PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO pptx

STb ban đầu cũng được tổng hợp dưới dạng pretoxin có 72 acid amine sau đó được chế biến thành dạng protein hoàn chỉnh có 48 acid amine, protein này có trọng lượng phân tử là 5,1kDa, cấu

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

NGUYỄN QUỲNH NAM

PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E COLI GÂY BỆNH TIÊU

CHẢY TRÊN HEO

Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS.Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006

iii

LỜI CẢM TẠ

Con xin thành kính khắc ghi công lao khó nhọc của cha mẹ, Người đã sinh thành, dưỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con ăn học nên người Con xin cảm

ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bước qua mọi khó khăn

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM, ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận

TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và trang bị cho em những kiến thức cần thiết nhất để em hoàn tất khóa luận này

Toàn thể Thầy, Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báu

Các Thầy, Cô tại phòng thực tập vi sinh đã hết lòng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành công khóa luận này

Các anh chị, các bạn cùng thực tập trong phòng vi sinh đã khuyến khích , ủng

hộ và giúp đỡ để em thực hiện tốt khóa luận này

Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng như trong lúc mình thực hiện khóa luận này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2006

Nguyễn Quỳnh Nam

iv

TÓM TẮT

Enterotoxigenic E coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến trên heo

con và heo đang cai sữa, trong khi những hạn chế của kháng sinh trong việc khống chế

E coli gây bệnh tiêu chảy, thì các chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis chƣa thực sự

hiệu quả trong phòng và trị bệnh Trong đề tài này chúng tôi phân lập các chủng

Bacillus subtilis trong phân heo có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E coli gây

bệnh tiêu chảy trên heo

Chúng tôi phân lập đƣợc 22 chủng Bacillus subtilis trong phân heo, có 13 chủng tạo đƣợc vòng kháng khuẩn với E coli, có thể sự tổng hợp của kháng sinh ức chế sự phát triển của E coli đƣợc kích thích bởi một nồng độ E coli đủ lớn, kháng sinh đƣợc Bacillus subtilis tổng hợp từ giai đoạn rất sớm của sự phát triển ( 0 giờ - 12 giờ ) khi có sự hiện diện của E coli Có 5 chủng cho thấy sự ức chế mạnh mẽ E coli

và nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin

v

MỤC LỤC

CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa

Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt iv

Danh sách các hình v

Danh sách các bảng vi

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 E coli gây bệnh tiêu chảy 3

2.2 Enterotoxigenic E coli 4

2.2.1 Độc tố nhạy nhiệt LT 4

2.2.1.1 Cấu tạo của LT-1 4

2.2.1.2 Cơ chế tác động của độc tố LT-1 4

2.2.2 Độc tố kháng nhiệt 5

2.2.2.1 Độc tố kháng nhiệt STa 5

2.2.2.2 Độc tố kháng nhiệt STb 6

2.2.3 Yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC 7

2.3 Chế phẩm sinh học 9

2.3.1 Định nghĩa 9

2.3.2 Cơ chế tác động 9

2.3.3 Ứng dụng của chế phẩm sinh học 9

2.3.4 Yêu cầu của chế phẩm sinh học 10

2.3.5 Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis 10 2.4 Bacillus subtilis 11

2.4.1 Đặc điểm phân loại 11

2.4.2 Đặc điểm hình thái 11

2.5 Kháng sinh được tổng hợp bởi Bacillus subtilis 13

2.5.1 Giới thiệu 13

2.5.2 Peptide antibiotic được tổng hợp bằng ribosome 14

2.5.2.1 Subtilin 14

2.5.2.2 Subtilosin 15

2.5.2.3 Sublancin 16

2.5.2.4 TasA 16

2.5.3 Peptide antibiotic không được tổng hợp bằng ribosome 18

2.5.3.1 Surfactin 17

2.5.3.2 Fengycin 19

2.5.3.3 Mycosubtilin 29

2.5.3.4 Bacilysocin 20

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

vi

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 22

3.1.1 Thời gian 22

3.1.2 Địa điểm 22

3.2 Vật liệu thí nghiệm 22

3.2.1 Mẫu thí nghiệm 22

3.2.2 Hóa chất 22

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 22

3.3 Phương pháp nghiên cứu 22

3.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo 22

3.3.2 Các phản ứng thử sinh hóa 23

3.3.3 Thử đối kháng với E coli trên môi trường TSA 24

3.3.4 Đánh giá sự đối kháng với E coli trên môi trường TSB 24

3.3.5 Thử kháng sinh đồ 24

3.3.6 Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trường thạch tinh bột 1% 24

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả 25

4.1.1 Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo 25

4.1.2 Kết quả thử đối kháng với E coli trên môi trường TSA 27

4.1.3 Kết quả đối kháng trên môi trường TSB 29

4.1.4 Kết quả thử kháng sinh đồ 30

4.1.5 Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột 32

4.2 Thảo luận 32

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHỤ LỤC 39

vii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

ETEC : Enterotoxigenic E coli

EAEC : Enteroaggregative E coli

LT : Heat-labile toxin

ST : Heat-stable toxin

CT : Cholera enterotoxin

EAST : Enteroaggreative stable-toxin

ENS : Enteric nervous system

GC-C : Guanylate cyclase C

ABC : ATP-binding cassette

viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 : Kết quả phân lập trên môi trường TSA 25

Hình 4.2 : Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E coli trên môi trường TSA với nồng

độ pha loãng canh khuẩn E coli là 10-2

27

Hình 4.3 : Kết quả kháng sinh đồ 31

Hình 4.4 : Hình phân giải tinh bột của Bacillus subtilis

Biểu đồ 4.1: Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi E coli qua các thời điểm 28

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 : Kết quả độ lớn vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập

được với E coli ở nồng độ pha loãng là 10-2 trên môi trường TSA 27

Bảng 4.2 : Kết quả số lượng CFU/ml của E coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12

giờ, 24 giờ, 36 giờ 29

Bảng 4.3 : Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng được thử đối kháng 30

Bảng 4.4 : Kết quả tạo vòng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis phân lập

được trên môi truờng thạch tinh bột 1% 32

1 PHẦN 1: MỞ ĐẦU

2

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Enterotoxigenic E coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến trong đường

tiêu hóa của heo và người, chiếm đến 66,7% trường hợp tiêu chảy trên heo còn non và

heo đang cai sữa gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi

Do tính chất đề kháng rất nhanh đối với nhiều loại kháng sinh của E coli, thì

việc sử dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn đến xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho người tiêu dùng, do đó sử dụng probiotic được xem như là một giải pháp thay thế hiệu quả cho kháng sinh Hiện nay

Bacillus subtilis được tập trung nghiên cứu nhiều do có nhiều ưu điểm thỏa mãn được

yêu cầu của sản phẩm probiotic hơn so với các chủng vi sinh vật khác Mặc dù vậy vẫn

chưa có một sản phẩm probiotic từ Bacillus subtilis có thể ngăn ngừa một cách có hiệu

quả bệnh tiêu chảy Bên cạnh đó một số sản phẩm probiotic phòng bệnh tiêu chảy trên thị trường của Việt Nam như Biosubtyl, Subtyl thì chủng vi khuẩn được sử dụng

không phải vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis, đồng thời các chủng này kháng

được nhiều loại kháng sinh (Ngô Thị Hoa, 2000) nên có khả năng phổ biến các gene kháng kháng sinh cho các vi khuẩn trong đường ruột của thú Do đó tiếp tục phân lập

các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế một cách có hiệu quả vi khuẩn

E coli gây bệnh tiêu chảy và không mang các gene kháng kháng sinh là điều cần thiết

Trước tình hình đó được sự phân công của khoa công nghệ sinh học trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với sự hướng dẫn của Ts Nguyễn Ngọc Hải

chúng tôi thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và

thử đối kháng với E coil gây bệnh tiêu chảy trên heo ”

Chọn lọc đƣợc dòng Bacillus subtilis kháng khuẩn đối với E coli

Đánh giá sự đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E coli gây bệnh trong

3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

2.1 E coli gây bệnh tiêu chảy

Escherichia coli là vi khuẩn đường ruột gram -, là loài chiếm ưu thế trong

đường tiêu hóa của người và động vật, hầu hết E coli là những chủng có lợi giúp cân

bằng hệ thống vi sinh vật đường ruột tuy nhiên có một số chủng có khả năng gây bệnh cho người và động vật, trẻ sơ sinh và động vật còn non dễ bị xâm nhiễm bởi những chủng gây bệnh khi hệ thống vi sinh vật đường ruột bị rối loạn, cơ thể thú bị suy giảm miễn dịch, hoặc cơ thể thú nhạy cảm với một số chủng vi khuẩn nhất định Để có thể

gây bệnh các chủng E coli này cần phải gắn được vào tế bào thành ruột, tránh sự bảo

vệ của cơ thể vật chủ, gia tăng số lượng sau đó làm tổn thương các tế bào thành ruột,

các loại E coli gây bệnh khác nhau có cơ chế gây bệnh khác nhau, do đó dựa vào sự tương tác của E coli với tế bào thành ruột có thể chia các chủng E coli gây bệnh thành

ít nhất 6 loại: enterotoxigenic E coli (ETEC), enterohemorrhagic E coli (EHEC), enteroaggregative E coli (EAEC), enteropathogenic E coli (EPEC), enteroinvasive E

coli (EIEC), diffusely adherent E coli (DAEC) (12)

Các chủng E coli gây bệnh còn được phân biệt với nhau bằng các phản ứng

ngưng kết kháng nguyên

Sự xâm nhiễm của các chủng E coli gây bệnh dẫn đến các rối loạn trong hệ

thống tiêu hóa, nhiễm trùng đường tiết niệu, rối loạn hệ thần kinh trung ương, sau khi

cố định trên tế bào thành ruột các chủng E coli này tiết ra độc tố làm tổn thương các tế

bào thành ruột, tất cả những gene qui định độc tính của vi khuẩn được mã hóa trên cùng plasmid hoặc được tập trung trong một vùng nhiễm sắc thể của bộ gene vi khuẩn,

có một vài tính trạng riêng biệt được mã hóa trên transposome hay phage

Trong 6 loại trên thì enterotoxigenic E coli là loại phổ biến nhất gây bệnh trên

heo

2.2 Enterotoxigenic E coli (ETEC)

Enterotoxigenic E coli là những chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra ít nhất là

một thành viên trong trong 2 loại độc tố enterotoxin là: LT (heat-labile toxin), ST (heat-stable toxin) ETEC có khả năng gây ra hiện tượng tiêu chảy trên heo, trên người

và các loài thú khác Mỗi chủng ETEC có thể mang gene mã hóa cho 1 loại độc tố

hoặc có thể cả 2 loại độc tố khác nhau, những gene này có khả năng cùng được biểu hiện và gây bệnh cho tế bào vật chủ, trong đó thì LT có ảnh hưởng rất lớn đối với độc tính của vi khuẩn (11)

2.2.1 Độc tố nhạy nhiệt LT

LT là độc tố nhạy cảm với nhiệt có cấu trúc và cơ chế gây độc gần giống với

cholera enterotoxin (CT) được sản xuất từ Vibrio cholerae, gene mã hóa cho cấu trúc của độc tố LT nằm trên plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn Vibrio cholerae LT có hai

nhóm chính là LT-1 và LT-2, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn dịch chéo với

nhau LT-1 được biểu hiện trong các chủng E coli gây bệnh trên người và động vật còn LT-2 chỉ được tìm thấy trên những chủng E coli phân lập được trên động vật và

một số rất ít chủng phân lập được trên người tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy LT-2 có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập chung chủ yếu vào LT-1

LT1-1 trọng lượng phân tử là 86 kDa được cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị A có trọng lượng phân tử 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B có trọng lượng phân tử 11,5 kDa, 5 tiểu đơn

vị B sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột còn tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tự phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 nối với nhau bằng cầu nối disulfic, LT-1 có hai loại là LTh-1 có độc tính trên người và LTp-1 có độc tính trên heo

Sau khi gắn vào màng tế bào chủ LT-1 được chuyển vào trong tế bào, mục tiêu của LT-1 là adenylate cyclase, enzyme này nằm trên lớp màng phân cực của tế bào biểu mô ruột Tiểu đơn vị A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase hoạt động chuyển ADP từ NAD gắn vào tiểu đơn vị alpha của protein liên kết với GTP làm hoạt hóa hoạt tính adenylate cyclase của tiểu đơn vị này, quá trình gắn ADP vào tiểu đơn vị làm adenylate cyclase hoạt động liên tục từ đó gia tăng hàm lượng cAMP nội bào, khi hàm lượng cAMP nội bào tăng, cAMP sẽ gắn vào và hoạt hóa enzyme protein kinase A, enzyme này hoạt động làm phosphoryl hóa kênh clorua nằm ở phía trên màng tế bào biểu mô ruột, sự phosphoryl hóa dẫn đến sự gia tăng hoạt động của kênh do đó ion clorua sẽ bị tiết ra ngoài qua các khe tiết đồng thời ức chế sự hấp thụ NaCl từ bên ngoài vào bởi các tế bào lông ruột, do đó tăng nồng độ ion trong ruột làm nước bên

trong tế bào bị kéo ngược ra ngoài và dẫn đến hiện tượng tiêu chảy bên cạnh đó còn có các cơ chế khác liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS) và sự đáp ứng miễn dịch của tế bào thành ruột với độc tố cho nên có ít nhất một cơ chế tác động đồng thời với

cơ chế tăng hàm lượng cAMP

LT bị sử lý để mất hoạt tính ADP-ribosyltransferase còn có tác động như một tá dược

LT-2 có 55 – 57 % tương đồng với LT-1 ở tiểu đơn vị A, nhưng không cho thấy

sự tương đồng ở tiểu đơn vị B, LT-2 có hai kiểu kháng nguyên khác nhau là LT-2a và LT-2b hai kiểu kháng nguyên này có sự tương đồng với nhau là 71% ở tiểu đơn vị A

và 66% ở tiểu đơn vị B LT-2 có cơ chế tác động tương tự LT-1 là gia tăng hàm lượng cAMP nội bào, khác biệt là receptor của LT-2 là GD1 còn của LT-1 là GM1, tuy nhiên như đề cập ở trên thì không có bằng chứng cho thấy LT-2 gây độc cho tế bào của người và động vật

2.2.2 Độc tố kháng nhiệt (heat-stable toxin ST)

ST là protein nhỏ chỉ được cấu tạo từ một đơn vị, nhưng trong cấu trúc chứa nhiều amino acid cystein, do đó trong cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tính chất này dẫn đến khả năng kháng nhiệt của độc tố Độc tố này có hai loại, có cấu trúc

và cơ chế hoạt động khác biệt nhau là STa và STb, gene mã hóa cho hai loại độc tố này được được qui định trên plasmid, một số gene được phát hiện nằm trên transposon

STa có trọng lượng phân tử là 2kDa, có hai dạng khác nhau là STap trong cấu trúc chứa 18 amino acid có khả năng gây độc cho heo và người, dạng còn lại là STah cấu tạo từ 19 amino acid chỉ gây độc cho người Ban đầu STa được tổng hợp dưới dạng pre-protoxin chứa 72 amino acid, sau đó được phân cắt thành peptide có 52 acid amine, dạng peptide này được chuyển vào vùng periplasm sau đó hình thành cầu nối disulfic nhờ enzyme DsbA được mã hóa trên genome của vi khuẩn, sau đó dạng protoxin sẽ được cắt thành dạng toxin hoàn chỉnh và được khuếch tán qua vách tế bào Ngoài ETEC ra thì STa còn được tổng hợp bởi một vài chủng vi khuẩn gram (–) khác

như Yersinia enterocolitica và V cholerae non-O1, bên cạnh đó STa có 50% protein

tương đồng với độc tố EAST1 ST của EAEC

Receptor của STa là enzyme xuyên màng được gọi là guanylate cyclase C (GC-C), GC-C nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột, protein này là receptor của hormone guanylin của thú, hocmone này có 15 amino acid trong đó có 4 cystein đóng vai trò giúp cân bằng trạng thái bình thường của ruột, cơ chế tác động của receptor này với guanylin dựa vào cơ chế ligand-receptor, đó là cơ chế receptor gắn với ligand tiếp nhận các thông tin ngoại bào từ đó thúc đẩy sự hoạt động của các enzyme nội bào Tương tự như vậy sau khi liên kết với receeptor STa thúc đẩy họat tính guanylate cyclase của enzyme này làm gia tăng hàm lượng cGMP nội bào, cGMP hoạt hóa protein kinase G hoạt động của enzyme này làm tăng hoạt động của kênh clorua, làm đẩy mạnh việc tiết ion clorua và ức chế sự hấp thu NaCl dẫn đến dịch ruột

bị tiết ra ngoài gây nên hiện tượng tiêu chảy Độc tố STa tác động nhanh hơn LT do không cần phải chuyển vào bên trong tế bào mà truyền tín hiệu trực tiếp vào bên trong Ngoài GC-C ra thì STa có thể còn có các receptor khác tuy nhiên GC-C là receptor chiếm ưu thế nhất

STb ban đầu cũng được tổng hợp dưới dạng pretoxin có 72 acid amine sau đó được chế biến thành dạng protein hoàn chỉnh có 48 acid amine, protein này có trọng lượng phân tử là 5,1kDa, cấu trúc của STb không tương đồng với STa mặc dù trong cấu tạo của nó cũng có 4 amino acid cystein, STb làm tổn thương các tế bào ruột do tác động lên các lông ruột dẫn đến các lông tơ trên tế bào biểu mô bị mất hoặc bị thu ngắn lại, receptor của STb vẫn chưa được xác định có thể độc tố này gắn vào những vùng không chuyên biệt trên màng tế bào trước khi được đưa vào trong, tác động của STb trong tế bào không giống như STa thay vì phân tiết clorua, độc tố này dẫn đến việc phân tiết bicarbonat, STb không làm gia tăng hàm lượng cAMP hay cGMP nội bào mà tác động của nó làm tăng hàm lượng calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên ngoài, ngoài ra tác động của nó còn làm tăng sự phân tiết PGE2 và serotonin cho thấy tác động của STb có liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS)

Cơ chế tác động của độc tố LT và ST được trình bày ở hình bên dưới

2.2.3 Các yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC

Để có thể gây bệnh các chủng ETEC phải gắn được vào thành tế bào biểu mô ruột, khả năng gắn được vào thành tế bào ruột non càng lớn thì mức độ gây bệnh càng lớn, việc gắn vào thành tế bào ruột được thực hiện bởi một thành phần trên lớp capsule của vi khuẩn gọi là fimbriae, fimbriae có cấu tạo nhỏ và chiếm một số lượng lớn hơn tiêm mao (flagella) của vi khuẩn, fimbriae có nhiều hình dạng và cấu trúc khác nhau, mỗi fimbriae có một receptor chuyên biệt trên thành biểu mô ruột các receptor này có cấu tạo là IMTGP (intestinal mucin-type glycoprotein) Fimbriae xuất hiện trên cả vi

khuẩn E coli gây bệnh cũng như không gây bệnh nó giúp cho vi khuẩn chống việc bị

loại thải bởi nhu động ruột, một vi khuẩn có thể có nhiều loại fimbriae khác nhau, fimbriae nằm trên capsule cho nên kháng nguyên bề mặt là kháng nguyên K tuy nhiên

nó được cấu tạo là protein nên còn được gọi là kháng nguyên F, các fimbriae khác nhau được phân biệt bằng hình thái và khả năng ngưng kết hồng cầu

Mỗi loại ETEC gây bệnh cho những loài khác nhau thường biểu hiện một loại fimbriae riêng biệt

Bảng bên dưới thể hiện một vài kháng nguyên và đối tượng gây bệnh của nó (13)

Kháng nguyên Đối tượng gây bệnh Serogroup O

K88 Heo con 08, 045, 0138, 0141,

0147, 0149, 0157 987P Heo con 09, 020, 0141 K99 Cừu, bê 08, 09, 020, 0101 K99 Heo con 064, 0101 K41 Bê 09, 0101 CFA\1 Người 015, 025, 063, 078 CFA\2 Người 06,08

Khả năng tổng hợp enterotoxin và hiện diện của fimbriae có sự liên hệ với nhau (13)

Fimbriae Enterotoxin

ST LT LT+ST K880

987P K99 K41 CFA\1 CFA\2

+ + + + - - + - - + - - + + +

sinh vật khác nhau Các loại vi sinh vật có lợi được sử dụng phổ biến nhất là các loài

của lactobacilli, streptococcus, bifidobacterium ssp, bacillus ssp.v.v (2), (9)

2.3.2 Cơ chế tác động

Tuy đã được sử dụng từ rất lâu nhưng cơ chế tác động của probiotic vẫn chưa được nghiên cứu một cách rõ ràng do hiệu quả tác động của nó chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau Fuller (1992) đã đề nghị cơ chế tác động của probiotic có thể

là (2)

 Cạnh tranh thụ thể kết dính trên biểu mô tế bào tiêu hóa

 Cạnh tranh chất dinh dưỡng giới hạn với vi sinh vật gây bệnh, tuy nhiên cơ chế này chưa được chứng minh một cách rõ ràng trong điều kiện in vivo

 Sản xuất chất kháng khuẩn như các acid hữu cơ, bacteriocin.v.v

Probiotic giúp cho thú tăng trọng nhanh hơn trên một đơn vị thức ăn do vi sinh vật trong probiotic tiết ra các enzyme tiêu hóa như amylase, protease làm tăng hệ số chuyển hóa thức ăn của thú

2.3.4 Yêu cầu của chế phẩm sinh học

An toàn là điều tiên quyết đối với một chế phẩm sinh học, các chủng vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm sinh học phải không mang gene gây độc cho người và động vật

Chủng vi sinh vật được chọn để làm chế phẩm phải chống chịu được điều kiện

pH thấp của dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hóa đồng thời phải có khả năng bám và tạo khuẩn lạc trên thành ruột (9)

Chế phẩm sinh học phải cho được hiệu quả cao trong phòng, trị bệnh hoặc trong cải thiện dinh dưỡng của thú Vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm sinh học phải có tính đối kháng mạnh với nhiều chủng vi sinh vật khác nhau hoặc làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn một cách có ý nghĩa

Giá thành có ý nghĩa rất lớn đối với sự phổ biến của sản phẩm, vi sinh vật được tuyển chọn làm chế phẩm sinh học phải phát triển mạnh, qui trình nuôi cấy và sản xuất phải đơn giản không tốn kém

Dễ sử dụng và bảo quản, cách sử dụng phải đơn giản, vi sinh vật phải tồn tại được trong thời gian dài ở điều kiện bảo quản bình thường

2.3.5 Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis

Điều khác biệt đối với các sản phẩm probiotic khác là các sản phẩm probiotic

có nguồn gốc từ bacillus sp được sản xuất ở dạng bào tử do đó những sản phẩm này có

nhiều ưu điểm hơn so với các sản phẩm khác là dễ sản xuất, giá thành sản xuất rẽ, bào

tử chịu đựng được các điều kiện trong quá trình sản xuất, dễ bảo quản, thời gian bảo quản dài, bào tử có khả năng đề kháng tốt với acid dạ dày, muối mật, enzyme tiêu

hóa….Trong các loài vi khuẩn khác nhau thuộc giống bacillus thì Bacillus subtilis được tập trung nhiều nhất vì các dòng vi khuẩn của Bacillus subtilis không mang những gene gây độc cho người và thú, quá trình hình thành bào tử của Bacillus subtilis

được nghiên cứu một cách chi tiết, đồng thời những nghiên cứu gần đây cho thấy bào

tử của Bacillus subtilis có khả năng nảy mầm được trên phần đầu của ruột non (3) Điều này làm cho việc nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic được đẩy

mạnh

2.4 Bacillus subtilis

2.4.1 Đặc điểm phân loại

Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc

Bacillus subtilis là trực khuẩn, gram (+), sinh nội bào tử, kích thước 0,5- 0,8μm

x 1,8-3μm là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, tế bào ít khi tạo thành chuỗi thường ở

dạng đơn bào, hiện diện nhiều trong đất, nước, trong đường tiêu hóa của người và động vật

Hình dạng của Bacillus subtilis trên môi trường TSA là khuẩn lạc khô, có rìa

răng cưa, có đường kính 3-5mm nằm sát trên bề mặt thạch

Hình 2.1: Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trường TSA và nhuộm gram của

Bacillus subtilis

Các phản ứng sinh hóa được sử dụng để để khẳng định Bacillus subtilis

Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), khả năng phân giải tinh bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP (+), indol (-), lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose

Bacillus subtilis là vi khuẩn gram (+) được tập trung nghiên cứu nhiều nhất cho

đến thời điểm hiện nay, bộ genome của loài này đã được giải mã toàn bộ, bộ gene có 4 Mbp (23), trọng lượng của bộ genome khoảng 2,4×109 đến 2,6×109 dalton đặc biệt

trong genome của Bacillus subtilis có nhiều gene qui định cho khả năng kháng lại

kháng sinh như gene kháng thiostrepton, streptomycin, erythromycin, spectinomycin, chloramphenicol, penicilin.v.v…(8) tuy nhiên bất kể là gene kháng kháng sinh được qui định trên genome hay trên plasmid nó cũng là nguồn cung cấp gene kháng kháng sinh cho các vi sinh vật đường ruột

Ở điều kiện kỵ khí Bacillus subtilis sử dụng nitrate như chất nhận điện tử cuối cùng, nếu trong môi trường thiếu nitrate thì Bacillus subtilis phát triển bằng cách lên

men

Trong môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis tiết ra exopolysacharide để gắn kết

các tế bào lại với nhau để tạo màng sinh học (biofilm) (10) Màng sinh học giúp cho

Bacillus subtilis có ưu thế trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi

trường tự nhiên đồng thời màng sinh học nổi lên trên bề mặt môi trường giúp cho vi khuẩn có thể tiếp xúc trực tiếp với oxy trong không khí

Sản xuất các chất diệt khuẩn khác nhau, có nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus

subtilis có khả năng sản xuất nhiều hợp chất kháng khuẩn khác nhau có khả năng ức

chế sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh như Clostridium perfringens,

Helicobacter pylori, Escherichia coli 078:K80.v.v… (5)

Vi khuẩn Bacillus subtilis được ứng dụng để sản xuất các loại enzyme khác

nhau như amylase, protease đồng thời cũng được ứng dụng để sản xuất sản phẩm lên men truyền thống natto của Nhật Bản

Khi gặp điều kiện bất lợi Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử, bào tử

có thể tồn tại rất lâu trong tự nhiên có thể đến hàng ngàn năm và có thể phát triển lại thành tế bào sinh dưỡng hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi

Hiện nay bào tử của Bacillus subtilis đang được quan tâm để sản xuất ra các

vaccin thế hệ mới, bằng kĩ thuật di truyền đã chuyển gene qui định độc tố thương hàn

vào Bacillus subtilis và trong quá trình hình thành bào tử gene này cũng được biểu

hiện để sản xuất ra những protein kháng nguyên trên lớp vỏ bào tử (7)

2.5 Kháng sinh được tổng hợp bởi Bacillus subtilis

2.5.1 Giới thiệu

Peptide antibiotic là sản phẩm chuyển hóa bậc hai của nhiều loại vi sinh vật khác nhau, giúp chúng có ưu thế trong cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi trường cũng như trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm Peptide antibiotic có bản chất

là các peptide có trọng lượng phân tử nhỏ, depsipeptide, peptidolactone, lipopeptide, được phân thành hai lớp là peptide được tổng hợp bằng ribosome còn được gọi là bacteriosin, còn lại là lớp peptide không được tổng hợp bằng ribosome (16)

Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như

subtilin, subtilosin A, TasA, sublancin có bản chất là bacteriocin còn bacilysin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillaene, difficidin và các lipopeptide có tính kháng khuẩn là các antibiotic không được tổng hợp bằng ribosome (20)

Bacteriocin được tổng hợp dưới dạng tiền peptide có chứa một đoạn tín hiệu giúp cho enzyme tiết nhận biết, đồng thời ức chế sự tác động của bacteriocin trong tế bào, dạng tiền peptide sau đó được chuyển lên màng nguyên sinh chất tại đây xãy ra

các phản ứng biến đổi sau dịch mã, cắt đoạn peptide tín hiệu ở đầu C của tiền chất để thành dạng hoàn chỉnh, sau đó được tiết ra ngoài bằng phức hợp bơm protein ABC (ATP-binding cassette transport complex) gắn với màng tế bào chất (16)

Các peptide antibiotic không tổng hợp bằng ribosome thì được tổng hợp bằng các enzyme có cấu trúc phân tử lớn, bên trong cấu trúc được chia thành nhiều module khác nhau mỗi module chịu trách nhiệm hoạt hóa một amino acid chuyên biệt, các module được sắp xếp theo trình tự tương ứng với trình tự các amino acid trên chuỗi peptide (16)

Lipopeptide có tính kháng khuẩn được chia thành 3 họ khác nhau là surfactin, fengycin và iturin, lipopeptide được cấu tạo bằng vòng peptide có cấu tạo từ 7 (họ surfactin và iturin) hoặc 10 (họ fengycin) amino acid liên kết với nhóm –COOH và nhóm hydroxy (họ surfactin và fengycin) hoặc nhóm amino (họ iturin) tại vị trí β của acid béo Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ C13 đến C16 đối với lipopeptide thuộc họ surfactin, từ C14 đến C17 đối với họ iturin và từ C14 đến C18 trong trường hợp của họ fengycin (20)

2.5.2 Peptipe antibiotic được tổng hợp bằng ribosome

Subtilin là bacteriocin thuộc nhóm I lantibiotic, những antibiotic thuộc nhóm Lantibiotic có tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gram dương như

Propionibacterium acnes, staphylococci, streptococci và clostridia Cấu tạo của

subtilin có chứa các amino acid không bình thường lanthionin, β-methyllanthionin, alanin, dehydroalanin, dehydrobutyrin, cầu nối sulfic được hình thành giữa các amino acid này tạo nên nhiều cấu trúc dạng vòng trong cấu tạo của subtilin Các amino acid không bình thường được tạo ra do quá trình biến đổi sau dịch mã của subtilin (28)

D-Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave

ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tương tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với các nhóm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lượng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton

Subtilin được tổng hợp trong pha tăng trưởng và đạt nồng độ cao nhất ở đầu pha cân bằng (29)

Operon của subtilin gồm có spaS mã hóa cho tiền peptide của subtilin, spaB và

spaC mã hóa cho enzyme thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã, spaT mã hóa

cho enzyme chuyển dạng tiền chất của subtilin lên màng tế bào chất , spaR và spaK

mã hóa cho protein điều hòa quá trình tổng hợp subtilin (27), spaI mã hóa cho thành

phần protein của lipopeptide SpaI giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại sự tác động

của subtilin, spaF, spaE, spaG mã hóa cho hệ thống chuyển ABC thực hiện tiết

subtilin ra ngoài môi trường bên ngoài (26) Cấu trúc của subtilin, thứ tự các gene trên

operon spaIEFG được thể hiện ở Hình 2.2 (phụ lục)

Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin

Sự tổng hợp subtilin được điều hòa bằng hệ thống điều hòa hai thành phần là protein SpaK và SpaR SpaK là protein xuyên màng với đầu cuối N nằm trong tế bào chất Khi nồng độ vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy tăng cao hoặc có sự hiện diện của subtilin hay các antibiotic có cấu trúc tương tự (nisin) trong môi trường nuôi cấy SpaK tiếp nhận tín hiệu rồi truyền vào bên trong bằng cách tự phosphoryl hóa His ở vị trí 247 ở đầu N sau đó sẽ chuyển gốc phosphat đến amino acid Asp ở vị trí 51 của

protein SpaR , SpaR sẽ gắn vào promoter thúc đẩy sự biểu hiện của gene spaB, spaT,

spaC, spaS đồng thời cũng điều hòa sự tổng hợp của spaI, spaF, spaE, spaG Ngoài ra

operon của subtilin còn được điều hòa bởi yếu tố H (27)

Subtilin ban đẩu được tổng hợp ở dạng tiền chất có 56 amino acid, dạng tiền chất này được SpaT chuyển lên màng tế bào chất, tại đây dạng tiền chất của subtilin được biến đổi thành dạng subtilin hoàn chỉnh có 32 amino acid Sau đó subtilin được chuyển ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC do SpaF, SpaE, SpaG hợp thành Lipoprotein SpaI định vị ở bề mặt ngoài của lớp màng tế bào có tác dụng ngăn chặn sự

tác động của subtilin vừa được tiết ra lên màng tế bào chất của Bacillus subtilis (26)

Subtilosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria

monocytogenes và Bacillus cereus (24), cấu trúc dạng vòng, tiền peptide có 43 amino

acid, Asn ở vị trí 9 tạo liên kết với Gly ở đầu cuối C, đoạn tín hiệu ở đầu cuối N được cắt để tạo thành cấu trúc dạng vòng, Phe và Thr được biến đổi sau dịch mã dẫn đến sự

hình thành cầu nối nội phân tử để hình thành dạng antibiotic hoàn chỉnh dạng vòng có

32 amino acid (25) Cấu trúc của subtilosin được thể hiện ở Hình 2.3A (phụ lục)

Toàn bộ gene chịu trách nhiệm cho toàn bộ quá trình tổng hợp subtilosin được

mã hóa trên cùng 1 operon Operon sbo-alb được điều kiển bởi promotor ở upstream của sboA, giữa 2 gene sboA và albA có một cấu trúc terminator cho nên các enzyme

chịu trách nhiệm tổng hợp và phân tiết subtilosin được tổng hợp với số lượng ít hơn cơ

chất của nó Operon của subtilosin bao gồm các gene là sboA mã hóa cho dạng tiền chất của subtilosin, albA, albF và albE mã hóa cho protein thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã và hoàn chỉnh subtilosin, albB, albC, albD và albG mã hóa cho protein chịu trách nhiệm cho sự tự đề kháng của Bacillus subtilis với subtilosin (24)

Cấu trúc của operon được thể hiện ở Hình 2.3B (phụ lục)

Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin

Sự tổng hợp của subtilosin được kiểm soát bởi hệ thống điều hòa spo0-abrB, ở pha tăng trưởng AbrB sẽ gắn trực tiếp với promotor của operon sbo-alb ức chế sự biểu

hiện của operon này, ở đầu phag cân bằng do sự thiếu dinh dưỡng trong môi trường và nồng độ cao của tế bào (25), các enzyme trên màng của tế bào tiếp nhận tín hiệu, các enzyme này truyền tín hiệu vào bên trong bằng một loạt các phản ứng phosphoryl hóa cuối cùng là phosphoryl hóa SpoA, quá trình này cũng là sự mở đầu của quá trình tạo

bào tử, SpoA được phosphoryl hóa sẽ ức chế sự biểu hiện của abrB dẫn đến thúc đẩy

sự biểu hiện của operon sbo-alb Quá trình dịch mã được thực hiện bởi RNA

polymerase được kiểm soát bởi yếu tố điều hòa A, trong điều kiện thiếu oxy operon

sbo-abl được điều hòa bởi hệ thống truyền tín hiệu ResDE (25), (24)

Tiền chất của subtilocin được tổng hợp ở dạng thẳng có 42 amino acid sau đó được AlbA và AlbF biến đổi thành dạng hoàn chỉnh Trong cấu tạo của AlbB có hai nhóm Cys một ở giữa đoạn cuối N, một ở đầu C , nhóm này được xem là trung tâm S-

Fe là trung tâm hoạt động của các enzyme thực hiện các phản ứng hydrate hóa hoặc dehydrate cơ chất, còn AlbF trong cấu trúc có một đoạn peptide tương tự như là peptidase nằm giữa đầu N còn ở đầu C có cấu trúc tương tự như cấu trúc protein gắn vào peptide cho nên hai enzyme này được thực hiện các phản ứng biến đổi dạng pre-subtilocin thành dạng hoàn chỉnh (24)

Sau khi được biến đổi thành dạng hoàn chỉnh thì subtilocin được tiết ra ngoài

chủ yếu bằng AlbC có sự tham gia của AlbD AlbB có tác dụng giữ cho Bacillus

subtilis tránh được sự tác động của subtilocin (24)

Sublancin thuộc nhóm AII lantibiotic vì trên đoạn peptide tín hiệu có 1 motif

GS kế tiếp nó là một site cắt, do đó sublancin được tiết ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC hai chức năng là cắt đoạn peptide tín hiệu và tiết sublancin ra môi trường, trong cấu tạo có 3 cầu nối nội phân tử gồm 2 cầu nối disulfic của 4 Cys và một cầu nối sulfic của -methyllanthionine và dehydrobutyrine, tương tự như antibiotic thuộc họ lantibiotic, sublansin không tác động với vi khuẩn gram âm nhưng có khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn gram dương kể cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở điều kiện bình thường trong thời gian 2 năm không làm mất hoạt tính của sublancin (21)

Operon của sublancin gồm các gene sunA, sunT, bdbA, bdbB, bdbC, và bdbD

SunA là tiền peptide của sublancin có 56 amino acid sau đó đoạn tín hiệu bị cắt đi

trong quá trình phân tiết tạo thành dạng hoàn chỉnh có 37 amino acid, sunT mã hóa cho

hệ thống chuyển ABC vì trong cấu trúc của SunT có 4 cấu trúc xuyên màng, ở đầu N tồn tại domain có hoạt tính peptidase, còn ở đầu C là domain liên kết với ATP

(21).Gene bdbB là gene quan trọng cho sự tổng hợp sublancin nó mã hóa cho enzyme

xúc tác phản ứng tạo cầu nối disulfic giữa hai Cys bên trong cấu tạo của sublancin,

bdbA, bdbC và bdbD thì không có tác động lớn đối với việc tổng hợp sublansin Cấu

trúc của sublancin, trình tự amino acid và cấu trúc operon của sublancin được trình bài

ở Hình 2.4 (phụ lục)

TasA là peptide kết hợp với bào tử của Bacillus subtilis, TasA có phổ kháng

khuẩn rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử được bắt đầu, đồng thời TasA cũng được chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào

tử sau đó định vị trong lớp peptidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillus

subtilis chiếm ưu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm (30)

Operon của TasA bao gồm 3 gene là yqxM, sipW và tasA yqxM là gene mã hóa

cho kháng sinh được tổng hợp trong môi trường có nồng độ muối cao (32), SipW chịu

trách nhiệm cắt đoạn peptide tín hiệu và chuyển TasA ra ngoài môi trường và giữa lớp màng kép của tiền bào tử trong cấu tạo của SipW có 4 đoạn peptide xuyên màng, amino acid serine ở vị trí 47 và Histidin ở vị trí 87 là trung tâm hoạt động của đoạn

peptide đóng vai trò là peptidase của SipW (31) Gene tasA mã hóa cho tiền peptide

của TasA Trong cấu trúc của đoạn peptide tín hiệu ở vị trí 7 và 9 là kế tiếp là một đoạn peptide kỵ nước (G ở vị trí 10 đến A ở vị trí 15) cấu trúc bậc 3 có dạng α-helic cho phép đoạn peptide này có thể xuyên màng, kế tiếp là đoạn peptide chứa 3 L, 5 amino acid, kế tiếp là site cắt cho peptidase Trình tự amino acid tiền chất của TasA và

cấu trúc của operon được được biểu diễn ở Hình 2.5A (phụ lục)

Quá trình điều hòa tổng hợp và phân tiết của TasA

TasA được tổng hợp ngay đầu phag cân bằng cho nên nó được điều hòa bởi các yếu tố điều hòa chuyển phag Tương tự như subtilosin quá trình tổng hợp TasA được

điều hòa hệ thống spo0-abrB nhưng RNA polymerase chịu trách nhiệm dịch mã cho

operon cùa TasA được điều hòa bởi yếu tố điều hòa H (31)

Sau khi được tổng hợp dạng tiền chất của TasA được chuyển lên màng tế bào chất, hai Lys ở vị trí 7 và 9 mang điện tích dương liên kết với màng tế bào chất, sau đó đoạn peptide kỵ nước sẽ xuyên qua màng tế bào chất đồng thời kéo đoạn peptide còn lại xuyên màng sau đó peptidase trong SipW cắt đoạn tín hiệu rồi giải phóng TasA hoạt động, đoạn tín hiệu sau đó tiếp tục được cắt rồi loại ra khỏi màng tế bào chất (36)

Cơ chế chuyển TasA vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử cũng xãy ra tương tự Khác với các loại protein tiết khác TasA sau khi được chuyển qua màng tế bào chất thì một phần không khuếch tán ra môi trường mà định vị trong lớp peptidoglycan của

vách tế bào Bacillus subtilis và bào tử (33) Vị trí của TasA bên trong vách tế bào và

màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính của enzyme cylic AMP phosphodiesterase

Domain T với cofactor là 4′-phosphopantetheine (ppan) thực hiện phản ứng hoạt hóa liên kết thioeste Domain C thực hiện phản ứng tạo liên kết este giữa 2 amino acid Trong những modul thực hiện hoạt hóa amino acid

có cấu hình D thì có thêm domain E chịu trách nhiệm chuyển amino acid từ cấu hình L sang cấu hình D (34) Cấu trúc của surfactin, quá trình điều hòa, cấu trúc của operon

srf, quá trình tổng hợp chuỗi amino acid của surfactin được thể hiện ở Hình 2.6 (phụ

lục)

Quá trình điều hòa và tổng hợp surfactin

Surfactin được tổng hợp để đáp ứng với nồng độ cao của vi sinh vật trong môi

trường, srf operon được được điều hòa dương bởi ComA Nhưng quá trình phosphoryl

hóa ComA được điều hòa bởi nhiều yếu tố khác nhau

Các modul của 3 enzyme SrfA, SrfB, SrfC được xắp xếp theo trình tự tương ứng với trình tự của amino acid của chuỗi peptide Khi quá trình bắt đầu Gyl sẽ gắn vào domain A của modul 1 để thực hiện phản ứng adenyl hóa sau đó được chuyển qua domain T để tạo phản ứng thioeste với cofactor 4′-phosphopantetheine Ở modul thứ 2 Leu được gắn vào domain A, domain C của modul 2 thực hiện phản ứng tạo liên kết este của Gly với gốc amine tự do của Leu sau đó được chuyển qua domain T của