 21

3.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu

3.3.1 Thu mẫu

Mẫu bùn được thu bằng bộ dụng cụ thu mẫu làm bằng ống nhựa PVC (do viện nghiên cứu sức khỏe động vật thủy sản Thái Lan thiết kế) Thu mẫu tại 4 ao, mỗi ao thu 3 điểm (khoảng 100g bùn/điểm) theo đường chéo của ao Thu từ trên bề mặt đáy ao xuống khoảng 10cm Mẫu được cho vào chai có nắp đậy đã tiệt trùng và trữ lạnh ngay ở 4oC Sau đó vận chuyển về phân tích

Nhịp thu mẫu 2 tuần/lần

3.3.2 Phân tích mẫu

Pha loãng 1g bùn ở mỗi vị trí thu mẫu của 1 ao trong 9ml nước muối sinh lý, trộn đều Sau đó hút 3ml dung dịch được pha loãng từ mỗi mẫu (3 mẫu/ao) trộn lại thành 9ml dung dịch mẫu bùn pha loãng của ao thu mẫu Hút 1 ml từ mẫu 9

ml trên cho vào ống 9 ml nước muối sinh lý khác Tiếp tục pha loãng đến hệ số cần thiết (tùy theo độ đục của mẫu phân tích) Pha loãng mẫu tương tự đối với các ao còn lại

Để nhiệt kế vào một ống nghiệm khác có chứa nước (không cần tiệt trùng) Sau

đó xếp tất cả các ống nghiệm vừa pha loãng và ống nghiệm có nhiệt kế vào cùng một giá, để vào nước nóng ở 80ºC Khi nhiệt kế đạt 80ºC tính thời gian đến 10 phút rồi lấy các ống nghiệm ra Sau đó hút 100µl từ mỗi nồng độ pha loãng của mẫu bùn trong mỗi ao cho vào các đĩa môi trường TSA (thêm 1,5% NaCl), dùng que thủy tinh trãi đều Mỗi nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần Ủ ở

30oC trong 24 – 28 giờ

3.4 Phân lập vi khuẩn

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng mọc trên các đĩa môi trường sau khi ủ, cấy sang đĩa môi trường TSA (thêm 1,5% NaCl) ủ ở 30ºC trong 24 giờ Tiếp tục tách ròng cho đến khi thu được dòng thuần Các dòng vi khuẩn phân lập được nuôi tăng sinh trong môi trưuờng TSB (thêm 1,5% NaCl) Sau đó trữ vi khuẩn với glycerol 25% trong các ống cryobead và giữ ở -80oC trước khi phân tích tiếp

3.5 Xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn

Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa để định danh các dòng vi khuẩn phân lập (Bảng

3.1) được chọn theo Andretta et al (2004)

Xác định tính di động, sản sinh catalase, sự khử nitrate, khả năng sử dụng

Trang 22

triển tại các nhiệt độ khác nhau được thực hiện theo Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007) Phương pháp nhuộm Gram, methyl red thực hiện theo Sharmin and Rahman (2007) Nhuộm bào tử, phát triển ở các pH khác nhau theo Brown (2005) Thủy

phân Casein theo Elnasser et al (2007) Cách tiến hành các chỉ tiêu trên được

mô tả chi tiết ở phần phụ lục

Bảng 3.1: Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá để định danh Bacillus subtilis

Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá Kết quả

Gram Hình dạng bào tử

Vị trí bào tử Hình dạng tế bào chứa bào tử

Di động Starch Catalase Citrate Phát triển tại pH 5,7 Phát triển tại pH 6,8 Phát triển trong điều kiện kỵ khí Phát triển ở 2% NaCl

5% NaCl 7% NaCl 10% NaCl Thuỷ phân Gelatin Sản sinh Indole Tạo Nitrite từ Nitrate Tyrosine

Voges-proskauer (VP) Methyl red

Lên men Arabinose Xylose

Glucose Sucrose Mannitol Sinh gas từ Glucose Thuỷ phân Casein Phát triển tại 55ºC 65ºC Lecithinase

Urease