Do thời gian có hạn nên việc định danh các chủng vi khuẩn phân lập được theo phương pháp phân tử chưa thực hiện được. Đề tài này chỉ thực hiện đến việc xác định lại chính xác dòng chuẩn bằng phương pháp PCR và được dùng làm
đối chứng dương cho các phản ứng PCR của các chủng vi khuẩn phân lập
được.
Hình 4.14: Kết quả chạy điện di ADN dòng chuẩn Bacillus subtilis S19
Qua hình 4.14, M là thang ADN 100 bp, giếng 1 và 2 là mẫu ADN của dòng chuẩn được lập lại 2 lần, giếng 3 là đối chứng âm.
Ở giếng 3 không hiện vạch sáng chứng tỏ phản ứng PCR không bị tạp nhiễm. Hai vạch sáng từ giếng 1 và 2 hiện tương ứng với vạch 1.500 bp nên phản ứng PCR thực hiện đúng.
1 2 3 M
1517 bp 1500 bp
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1 Kết kuận
Phân lập được 39 chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus. Qua kết quả xác định
đặc tính sinh hóa loại trừ còn 8 chủng vi khuẩn thoả các chỉ tiêu định danh cho
Bacillus subtilis. Bao gồm các chủng: IV-A4-37-S, IV-A2-35-S, II-A2-6-S, III- A4-30-S, II-A4-12-S, III-A4-29-S, III-A3-23-S, IV-A4-38-S. Tuy nhiên chưa thể kết luận chính xác 8 chủng trên là B. subtilis do còn vài chỉ tiêu sinh hóa chưa xác định (Phát triển trong điều kiện kỵ khí, sinh gas từ Glucose, Citrate, Tyrosine, Lecithinase).
Kết quả PCR đã khẳng định chính xác dòng chuẩn Bacillus subtilis S19 và sẽ được dùng làm đối chứng dương để nhận định sản phẩm PCR cho việc định danh tiếp 8 chủng phân lập theo phương pháp phân tử.
5.2 Đề xuất
Tiếp tục định danh các chủng vi khuẩn phân lập theo phương pháp PCR
Nghiên cứu khả năng phân huỷ các chất hữu cơ và khả năng diệt khuẩn của
Bacillus subtilis phân lập từ ao nuôi tôm.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Andretta, C.W.S., R.M. Rosa, E.C. Tondo, C.C. Gaylarde and J.A.P. Henriques. 2004. Identification and molecular characterization of a
Bacillus subtilis IS13 strain involved in the biodegradation of 4,5,6- trichloroguaiacol. Chemosphere 55 (2004) 631-639.
2. Austin, B., L.F. Stuckey, P.A.W. Robertson, J. Effendi and D.R.W. Griffith. 1995. A probiotic reducing disease caused by Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum and Vibrio ordalii. Journal of Fish Diseases 18, 93-96.
3. Banwart, G.J. 2000. Basic food microbiology. Department of Microbiology. The Ohio State University.
4. Boon, N., J. Goris, P.D. Vos, W. Vertraete and E.M. Top. 2000. Bioaugmentation of activated sludge by an indegenous 3-chloroaniline- degrading Comamnas testosteroni strain, I2gfp. Appl. Environ. Icrobiol. 66: 2906-2913.
5. Brown, A.E. 2005. Benson’s Microbiological Applications. Ninth edition. 6. Collins, C.H., P.M .Lyne and J.M. Grange. 1986. Microbiological
Methods. Sixth edition.
7. Driks, A. 1999. Bacillus subtilis spore coat. Microbiology and Molercular biology reviews, p.1-20, vol.63, No.1.
8. Đặng Thị Hoàng Oanh. 2007. Giáo trình Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản. Khoa Thủy Sản-Trường Đại Học Cần Thơ.
9. Đặng Thị Hoàng Oanh. 2007. Xác định các chỉ tiêu hình thái sinh lý và sinh hóa vi khuẩn. Trong: Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn Bệnh Học Thủy Sản. Bộ môn sinh học và bệnh thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10. Elnasser, Z., A. Maraqa, W. Owais, A. Khraisat. 2007. Isolation and characterization of new Thermophilic bacteria in Jordan. The internet journal of microbiology. Vol 3. Number 2.
11. Fuller, R. 1987. A review, probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology 66, 365-378.
12. Gatesoupe, F.J. 1991. Siderophore production and probiotic effect of
Vibrio sp. Associated with turbot larvae, Scophthalmus maximus. Aquatic Living Resources 10, 239-246.
13. Gong, M., J.D. Wang, J. Zhang, H. Yang, X.F. Lu, Y. Pei and J.Q. Cheng. 2006. Study of the antifungal ability of Bacillus subtilis strain PY-1 in
Vitro and identification of its antifungal substance (Iturin A). Acta Biochim Biophys Sin 38: 233-240.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 15. Hastings, J.W. and K.H. Nealson. 1981. The symbiotic luminous bacteria.
In: The Prokaryotes II. Springer- Verlag, Newyork, 1960 pp.
16. Huys, G. 2003. Sampling and sample processing procedures for the isolation of aquaculture assosiated bacteria.
17. Irianto, A., and B. Austin. 2002. Probiotics in aquaculture. 633-642.
18. Marlowe, E.M., K.L. Josephson and I.L. Pepper. 2005. Nucleic acid-based methods of analysis. 287-315.
19. Mirel, D.B., W.F. Estacio, M. Mathieu, E. Olmsted, J. Ramirez, and L.M. Marquez-Magana. 2000. Environmental Regulation of Bacillus subtilis σD
–Dependent gene expression. Journal of Bacteriology, June 2000, p.3055- 3062. Vol.182, No.11.
20. Moriarty, D.J.W. 1998. Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds. Aquaculture 164 : 351 – 258.
21. Moriarty, D.J.W. 1997. The role of microorganism in aquaculture ponds. Aquaculture 151, 333-349.
22. Moriarty, D.J.W. 1999. Disease control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria.
23. Nguyễn Lân Dũng. 1983. Thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội.
24. Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan. 2005. Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản giáo dục.
25. Nguyễn Khắc Thái Sơn. 2007. Một vài suy nghĩ về công nghệ vi sinh vật và ứng dụng của nó. Khoa Tài Nguyên và Môi Trường.
26. Olmos, S.J. and J.L.S. Ochoa. 2005. The functional property of Bacillus
for shrimp feeds. Food Micrology 23, 519-525.
27. Phạm Thị Tuyết Ngân. 2006. Giáo trình vi sinh học ứng dụng trong thủy sản. Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ.
28. Rengpipat, S., W.Phianphak, S. Piyatirativivorakul and P. Menasveta. 1998. Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth . Aquaculture 167, 301-313.
29. Robertson, P.A.W., C. O’Dowd, C. Burrells, P. Williams and B. Austin. 2000. Use of Carnobacterium sp. as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Aquaculture 185, 235-243.
30. Rosenthal, H. 1980. Ozonation and sterilization. In: Symposium on New Developmants in Utilization of Heated Effluents and of Recirculation Systems for intensive Aquaculture. FAO EIFAC /80/ Symp: R/8/ May 1980. European Inland Fisheries Advance Committee, Norway, 75 pp. 31. Salminen S., A. Ouwehand, Y. Benno and Y.K. Lee. 1999. Probiotics:
how should they be defined? Trends in Food Science Technology 10, 107- 110.
32. Salyers, A.A. and D.D. Whitt. 2001. Microbiology- Diversity, Disease, and the environment.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 34. Vaseeharan, B. and P. Ramasamy. 2002. Control of pathogenic Vibrio
spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatmant for black tiger shrimp Peaneus monodon. Appplied Microbiology 36, 83-87.
35. Vaseeharan, B., J. Lin and P.Ramasamy. 2004. Effect of probiotics, antibiotic sentivity, pathogenicity and plasmid profiles of Listonella anguillarum- like bacteria isolatedfrom Penaeus monodon culture systems. Aquaculture 241 (2004), 77-91. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
36. http://www.nea.gov.vn/tapchi/toanvan/11-2k6.08.htm/ 37. http://www.upwardquest.com/bacillus-subtilis.html/ 38. http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin 39. http://www.textbookofbacteriology.net/Bacillus.html/
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
PHỤ LỤC
A. Các bước thực hiện các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá 1 Tính di động
Sự di động của vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt treo. Các bước:
- Cho vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lam trên bàn.
- Dung que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle.
- Lấy một ít vi khuẩn cho lên lam hòa vào nước muối sinh lý
- Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn.
- Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle.
- Đặt lame trên kính hiển vi quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X
2. Nhuộm Gram vi khuẩn
Cố định vi khuẩn trên lam: Nhỏ một giọt nước cất lên lam, dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước cất. Để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hơ lướt lam trên ngọn lửa đèn cồn hai hoặc ba lần.
Nhuộm với dung dịch Crystal violet trong 30 giây, rửa lam dưới vòi nước nhẹ. Sau đó nhỏ dung dịch Iodine lên lam để trong 1 phút rồi rửa với 95% alcohol trong 10 giây, để ráo và rửa dưới vòi nước nhẹ. Nhuộm tiếp với dung dịch Safranin trong một phút. Rửa dưới vòi nước, để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi ở vật kính 100X.
3. Nhuộm bào tử
Cố định vi khuẩn (khuẩn lạc được ủ trên 36 giờ) trên lam (giống phương pháp nhuộm Gram). Nhỏ dung dịch malachite green 5% lên vi khuẩn được cố định trên lam, đặt lam lên cốc thủy tinh 25 ml chứa nước đang đun sôi trên bếp
điện, để trong 5 phút. Sau đó rửa sạch bằng nước., để ráo ở nhiệt độ phòng. Nhuộm tiếp với dung dịch safranin trong 45 giây. Sau đó rửa sạch bằng nước và để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X. Bào tử bắt màu xanh và thành tế bào bắt màu hồng.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn để lên lam, sau đó nhỏ lên vi khuẩn một giọt dung dịch H2O2 3%. Vi khuẩn cho phản ứng catalase dương sẽ gây hiện tượng sủi bọt.
5. Phản ừng Voges – Proskauer (VP)
Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3 ml môi trường MR – VP broth + 1,5% NaCl đã thanh trùng, ủ ở 30oC. Sau 48 giờ nhỏ 0,6ml thuốc thử A (5g alpha naphthol trong 100 ml ethylalcohol) và 0,2ml thuốc thử B (40g KOH trong 100ml nước cất) vào ống nghiệm. Lắc đều và để nghiêng ống nghiệm khoảng 30 phút. Sự chuyển màu hồng của môi trường sẽ cho phản ứng dương và ngược lại.
6. Phản ừng tạo Nitrite từ Nitrate
Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3 ml môi trường Nitrare broth +1,5% NaCl
đã thanh trùng. Ủ ở 30oC, sau 24 giờ nhỏ 1ml thuốc thử A (0,8% sulphanilic acid trong 5N acid acetic) và thêm 1ml thuốc thử B (0,5% alpha naphthylamine trong 5N acid acetic) vào ống nghiệm. Sự xuất hiện màu đỏ trong vòng 1 – 2 phút cho phản ứng dương và ngược lại.
7. Khả năng thủy phân Starch
Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường bao gồm nutrient agar + 0,5% Starch + 1,5% NaCl đã thanh trùng. Ủ ở 30oC, sau 24h nhỏ thuốc thử Lugol’s iodine lên bề
mặt agar. Nếu xuất hiện một vòng rõ xung quanh chỗ có chứa vi khuẩn phát triển trong 30 phút cho phản ứng dương và ngược lại.
8. Khả năng thủy phân Gelatin
Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường (chứa nutrient agar + 1% gelatin + 1,5% NaCl) đã thanh trùng. Ủở 30oC. Sau 24 giờ nhỏ thuốc thử HgCl2 (12g HgCl2, 80ml nước cất, 16ml HCl đậm đặc) lên bề mặt agar. Nếu xuất hiện một vòng rõ xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển thì cho phản ứng dương và ngược lại.
9. Khả năng thủy phân Casein (skimmed milk)
Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường skimmed milk agar (chứa 1% casein, 0,2% yeast extract, 0,01% KH2PO4, 0,03% K2HPO4, 0,5 NaCl và 2% agar – pH 6,5) và ủở 55oC trong 72h. Nếu xuất hiện một vòng rõ xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển cho thấy có sự thủy phân casein. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Kovac’s vào, vi khuẩn sinh indole sẽ cho phản ứng dương với một vòng màu từ
hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của môi trường và ngược lại.
11. Khả năng sử dụng Citrate
Môi trường Simmon’s Citrate agar + 1,5% NaCl đun sôi và khuấy cho tan, sau
đó cho 3ml môi trường vào ống nghiệm, sau khi thanh trùng để nghiêng ống nghiệm tạo thành mặt phẳng nghiêng và để nguội. Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng của môi trường. Ủ ở 30oC, sau 2 – 7 ngày vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ sẽ cho phản ứng dương và ngược lại.
12. Khả năng phát triển của vi khuẩn ở các nồng độ muối: 2%, 5%, 7%, 10%
Môi trường 1% Tryptone. Thêm NaCl ứng với các nồng độ 2, 5, 7, 10% NaCl. Cho 3ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Thanh trùng ở 121ºC trong 15 phút. Cấy một ít vi khuẩn vào trong các ống nghiệm và ủ ở 30ºC. Sau 2-4 ngày, môi trường đục cho kết quả dương tính và ngược lại.
13. Khả năng phát triển của vi khuẩn ở các nhiệt độ: 50oC, 65oC
Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa môi trường TSB + 1,5% NaCl. Ủở các nhiệt độ 55ºC và 65ºC. Sau 2-4 ngày, môi trường đục cho kết quả dương tính và ngược lại.
14. Khả năng sử dụng carbohydrate (glucose, arabinose, xylose, sucrose, mannitol)
- Môi trường TSB + 1,5% NaCl
- 0,4% Bromothymol blue (1,6%)
- 1% đường (Glucose, Arabinose, Xylose, Sucrose, Mannitol)
- Chỉnh pH 6,8
- Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm.
- Thanh trùng ở 121ºC trong 15 phút.
- Cấy vi khuẩn vào các môi trường đường tương ứng. Ủở 30ºC.
- Sau 2-7 ngày nếu môi trường chuyển sang màu vàng cho kết quả dương tính và ngược lại.
15. Methyl Red
Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường MR-broth + 1,5% NaCl Sau 24-48 giờ nhỏ 2 giọt thuốc thử methyl red (0,04g methyl red + 40ml
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
16. Khả năng sử dụng urê
- Dung dịch 0,1% pepton +1% NaCl + 0,2% KH2PO4 + 0,0012% Phenol red + 1% glucose
- Thêm 2% urê cho phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có urê.
- Cho 3ml môi trườg vào ống nghiệm.
- Thanh trùng ở 121ºC trong 15 phút.
- Cấy 1 ít vi khuẩn vào trong 2 ống nghiệm. Ủở 30ºC.
- Sau 2 ngày nếu môi trường chuyển màu hồng cho kết quả dương tính và ngược lại.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
B. Kết quả test sinh hóa 39 chủng vi khuẩn phân lập (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chỉ tiêu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Gram + + + + + + + + + + + + + + + Di động + + + + + + + + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + + + + + + + + VP + + - - + + - + + - + + - + - Methyl red + - - - - + + + + - - + - + + Casein + - - - - + + + + - + + - + + Gelatin + - - - - + + + + - + + - +. + Starch + - - - - + + + + - - + - - - Urê - - - - - - - - - Khử Nitrate + + + + + - + - - 2% NaCl + + + + + + + + + 5% NaCl + + + + + + + + + 7% NaCl - + - - - - + - - 10% NaCl - + - - - - + - - 55ºC - + - - - - + + - 65ºC - + - - - - + - - pH 5,7 - + - - - - + - - pH 6,8 + + + + + + + + + Glucose + + + + + - + + + Arabinose + + + + + - + + + Xylose + + - - - - + - + Sucrose - - - - - - - - - Mannitol - + + + + - + - + Sinh indole - - - - - - - - -
Ghi chú: (+) phản ứng dương tính, (-) âm tính
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Chỉ tiêu 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Gram + + + + + + + + + + + + + + + Di động + + + + + + + + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + + + + + + + + VP + + + + + - - + - - - - + + + Methyl red - - - - + + + + + + + - + + + Casein + + + + + + + + + + + + + + + Gelatin + + + + + + + + + + + + + + + Starch - - + - - - - + + + - + + + + Urê - - - - - - - - - - - - - - - Khử Nitrate + + + + + + + + + + + + + + + 2% NaCl + + + + + + + + + + + + + + + 5% NaCl + + + + + + + + + + + + + + + 7% NaCl - - + - - - - + + + - + + + + 10% NaCl - - - - - - - + - - - - - + + 55ºC + - - - - - - + + - - - - + + 65ºC - - - - - - - + - - - - - + + pH 5,7 - - - - - - - + - - - - - + + pH 6,8 + + + + + + + + + + + + + + + Glucose + + + + + + + + + + + + + + + Arabinose + + + + + + + + + + + + + + + Xylose + + + + + + + + + + + + + + + Sucrose - - - - - - - - - - - - - - - Mannitol - - - - - - - + + + + + + + + Sinh indole - - - - - - - - - - - - - - -
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Chỉ tiêu 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Gram + + + + + + + + + Di động + + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + + VP - - - + + - + + - Methyl red - - - - + - + + - Casein - - - + + + + + + Gelatin - - - + + + + + + Starch - - - + + + + + - Urê - - - - Khử Nitrate + + + + + + 2% NaCl + + + + + + 5% NaCl + + + + + + 7% NaCl + + + + + - 10% NaCl - + - + + - 55ºC + + + + + + 65ºC - - - + + - pH 5,7 - + - + + - pH 6,8 + + + + + + Glucose + + + + + + Arabinose + + + + + + Xylose - + - + + - Sucrose - - - - Mannitol + + + + + + Sinh indole - - - -