khảo sát sự biến động mật độ vi khuẩn bacillus subtilis trong bể nuôi tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠKHOA THỦY SẢN LÂM TRUNG TÍNH KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG BỂ NUÔI TÔM SÚ PENAEUS MONODON LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH B

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

LÂM TRUNG TÍNH

KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN

BACILLUS SUBTILIS TRONG BỂ NUÔI TÔM SÚ

(PENAEUS MONODON)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN

2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

LÂM TRUNG TÍNH

KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN

BACILLUS SUBTILIS TRONG BỂ NUÔI TÔM SÚ

(PENAEUS MONODON)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

2009

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thuỷ Sản,Quý Thầy Cô và toàn thể cán bộ Khoa Thuỷ Sản đã tận tình giúp đỡ, tạo điềukiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập Đặc biệt tôi sinh chânthành biết ơn cô Phạm Thị Tuyết Ngân và chị Liễu Như Ý cùng các cán bộ bộmôn Thuỷ Sinh Học Ứng Dụng, các bạn lớp Bệnh Học Thuỷ Sản K 31 đã tậntình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ để tôi hoàn thành luân văn

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, đặc biệt là cha mẹ

đã dành cho tôi những tình cảm, sự động viên cũng như hỗ trợ về vật chất đểtôi vượt qua khó khăn trong suốt quá trình học

Chân thành cảm tạ Sinh viên thực hiện Lâm Trung Tính

TÓM TẮT

Đánh giá khả năng làm sạch môi trường nước của nhóm vi khuẩn chọn lọc, được phânlập từ những ao nuôi tôm sú thâm canh đã được thực hiện, là một trong những bước

quan trọng trong qui trình chọn lọc vi khuẩn hữu ích Bacillus subtilis từ lâu đã được

chứng minh là vi khuẩn tham gia trong quá trình phân hủy protein trong nuôi trồngthủy sản

Thí nghiệm được bố trí gồm có 4 nghiệm thức, trong đó 3 nghiệm thức bổ sung vi

khuẩn Bacillus subtilis chủng 9, 41, 67 và một nghiệm thức đối chứng Mỗi nghiệm

thức được lập lại 3 lần Kết quả cho thấy thời gian tồn tại trong bể tôm của vi khuẩndòng 9 là 7 ngày, dòng 41 và 67 là 5 ngày Mật độ bào tử trong bùn của 3 chủng 9, 41

và 67 lần lượt là 5,3×106, 5,95×105 và 3,5×105 bào tử/g Trong khi đối chứng chỉkhoảng 22 bào tử/g cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thứccòn lại (p< 0.05) Trong nước mật độ chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 3×103, 4,9×102và2,9×102bào tử/ml, còn đối chứng chỉ 10 bào tử/ml cho thấy sự khác biệt có ý nghĩathống kê so với các nghiệm thức còn lại (p< 0.05) Mật độ tổng vi khuẩn trung bìnhtrong bùn chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 5,2 x 107, 6,7x 106, 6,7 x 106 CFU/g, còn đốichứng 3,8 x 108 CFU/g Trong nước chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 3,7 x 105, 4,3x 105,

57 x ,105 CFU/ml, còn đối chứng 5 x 107 CFU/ml, có số lượng tăng cao khác biệt có ý

nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p< 0.05) Mật độ vi khuẩn Vibrio

trong bùn, chủng 9, 41 và 67 lần lượt là 7,6 x 101, 2,1x 102 và 3,7 x 102 CFU/g, thấphơn nhiều so với đối chứng (5,8 x 104 CFU/g) Trong nước mật độ chủng 9, 41,và 67lần lượt là 4,1 x 101, 1,9x 102 và 3,5 x 102 CFU/ml, đối chứng 6,4 x 104 CFU/ml có sốlượng tăng cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p<0.05) Tỉ lệ tăng trưởng đạt cao nhất ở nghiệm thức 1 (chủng 9) tăng 10,7g/con và saikhác có rất có ý nghĩa thống kê (p<0,01) so với nghiệm thức đối chứng tăng 5,3g/con

và khác biệt rất có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức bổ sung vi khuẩn dòng 41 vàdòng 67 (p< 0.01) Tỷ lệ sống ở nghiệm thức 1 (chủng 9) cao nhất 97,2% và sai khácrất có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (p<0,01) Trong khi đó tỉ lệ sống giữacác nghiệm thức bổ sung vi khuẩn sai khác không có ý nghỉa thống kê Các chỉ tiêu

sinh hóa cơ bản đều thỏa mản điều kiện của Andretta et at., (2004).

Qua thí nghiệm nhận thấy chủng 9 là chủng có nhiều ưu thế nhất về thời gian tồn

tại, làm tăng tỷ lệ sống, tỷ lệ tăng trưởng và làm giảm mật độ vi khuẩn Vibrio

trong bể nuôi tôm

ii

MỤC LỤC

PHẦN I: GIỚI THIỆU 1

2.1 Đặc điểm sinh học của tôm sú (Penaeus monodon) 3

2.1.1 Vị trí phân loại: 3

Theo hệ thống phân loại của Holthuis, 1989 Tôm sú 3

2.1.2 Phân bố 3

2.1.3 Vòng đời 3

2.1.4 Tập tính ăn và loại thức ăn 4

2.1.5 Lột xác 4

2.2 Sự siến động các yếu tố thuỷ lý trong ao nuôi thuỷ sản 4

2.2.1 Nhiệt độ 4

2.2.2 pH 4

2.2.3 Độ mặn 5

2.2.4 Oxy hoà tan (DO) 5

2.3 Sử dụng chế phẩm sinh học (Probiotic) trong nuôi trồng thủy sản 5

2.3.1 Sơ lược về probiotic 5

3.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản 6

2.4 Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 7

2.4.1 Vị trí phân loại 7

2.4.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis 7

2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis 8

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .10

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 10

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 10

3.2 Phương pháp nghiên cứu 10

3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị: 10

3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 10

3.2.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu nước 12

3.2.4 Phương pháp thu mẫu bùn 14

3.2.4.1 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 14

3.2.5 Xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn Bacillus subtilis 15

3.2.6 Phương pháp xác định sự biến động các yếu tố thuỷ lý .15

3.2.7 Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm 15

3.2.8 Tính tốc độ tăng trưởng của tôm 16

3.2.9 Tính tỉ lệ sống của tôm 16

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

4.1 Sự biến động các chỉ tiêu thủy lí 17

4.1.1 ảnh hưởng của pH 17

4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 17

4.1.3 Ảnh hưởng của độ kiềm 17

4.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (DO) 17

4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis phân

lập .18

4.4 Biến động mật độ Vi khuẩn Bacillus subtilis trong bể nuôi tôm Sú 23

4.5 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong bể nuôi tôm Sú .24

4.6 Biến động mật độ tổng vi khuẩn Vibrio trong bể nuôi tôm Sú 26

4.7 Tỉ lệ sống 27

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 31

4.1 Kết luận .31

4.2 Đề xuất 31

PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1 Các bước pha loãng mẫu……… 13

Hình 3.2 Cách cấy mẫu vào môi trường thạch………… 13

Hình 4.1 Khuẩn lạc sau 24 giờ……… 19

Hình 4.2 Nhuộm Gram……… 19

Hình 4.3 Nhuộm bào tử……… 20

Hình 4.4 Phản ứng Starch……… 20

Hình 4.5 Phản ứng Gelatin……… 21

Hình 4.6 Phản ứng Thủy phân Casein……… 21

Hình 4.7 Thời gian tồn tại của vi khuẩn Bacillus subtiilis trong bùn… 22

Hình 4.8 Thời gian tồn tại của vi khuẩn Bacillus subtiilis trong nước… 22

Hình 4.9 Biến động mật độ Bacillus subtiilis trong bùn…… 23

Hình 4.10 Biến động mật độ Bacillus subtiilis trong nước……… 23

Hình 4.11 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong bùn……… 25

Hình 4.12 Biến động mật độ tổng vi khuẩn trong nước……… 25

Hình 4.13 Biến động mật độ Vibrio trong bùn……… 27

Hình 4.14 Biến động mật độ Vibrio trong nước……… 27

Hình 4.15 Tỉ lệ sống của tôm sú……… 28

Hình 4.16 Tỉ lệ tăng trưởng của tôm sú……… 29

Hình 4.17 Tôm sú sau khi thu hoạch……… 30

v

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1 Tỉ lệ sống của tôm sú……… 23Bảng 4.2 Tỉ lệ tăng trưởng của tôm sú……… 24

Bảng 4.3 Các chỉ tiêu sinh hóa để nhận dạng Bacillus subtilis ……… 27

PHẦN I: GIỚI THIỆU

Trong khoảng 10 năm gần đây nghề nuôi tôm ở Vịêt Nam đang phát triển mạnh mẽ.Tính đến tháng 6/2005 diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 542.900 ha, tăng 11.2% so vớicùng kỳ năm 2004, sản lượng nuôi đạt 562.800 tấn, trong đó Đồng Bằng Sông CửuLong chiếm 67.1% (Bộ Thuỷ Sản, 2006)

Chính lợi nhuận từ việc nuôi thuỷ sản quá cao mà người dân không ngừng mở rộngdiện tích nuôi, tăng mật độ nuôi và mùa vụ thả nuôi Từ đó, dẫn đến tình trạng ô nhiễmmôi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thuỷ sản do phần lớn các vậtchất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và chất thải khác đọng lại dưới đáy ao nuôi Ngoài

ra, còn các hoá chất, kháng sinh sử dụng trong quá trình nuôi tích luỹ không được xử lý

Do đó, vấn đề cần thiết nhất hiện nay là quản lý tốt môi trường ao nuôi nhằm hạn chếtình trạng bệnh trên các đối tượng thuỷ sản, giúp nuôi trồng thuỷ sản phát triển bềnvững và bảo vệ môi truờng Xu hướng hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nóiriêng để giải quyết vấn đề trên là sử dụng các vi sinh vật hữu ích được phân lập từ bùnđáy và nước ao nuôi Các sản phẩm vi sinh vật hữu ích này gọi là chế phẩm sinh học(Probiotic)

Trong nuôi tôm thâm canh cao sản, hai yếu tố quan trọng quyết định năng suất là tômgiống sạch bệnh và môi trường ao nuôi Hiện nay, tình hình trên đang đặt ra cho cácnhà khoa học nhiều vấn đề cần giải quyết đặc biệt là phương pháp xử lý bùn đáy trongnhững ao, đầm nuôi tôm việc làm sạch và duy trì ao nuôi sạch vẫn còn nhiều bất cậpkhiến cho những người nuôi tôm gặp rất nhiều rủi ro nuôi tôm mật độ cao Tình trạngnhiễm bẩn nặng của ao nuôi tôm mặc dù đã được khắc phục bằng giải pháp thay nướcsạch thường xuyên hay nước đã được xử lý, song phần bùn ao - nơi các chất thải tích tụtrong quá trình nuôi là môi trường lý tưởng cho các vi khuẩn và ký sinh trùng gây bệnhphát triển Mỗi năm, lượng bùn tích tụ ở đáy ao nuôi tôm thâm canh hình thành một lớpbùn dày 10-15 cm, tương đương 30-50 tấn chất khô giàu hữu cơ/ha Bùn có thành phầnchủ yếu là chất hữu cơ, bao gồm sinh khối vi sinh vật và xác động, thực vật thủy sinh.Khi phân hủy tự nhiên sẽ làm cạn kiệt lượng oxy hòa tan và sinh ra các chất độc hại đốivới tôm như NH3, H2S, CH4 (trích dẫn Nguyễn Thị Chính, 2006)

Trước tình hình trên, xu hướng chung của thế giới là “phòng bệnh hơn chữa bệnh”.Hiện nay, nhiều mô hình nuôi tôm bền vững được đề xuất và áp dụng như nuôi tômthân thiện với môi trường, nuôi tôm an toàn sinh học…

Gần đây các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu việc sử dụng các vi sinh vật hữuích để tạo các chế phẩm sinh học Một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều

nhất là nhóm Bacillus, hầu hết các loài thuộc giống Bacillus không độc hại cho người

và động vật thủy sản (trích dẫn bởi Olmos, 2005)

Hiện nay, ở nước ta người dân nuôi thủy sản sử dụng chế phẩm sinh học rất phổ biến đểcải thiện chất lượng nước Nhưng chưa có nghiên cứu nào đánh giá xem các chủng visinh vật hữu ích khi đưa vào môi trường nước có tồn tại và phát triển hay không từ vấn

đề trên đề tài "Khảo sát Sự biến động mật độ của vi khuẩn Bacillus subtilis trong

bể nuôi tôm sú (Penaueus monodon)” được thực hiện với mục tiêu và nội dung sau.

Mục tiêu

Xác định thời gian cần thiết để bổ sung vi khuẩn hữu ích Bacillus subtilis vào bể nuôi

tôm sú

Xác định mật độ và sự biến động của Bacillus subtilis trong một chu kỳ nuôi Phân lập

và xác định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn chiếm ưu thế trong bể nuôi tôm sú.Nhằm khẳng định lại dòng ưu thế là dòng đã bổ sung

Nội dung

Theo dõi và xác định thời gian bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis và theo dõi biến động mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi bổ sung vào bể nuôi.

Xác định sự biến động của tổng vi khuẩn, tổng Vibrio trong bể nuôi tôm sú trên môi

trường Nutrient Agar (NA) và Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar (TCBS)

Xác định sự biến động của vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường chuyên biệt đồng

thời định danh lại các dòng vượt trội này bằng một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của vikhuẩn

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học của tôm sú (Penaeus monodon)

xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn

2.1.4 Tập tính ăn và loại thức ăn

Tôm sú thích ăn động vật sống hơn xác thối rửa hay mảnh vụn hữu cơ Tôm bắt mồinhiều hơn khi thuỷ triều rút Nuôi tôm sú trong ao hoạt động bắt mồi nhiều vào sángsớm và chiều tối Trong tự nhiên tôm chịu được sự biến động về độ mặn rất lớn (3-45‰), độ mặn tối ưu là 15-25‰ Ở nhiệt độ 28ºC tôm sú lớn tương đối chậm, ở nhiệt

độ 30ºC tôm lớn nhanh hơn nhưng dễ mắc bệnh Nhiệt độ tối ưu cho tôm sú phát triển ởvùng ao hồ nhiệt đới là 28-30ºC

2.1.5 Lột xác

Theo Phạm Văn Tình (2000) Trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kíchthước tăng lên mức độ nhất định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ củ để lớn lên Sự lột xácthường xảy ra vào ban đêm, sự lột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trườnghợp lột xác mà không tăng thể trọng Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xácxảy ra như sau

Lớp biểu bì giữa khớp đầu ngực và phần bụng nứt ra, các phần phụ của đầu ngực rút ratrước, theo sau là phần bụng và phần phụ phía sau, rút ra khỏi lớp vỏ cứng, với động tácuốn cong mình toàn cơ thể Lớp vỏ mới mềm sẽ cứng lại sau 1-2 giờ đối với tôm nhỏ,1-2 ngày đối với tôm lớn Tôm sau khi mới lột xác, vỏ còn mềm nên rất nhạy cảm vớimôi trường sống thay đổi đột ngột Trong quá trình nuôi tôm, thông qua hiện tượng này,

có thể điều chỉnh môi trường nuôi kịp thời (Phạm Văn Tình, 2004)

2.2 Sự siến động các yếu tố thuỷ lý trong ao nuôi thuỷ sản.

2.2.1 Nhiệt độ

Trong các ao nuôi nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợpcác chất hữu cơ cho cơ thể sinh vật, cũng như vai trò phân huỷ của vi sinh vật và trao

đổi chất của tôm nuôi Theo Whetstone et al., (2002) tôm có thể sống tốt ở nhiệt độ

23-340C tối ưu là 26 - 290C nhưng không thay đổi quá 50C trong ngày (Boyd et al., 2003).

2.2.2 pH

Theo Chanratchakool et al., (1995) thì pH của nước rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp

hoặc gián tiếp đến tôm nuôi pH thích hợp cho tôm nuôi 7.50 - 8.35 và khoảng daođộng hằng ngày không vượt quá 0.5 đơn vị pH Theo Phạm Văn Tình (1994) thì pHtrong ao nuôi thương thấp vào buổi sáng và cao vào buổi chiều, pH của nước trong aotốt nhất là 7.50 - 8.50 là thích hợp cho ao nuôi tôm sú

2.2.3 Độ mặn

Tôm sú là đối tương nuôi rộng muối, chúng có thể sống ở những nơi có độ mặn từ

3-45‰ Wannina Yake et al., (2001) cho rằng độ mặn tối ưu cho sinh trưởng và phát triển

của tôm sú là 15-20‰

2.2.4 Oxy hoà tan (DO)

Oxy hoà tan lý tưởng cho tôm sú là trên 5ppm (Swingle, 1969 được trích bởi Lê Bảo

Ngọc., 2005) và không vượt quá 15ppm (Whetstone et al.,2002) theo nghiên cứu của

Summerfelt (1996) thì hàm lượng oxy hoà tan trong nước chịu sự chi phối của nhịêt độ,nhịêt độ càng tăng thì oxy hoà tan trong nước càng giảm Hàm lượng DO ở mức thích

hợp cho sự sinh trưởng tối ưu cho tôm là 5-6ppm (Boyd et al., 2003).

2.3 Sử dụng chế phẩm sinh học (Probiotic) trong nuôi trồng thủy sản

2.3.1 Sơ lược về probiotic

“Probiotic là hổn hợp bổ sung mang bản chất của các vi sinh vật sống tác động có lợiđối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ hoặc sống tự do trong môitrường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng củathức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầmbệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi trường sống” (Phạm Thị TuyếtNgân, 2007)

Probiotic bao gồm những vi khuẩn có lợi (vi sinh vật hữu ích) và trong thủy sản hầu

hết những sinh vật này là vi khuẩn lactic acid (Lactobacillus plantarum, L.

acidophillus, L casei, L rhamnosus, L bulgaricus, Carnobacterium…), giống Vibrio

(Vibrio alginolyticus), giống Bacillus (B subtilis, B licheniformis, B megaterium, B.

polymyxa,…), Actinomycetes, Nitrobacteria…được áp dụng trong các bể ương nuôi,

trong ao để hạn chế sự nhiễm bệnh đối với các vi khuẩn gây bệnh (Xiang-Hong et al., 1998; Lê Đình Duẩn và ctv, 2007) Cũng theo nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv

(2007) một số thành phần khác cũng được tìm thấy trong probiotic là tập hợp cácenzyme có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase, chitinase,một số vitamin thiết yếu và chất khoáng Ngoài ra, trong các chế phẩm sinh học giúp

xử lý nước và nền đáy ao thường bổ sung thêm các chủng nấm sợi và xạ khuẩn (thuộc

(Scophthalmus maximus) trong ao nuôi có thể kìm hãm vi khuẩn V anguillarum gây bệnh (Olsson et al., 1992), điều này chứng tỏ nhóm vi khuẩn có lợi đã cạnh tranh có

hiệu quả với nhóm vi khuẩn gây bệnh (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007)

Nghiên cứu của Xiang-Hong et al., (1998) cũng cho biết một số vi khuẩn hữu ích có

thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của tảo Tác giả còn cho biết thêm những vikhuẩn có lợi trong nước sẽ loại trừ nhanh NH3, H2S, vật chất hữu cơ có hại Ngoài ra,chúng còn có thể cân bằng pH trong ao nuôi

Cải thiện chất lượng nước là một trong những vai trò quan trọng của vi sinh vật hữuích trong nuôi trồng thủy sản Vì thế, Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố vi

khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến chất lượng nước, do vi

khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2 Vì vậy,

Bacillus sp giúp giảm tích lủy chất hữu cơ và các chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị

Tuyết Ngân, 2007)

3.2.2 Tình hình sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản

Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất khángsinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây bệnhcủa một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là biện pháp tăng hiệu quả sản

xuất có ý nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong et al., 1998).

Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế

phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăngkhả năng phân giải các chất hữu cơ, làm sạch, và ổn định môi trường nước mà còntăng năng suất gấp gần 2 lần so với đối chứng

Theo (Vijayabaskar et al., 2008) ứng dụng thành công các vi khuẩn có lợi mà cụ thể là nhóm vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi cá rô phi nhằm để hạn chế mầm bệnh do vi khuẩn A hydrophila gây ra.

Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm ở Philippine, khi việc sử dụng

kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩnkháng thuốc, mà xa hơn nữa là vi khuẩn có nhiều khả năng gây bệnh đến con ngườinếu sử dụng quá liều lượng Vì lý do đó mà probiotic được ứng dụng rộng rãi cho nghềnuôi tôm ở Philippine, nghiên cứu cho thấy rằng có thể cứu sống 80% tôm bệnh khitrong ao nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học (Moriarty, 1999)

Một nghiên cứu khác về việc ứng dụng các chế phẩm sịnh học trong nuôi thủy sản chokết quả rất khả quan, không chỉ cải thiện chất lượng nước, giảm lượng dùng kháng

sinh, giảm mầm bệnh trong ao mà còn có thể nâng cao năng suất nuôi và chất lượng

của sản phẩm (Xiang-Hong et al., 1998).

Probiotic đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi thủy sản Nhưng việc sử dụngProbiotic còn phụ thuộc nhiều vào sự am hiểu về bản chất của các vi sinh vật có ích và

đặc điểm sinh học của đối tượng vật nuôi (Balcázar et al., 2006).

2.4 Đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis

Năm 1872, Ferdinand Cohn (một sinh viên của Robert Koch), đã phát hiện và đặt tên là

B subtilis B subtilis là trực khuẩn gram dương, di động, có kích thước 2–3 x 0,7

-0,8µm Chúng có khả năng hình thành bào tử khi môi trường biến đổi đột ngột, cũngnhư khi sống thời gian dài dưới những điều kiện bất lợi như khang hiếm chất dinh

dưỡng Ở điều kiện 100ºC, bào tử B subtilis chịu được 180 phút Bào tử có tính ổn định

cao với nhiệt độ thấp, sự khô cạn, tác động của hóa chất và tia bức xạ

(http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/subtilisin

2.4.2 Quá trình hình thành bào tử ở Bacillus subtilis

Khi môi trường bị thay đổi một cách đột ngột hoặc thiếu thức ăn, các loài thuộc giống

Bacillus và Clostridia tạo ra một loại tế bào ngừng hoạt động tạm thời gọi là nội bào tử

giúp chống lại sự phá hủy thành tế bào (Driks, 1999) Nội bào tử của vi khuẩn đượcsinh ra không phải để sinh sôi nảy nở mà để chịu đựng được với điều kiện bất lợi Đó làloại tế bào ở trạng thái nghỉ mà trong chúng các quá trình sống bị ức chế rất mạnh(Nguyễn Lân Dũng, 1983) Cách đây 100 năm, một nghiên cứu của Koch về bào tử của

B anthracis có thể sống sót ở điều kiện đun sôi, đã tạo cảm hứng cho các nhà khoa học

nghiên cứu về bào tử với mục đích khám phá ra như thế nào loại tế bào ngưng hoạt

động đặc biệt có thể chịu nhiệt độ và các điều kiện gây sốc khác Theo Driks (1999),bào tử có khả năng chịu nhiệt là nhờ lớp áo bào tử Áo bào tử là một cấu trúc gồm nhiềulớp bao quanh bào tử được cấu thành bởi 25 loại polypeptide liên kết chéo chặc chẽ vớinhau Tuy nhiên lớp áo bào tử cũng cho phép bào tử hồi sinh khi điều kiện môi trườngthích hợp Bào tử có thể chuyển đổi thành tế bào phát triển thông qua một quá trình gọi

là sự nẩy mầm

Trong quá trình hình thành nội bào tử, vi khuẩn cũng tạo ra các chất kháng sinh Nhiềuloài hình thành bào tử có thể phân hủy một cách hiệu quả các polymer sinh học(protein, starch, pectin,….), đóng vai trò quan trọng trong các chu trình sinh học Nitơ

và Carbon

Quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn khoảng 8 giờ để hoàn thành (Driks, 1999).Trong quá trình hình thành bào tử, nhiểm sắc thể nhân đôi thành các bản sao riêng biệt.Cuối cùng chỉ có một bản sao nhiểm sắc thể nằm trong bào tử, sau đó hình thành hai tếbào, các phần còn lại bị hủy đi và bào tử được phóng thích Theo Nguyễn Lân Dũng(1983) phần lớn vi khuẩn trong tế bào chỉ có thể có một bào tử Khi gặp điều kiện thuậnlợi bào tử này sẻ nẩy mầm và mỗi bào tử sẽ chỉ cho ra một tế bào dinh dưỡng

Trong tất cả các loài, không phải tất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong bất

kì điều kiện nào, chưa có thông tin giải thích tại sao một vài tế bào trong môi trườngnuôi hình thành bào tử và một số khác thì không Tuy nhiên, có sự chấp nhận rằng sựhình thành bào tử bắt đầu sau pha tăng trưởng nhanh và trong suốt pha tĩnh (Banwart,2000)

2.4.3 Vai trò của Bacillus subtilis

Mô hình nuôi thuỷ sản thâm canh thường tích lũy nhiều vật chất hữu cơ ở đáy ao dothức ăn dư thừa, phân và các chất thải khác của thuỷ sinh vật làm môi trường sống củavật nuôi bị ô nhiễm tạo điều kiện cho mầm bệnh bộc phát gây thiệt hại lớn trong nuôithuỷ sản Chất lượng nước và việc kiểm soát bệnh là vấn đề rất quan trọng trong các aonuôi, nó có quan hệ trực tiếp và ảnh hưởng nhiều bởi hoạt động của vi sinh vật (Jory,1998) Vì vậy, vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ trong thuỷ vực giữ vai trò rất quantrọng trong việc điều chỉnh chất lượng nước đối với các hệ thống nuôi thuỷ sản thâm

canh (Avnimelech et al., 1995) Hoạt động của vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng

nước chủ yếu là sử dụng oxygen, tái tạo lại các dưỡng chất vô cơ và loại trừ các sảnphẩm độc trong trao đổi chất như NH3, NO2-, H2S (Moriarty, 1996)

Nhóm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình thành bào tử là Bacillus spp đã được sử

dụng như một chế phẩm sinh học từ rất lâu giúp cải tiến chất lượng nước nhờ vào tác

dụng phân hủy các hợp chất hữu cơ và làm giảm số lượng mầm bệnh tiếp cận với cácloài thuỷ sản nuôi (Wang et al., 1999).

Không chỉ vậy bào tử Bacillus cũng được sử dụng như một tác nhân sinh học giúp giảm bệnh Vibrio trong hệ thống nuôi thuỷ sản (Skjermo và Vadstein, 1999; Rengipipat et

al., 2000) Bào tử vi khuẩn Bacillus IP5832 đưa vào môi truờng nuôi luân trùng dùng

làm thức ăn cho cá bơn (Gatesoupe, 1991)

Meunpol et al., (2002) sử dụng probiotic với dòng vi khuẩn Bacillus S11 trộn vào thức

ăn viên công nghiệp cho ấu trùng tôm sú ăn Sau khi cho ăn thức ăn trộn probiotic trong

1 tháng thì cấy vi khuẩn Vibrio harveyi rồi sục ozone vào từng bể (0,3333 - 0,341 mg

O3/ml) Tỉ lệ sống của tôm được xác định sau 6 ngày đạt cao nhất 75% so với nghiệmthức đối chứng tỷ lệ sống chỉ có 18%

Vi khuẩn hữu ích đóng vai trò quan trọng trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là liênquan đến sản xuất sơ cấp, phân hủy chất hữu cơ, cải thiện chất lượng nước trong ao.Chúng còn chuyển hóa các chất độc như ammoniac và hợp chất nitơ Trong thủy vực,các vật chất hữu cơ không ngừng bị phân hủy bởi các vi sinh vật vì chúng cần các hợpchất này để làm thức ăn Các chất hữu cơ được chúng hấp thụ làm tiền chất cho việcxây dựng cấu trúc cơ thể và tạo năng lượng cho các hoạt động sống Khi ấy, hợp chấthữu cơ được vi sinh vật biến đổi thành các chất nghèo năng lượng và cuối cùng trongnhững điều kiện thích hợp thì chuyển hóa ngược lại thành các chất vô cơ ban đầu đượcgọi là quá trình vô cơ hoá Quá trình này sẽ tái tạo trở lại vòng tuần hoàn trong thủyvực, tạo nên sự sinh trưởng mới của thực vật Nếu không có vi sinh vật phân hủy hữu

cơ thì toàn bộ quá trình chuyển hóa vật chất trong thủy vực sẽ ngừng lại và sự sống sẽkhông tồn tại được (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2005 )

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

3.1.1 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 01 năm 2009 đến tháng 06 năm 2009

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Tại Trại Cua và phòng thí nghiệm Vi Sinh – Bộ Môn Thủy Sinh Học Ứng Dụng KhoaThủy Sản – Trường Đại Học Cần Thơ

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức

Nghiệm thức 1: bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis chủng 9, mật độ 106CFU/ml

Nghiệm thức 2: bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis chủng 41, mật độ 106CFU/ml

Nghiệm thức 3: bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis chủng 67, mật độ 106CFU/ml

Nghiệm thức 4: không bổ sung vi khuẩn ( đối chứng)

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần Thu mẫutrước khi bổ sung vi khuẩn và tiếp theo 2 ngày thu một lần liên tục trong 7 ngày đầu,sau đó định kỳ 2 tuần thu mẫu một lần cho đến khi kết thúc thí nghiệm

3.2.2.3 Bố trí tôm vào mỗi bể

Nguồn tôm lấy từ trại giống (Minh Thuận) tại Thành Phố Cần Thơ Trọng lượng tômgiống khoảng 0,4 gram

Xử lý tôm trước khi cho vào bể bằng cách ngâm formol nồng độ 30ppm khoảng 15-30phút

Mỗi bể bố trí 3 viên đá bọt dùng để sục khí Sục khí liên tục trong suốt quá trình thínghiệm

3.2.2.4 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn

Chọn 3 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 9, 41 và 67 đã được phân lập từ bùn đáy ao

nuôi tôm sú thâm canh tại Huyện Vĩnh Châu – Tỉnh Sóc Trăng vào tháng 1 năm 2008đến tháng 6 năm 2008 (Lê Mỹ Phương, 2008)

Môi trường nuôi tăng sinh là môi trường Luria Bertani (LB) (phụ lục A2)

Mỗi chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được cho vào môi trường LB, cho vào bình tam

giác có gắn sục khí, ở 300C trong vòng 24 - 48 giờ

Sau khi nuôi tăng sinh xác định mật độ vi khuẩn bằng 2 phương pháp

• Phương pháp đếm trên đĩa thạch với môi trường chuyên biệt cho giống Bacillus

subtilis (phụ lục A1)

• Phương pháp đo OD: sau khi nuôi tăng sinh sử dụng máy đo quang phổ tại bướcsóng 550nm để xác định giá trị OD Mẫu đối chứng không có vi khuẩn được đođầu tiên và có giá trị bằng 0 Dung dịch huyền phù vi khuẩn cần đo sẽ có giá trị

OD trong khoảng 0,125-1,25 Theo tiêu chuẩn Mac Farland giá trị OD bằng 1tương ứng mật độ vi khuẩn 1,2x109 tế bào/ml.

Mật độ vi khuẩn được tính theo công thức

Mật độ vi khuẩn (tế bào/ml) = 1200*10 6 *OD*Độ pha loãng

Bảng giá trị OD550nm.

Giá Trị OD 550 0.125 0.250 0.500 0.750 1.000 1.250

Mật Độ Vi Khuẩn

Mật độ vi khuẩn của mỗi dòng bổ sung vào mỗi bể thí nghiệm là 106 CFU/ml

3.2.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu nước

3.2.3.1 Chuẩn bị trước khi thu mẫu

Hệ thống ống nhựa PVC, nhiệt kế, ống falcon tiệt trùng…

Các ống nghiêm chứa 9ml nước muối sinh lý tiệt trùng (1210C trong 15-20 phút)

Môi trường NA + 1,5% muối NaCl, TCBS và môi trường chuyên biệt cho Bacillus

subtilis.

Ghi nhận pH, nhiệt độ, độ mặn,… trước khi thu mẫu

3.2.3.2 Phương pháp thu mẫu

Mẫu nước được thu bằng ống fancol tiệt trùng, thu mẫu cách mặt nước khoảng 30cm Sau đó trử lạnh ngay ở 40C và tiến hành phân tích trong vòng 2 giờ

độ pha loãng 10-1 Từ mẫu này chuyển 1 ml dung dịch sang ống nghiệm khác chứa 9 mlnước muối sinh lý được độ pha loãng 10-2 Tiếp tục pha loãng theo cách này đến khi đạtđược độ pha loãng thích hợp, bắt đầu từ độ pha loãng 10-2 Còn đối với xác định mật độ

một giá đem sấy ở 800C Khi nhiệt độ đạt 800C tính thời gian đến 30 phút rồi lấy ốngnghiệm ra.

Hình 3.1: Các bước pha loãng mẫuSau đó dùng micropipete hút 100µL dung dịch vi khuẩn cho vào các đĩa chứa môi

trường chuyên biệt cho giống Bacillus subtilis, môi trường NA và TCBS, rồi dùng que

thuỷ tinh tán đều đến khi mẫu khô Ủ ở 28ºC trong 24 -48 giờ Mỗi mẫu nước cần chọn

2 độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần

Đĩa có chứa môi trường thạch

lấy 100µL Mẫu nước

đã được

pha loãng

Que trang

Đèn cồn

Đĩa có chứa môi trường thạch

Hình 3.2: Cách cấy mẫu vào môi trường thạch

Sau khi ủ kiểm tra môi trường nuôi cấy để xác định số khuẩn lạc dao động từ 20 đến

200 Số khuẩn lạc tổng cộng được đếm trên những đĩa petri có số khuẩn lạc > 20 và <

200 và được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc/ml nước Xác định số lượng khuẩn

Mẫu nước

lạc trong mỗi đĩa môi trường và tính số lượng trung bình cùng độ lệch chuẩn Số lượng

vi khuẩn được tính bằng công thức:

Đơn vị hình thành khuẩn lạc(CFU/ml nước) = số khuẩn lạc × độ pha loãng × 10 3.2.4 Phương pháp thu mẫu bùn

Mẫu bùn được thu bằng bộ dụng cụ thu mẫu làm bằng ống nhựa PVC (do viện nghiêncứu sức khoẻ động vật thuỷ sản Thái Lan thiết kế) Dụng cụ được tiệt trùng bằngChlorine nồng độ 5 - 10ppm hoặc cồn 700 Thu mẫu 12 bể thí nghiệm mỗi bể thu 1điểm (khoảng 100 gram bùn trên điểm) Mẫu bùn cho vào ống fancol tiệt trùng và trữlạnh ngay ở 40C Sau đó tiến hành phân tích mẫu trong vòng 2 giờ

mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis thì sau đó xếp tất cả các ống nghiệm vừa pha loãng

vào cùng một giá đem sấy ở 800C Khi nhiệt độ đạt 800C tính thời gian đến 20 phút rồilấy ống nghiệm ra

Sau đó dùng micropipete hút 100 µL dung dịch huyền phù vi khuẩn cho vào các đĩa

chứa môi trường chuyên biệt cho Bacillus subtilis, môi trường TCBS và NA rồi dùng

que thuỷ tinh tán đều đến khi mẫu khô Ủ ở 28ºC trong 24 -48 giờ Mỗi mẫu bùn cầnchọn 3 độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần

Sau khi ủ kiểm tra môi trường nuôi cấy để xác định số khuẩn lạc dao động từ 20 đến

200 Số khuẩn lạc tổng cộng được đếm trên những đĩa petri có số khuẩn lạc > 20 và <

200 và được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc/g bùn Xác định số lượng khuẩn lạctrong mỗi đĩa môi trường và tính số lượng trung bình cùng độ lệch chuẩn Số lượng vikhuẩn được tính bằng công thức:

Đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU/g bùn) = số khuẩn lạc × độ pha loãng × 10

3.2.5 Xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn Bacillus subtilis.

Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa nhằm định danh các dòng vi khuẩn

được áp dụng theo Andretta et at., (2004).

Xác định tính di động, sản sinh Catalase, thủy phân Gelatin, khả năng thủy phân tinhbột (Starch hydrolyis) được thực hiện theo tài liệu hướng dẩn thực tập giáo trình chuyênmôn bệnh học thủy sản (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007) Phương pháp nhuộm Gram thựchiện theo Sharmin and Rahman (2007), Nhuộm bào tử theo Brown (2005) thủy phân

Casein theo Elnasser et at., (2007).

Các chỉ tiêu test Chủng vi khuẩn định danh

3.2.6 Phương pháp xác định sự biến động các yếu tố thuỷ lý.

Các chỉ tiêu như: nhiệt độ, độ mặn, pH, độ trong đều được ghi nhận trước khi tiến hànhthu mẫu

3.2.7 Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm

· Dùng thức ăn công nghiệp GROW FEED

· Liều lượng cho ăn theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ luc C 3.9)

· Cho tôm ăn 5 lần trên ngày: 06 giờ, 10 giờ, 14 giờ, 18 giờ, 22 giờ

· Thường xuyên bổ sung vitamin C vào thức ăn

· Theo dõi các chỉ tiêu thủy lý

· DO 7 ngày một lần vào lúc 15.00 giờ

· Độ Kiềm 4 tuần đo 1 lần

· Nhiệt độ và pH 2 ngày (đo 2 lần/2 ngày vào lúc 8:00 và 14:00 giờ)

· Chạy máy sục khí liên tục trong suốt quá trình thí nghiệm

3.2.8 Tính tốc độ tăng trưởng của tôm

Trọng lượng (P) cân tổng cộng lượng tôm rồi chia tổng số tôm ra trọng lượng trung

Xác định tốc độ tăng trưởng được tính theo công thức:

Rlần sau - Rlần trước= (g/con)

3.2.9 Tính tỉ lệ sống của tôm

Tỉ lệ sống (%) =

Số tôm thu được x 100

Số lượng thả ban đầu

PHẦN IV: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Sự biến động các chỉ tiêu thủy lý

Nhiệt độ, oxy hòa tan, pH là những yếu tố tác động trực tiếp đến đời sống của tôm Đây

là những đại lượng thường biến thiên, thay đổi thường xuyên phụ thuộc vào thời tiết,chế độ chăm sóc,… nên đôi khi sự thay đổi của chúng có thể gây bất lợi cho tôm Chính

vì vậy những yếu tố này được theo dõi thường xuyên để có biện pháp xử lý kịp thời

4.1.1 ảnh hưởng của pH

Kết quả theo dõi sự biến động pH các nghiệm thức được thể hiện trong phụ lục D Bảng4.3 và 4.4 Qua đó cho thấy biên độ dao động pH vào buổi sáng dao động trong khoảng6,80 – 7,90 buổi chiều dao động trong khoảng 7,90 – 8,20 Kết quả cho thấy pH vàobuổi sáng thấp hơn buổi chiều Theo Chanratchakool (2003) nước biển có độ pHkhoảng 7,80 - 8,20 là phạm vi rất thích hợp cho tôm sú, điều này phù hợp với kết quảnghiên cứu của chúng tôi

4.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong suốt thời gian thí nghiệm, nhiệt độ ở các nghiêm thức tương đối ổn định từ 28,5– 31,00C và biên độ dao động nhiệt trong một ngày không cao Theo Whetstone et al.,

(2002) tôm có thể sống tốt ở nhiệt độ 23 - 34 ºC tối ưu là 26 - 29 ºC nhưng không thay

đổi quá 5ºC trong ngày (Boyd et al., 2003) Như vậy nhiệt độ ở các nghiệm thức trong

suốt thời gian thí nghiệm từ 28,5 – 31,00C vẫn nằm trong khoảng cho phép cho sự pháttriển của tôm sú

4.1.3 Ảnh hưởng của độ kiềm

Độ kiềm ở các nghiệm thức dao động trong khoảng 98,5 – 118mg HCO3-/l được thểhiện trong phụ luc D 4.6 Theo Trần Ngọc Hải và ctv (2004) thì độ kiềm tốt nhất chotôm phát triển là lớn hơn 80 mg/l Điều này cho thấy các bể nuôi có độ kiềm nằm trongkhoảng thích hợp cho tôm phát triển tốt

4.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (DO)

Oxy hòa tan là yếu tố chất lượng nước quan trọng trong ao nuôi Hàm lượng oxy hòatan trong nước ở các bể thí nghiệm chủ yếu được cung cấp từ 3 nguồn chính: oxy hòatan trực tiếp từ không khí, Oxy được tạo ra do quá trình quang hợp của thực vật Máysục khí làm tăng cường khả năng hòa tan của oxy vào nước

Kết quả cho thấy sự biến động oxy càng về cuối thí nghiệm hàm lượng oxy hòa tan do quátrình quang hợp của tảo trong bể nuôi Oxy trong thí nghiệm dao động từ (3,69 – 11,30) Theo

Swingle (1969) được trích bởi Lê Bảo Ngọc (2005) oxy hòa tan trong nước lý tưởng cho tôm

là trên 5 ppm và không vượt quá 15 ppm (Whetstone et al., 2002) Như vậy có sự liện quan giữa hàm lượng oxy hòa tan và sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus subtilis giúp phân hủy

nhanh các chất hữu cơ tạo thành muối dinh dưỡng cung cấp cho tảo, tảo quang hợp làm tănghàm lượng oxy hòa tan

Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng oxy hòa tan ở các bể trong suốt quátrình thí nghiệm (phụ lục D bảng 4.5) đều ở mức cho phép không ảnh hưởng đến sinhtrưởng của tôm

4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập.

Qua 7 đợt thu mẫu kết quả các đặc điểm sinh hóa của các chủng chiếm ưu thế 9, 41 và

67 thể hiện ở Bảng 4.3

Bảng 4.3 Các chỉ tiêu sinh hóa để nhận dạng Bacillus subtilis

Các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản trên đều thỏa mãn điều kiện của Andretta et at., (2004).

Hình dạng khuẩn lạc: hình dạng khuẩn lạc của 3 chủng 9, 41 và 67 đều có hình dạng tròn,hơi rìa, khuẩn lạc nhầy, bề mặt nhẵn hoặc hơi nhăn Màu trắng đục đến hơi vàng, sau thờigian nuôi lâu khuẩn lạc có hiện tượng bám sát vào bề mặt thạch của môi trường

Hình: 4.1 Khuẩn lạc sau 24 giờTheo Banwart (2000), ở nhiệt độ khoảng 65 - 850C Bacillus subtilis có khả năng chụi

đựng được trong khoảng 10 - 30 phút Bên cạnh đó, có thể giết chết các loại vi khuẩntạp không hình thành bào tử và chỉ còn bào tử sống sót (Nguyễn Lân Dũng, 2004)

Kết quả nhuộm Gram cho thấy các tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis có hình dạng que

ngắn, gram dương và xuất hiện một vài tế bào hình thành bào tử (Hình 4.2).Tuy nhiên,

theo Collins and Lyne (1986), Bacillus subtilis là loại vi khuẩn đặc biệt, sau thời gian

nuôi lâu vi khuẩn này có thể chuyển thành gram âm Điều này phù hợp với nhận định

của Ferdinand Cohn (1872), đã phát hiện và đặt tên là B subtilis B subtilis là trực

khuẩn gram dương, di động, có kích thước 2–3 x 0,7 - 0,8µm

Hình: 4.2 Nhuộm Gram

Kết quả nhuộm bào tử qua Hình 4.3 cho thấy bào tử bắt màu xanh (mủi tên) của thuốc

nhuộm Malachite Green và thành tế bào vi khuẩn bắt màu hồng của Safranin Qua kếtquả phân tích cho thấy thời gian nuôi vi khuẩn càng lâu thì bào tử hình thành càngnhiều Điều này có thể được giải thích do thời gian nuôi lâu dinh dưỡng ngày càng ít

kích thích sự hình thành bào tử Theo Banwart (2000), trong tất cả các loài không phảitất cả các tế bào đều hình thành bào tử dù ở trong bất kì điều kiện nào.

Theo Nguyễn Lân Dũng (1983) với các phương pháp nhuộm màu thông thường bào tửkhông bị nhuộm màu hoặc chỉ được nhuộm màu rất nhạt Để nhuộm bào tử phải dùngcác dung dịch thuốc nhuộm đậm đặc (Malachite green hoặc xanh methylen ) và vừanhuộm vừa đun nóng Để xác định được vị trí của bào tử trong tế bào phải tạo ra được

sự nhuộm màu tương phản so với phần còn lại của tế bào

Hình: 4.3 Nhuộm bào tử

Kết quả các phản ứng Starch,Casein và Gelatin qua Hình 4.4, 4.5 và 4.6 cho thấy

chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột, Casein và Gelatin Theo Brown (2005),

vi khuẩn không thể thực hiện sự thực bào do thành tế bào cứng nên chúng bài tiết ra cácenzyme để thủy phân các đại phân tử lớn, như enzyme protease thủy phân protein,amylase thủy phân tinh bột thành các amino acid và monosaccharide sau đó vận chuyểnvào tế bào giúp cho quá trình trao đổi chất

Hình: 4.4 Phản ứng Starch