1. Tính cấp thiết của đề tài Đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, là nơi có sự đa dạng về sinh học lớn nhất trên trái đất. Đây là nơi sinh sống của 34 trên 36 ngành động thực vật trên trái đất với hơn 300000 loài sinh vật đã được biết đến. Môi trường biển đã được biết đến như một nguồn phong phú cung cấp các hợp chất thiên nhiên, như một kho dược liệu khổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá. Đặc thù môi trường sống khắc nghiệt dưới biển sâu chính là điều kiện để hình thành các hợp chất hữu cơ với những đặc điểm cấu trúc hóa học độc đáo và hoạt tính sinh học quý giá. Việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp được sản sinh từ vi sinh vật biển trên thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể. Trong số đó có rất nhiều các hợp chất thứ cấp với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú. Đồng thời nhiều hợp chất trong số này đã đang được thử nghiệm sâu hơn nhằm ứng dụng trong y dược. Việt Nam nằm trong khu vực Thái Bình Dương (có chủ quyền biển với diện tích khoảng 1.000.000 km 2 ) có hệ sinh vật biển đa dạng và phong phú, có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển. Chính phủ Việt Nam đã có định hướng phát triển kinh tế biển, khai thác tài nguyên thiên nhiên và nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên từ biển. Tuy nhiên nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam mới chỉ được bắt đầu, có rất ít các nghiên cứu đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của nước ta là rất lớn. Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh của con người và động vật. Khoảng nửa sau thế kỷ 19, người ta đã phát hiện vi sinh vật chính là nguyên nhân gây ra các bệnh truyền nhiễm. Do đó liệu pháp hóa học nhằm vào các vi sinh vật gây bệnh đã được phát triển thành liệu pháp điều trị chính. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra Penicillin – hợp chất có hoạt tính kháng sinh mạnh và được Abraham, Chain, Florey tinh chế ở dạng ổn định có tác dụng chữa bệnh vào năm 1941. Thuốc kháng sinh Penicillin trở nên nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều người trong chiến tranh thế giới II. Kể từ đó, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kì sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực dược phẩm của thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ, với nhu cầu ngày càng tăng và lượng sản xuất ngày càng lớn. Hiện nay, đã có thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, mà xạ khuẩn chiếm phần lớn trong đó có các xạ khuẩn biển. Nhưng càng ngày càng nhiều các vi sinh vật gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Do vậy, rất cần phải tiếp tục nghiên cứu, tìm kiếm, phát hiện các loại kháng sinh mới, các hoạt chất có tính kháng lao, chống ung thư. Vì vậy chúng tôi thực hiện luận án này với tên đề tài: ‘‘Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261, G248 thu thập tại vùng biển miền Trung - Việt Nam”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phát hiện các hợp chất có hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào từ nguồn vi sinh vật đáy biển miền Trung của Việt Nam cụ thể: - Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy của 3 chủng vi sinh vật phân lập từ vùng biển miền Trung – Việt Nam. - Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này. 3. Các nội dung nghiên cứu của luận án - Tổng quan tài liệu về các nghiên cứu trước đây về các hợp chất thứ cấp cũng như hoạt tính sinh học từ các chủng vi sinh vật biển. - Tìm các quy trình xử lý dịch nuôi cấy để tạo dịch chiết. Tinh chế các cặn dịch chiết này trên sắc ký cột để thu được các phân đoạn. - Tinh chế các chất có trong các phân đoạn để thu được các hợp chất sạch. - Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch phân lập được. - Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các chất phân lập được. - Thử hoạt tính chống ung thư in vitro đối với một số dòng tế bào ung thư như KB, MCF-7, Hep-G2, Lu-1 của các hợp chất sạch phân lập được.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - CAO ĐỨC DANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG SINH, GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ BA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES G246, G261, G248 THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG - VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2019 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, nơi có đa dạng sinh học lớn trái đất Đây nơi sinh sống 34 36 ngành động thực vật trái đất với 300000 loài sinh vật biết đến Môi trường biển biết đến nguồn phong phú cung cấp hợp chất thiên nhiên, kho dược liệu khổng lồ chờ khai thác khám phá Đặc thù môi trường sống khắc nghiệt biển sâu điều kiện để hình thành hợp chất hữu với đặc điểm cấu trúc hóa học độc đáo hoạt tính sinh học quý giá Việc nghiên cứu hoạt chất thứ cấp sản sinh từ vi sinh vật biển giới thu nhiều thành tựu đáng kể Trong số có nhiều hợp chất thứ cấp với cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học lý thú Đồng thời nhiều hợp chất số thử nghiệm sâu nhằm ứng dụng y dược Việt Nam nằm khu vực Thái Bình Dương (có chủ quyền biển với diện tích khoảng 1.000.000 km2) có hệ sinh vật biển đa dạng phong phú, có tiềm to lớn tài nguyên biển Chính phủ Việt Nam có định hướng phát triển kinh tế biển, khai thác tài nguyên thiên nhiên nghiên cứu sản phẩm tự nhiên từ biển Tuy nhiên nghiên cứu hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển Việt Nam bắt đầu, có nghiên cứu công bố, nguồn đa dạng vi sinh vật biển nước ta lớn Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn bệnh người động vật Khoảng nửa sau kỷ 19, người ta phát vi sinh vật nguyên nhân gây bệnh truyền nhiễm Do liệu pháp hóa học nhằm vào vi sinh vật gây bệnh phát triển thành liệu pháp điều trị Năm 1928, Alexander Fleming phát Penicillin – hợp chất có hoạt tính kháng sinh mạnh Abraham, Chain, Florey tinh chế dạng ổn định có tác dụng chữa bệnh vào năm 1941 Thuốc kháng sinh Penicillin trở nên tiếng cứu sống nhiều người chiến tranh giới II Kể từ đó, kháng sinh trở thành dược phẩm thần kì sớm chiếm vị trí hàng đầu lĩnh vực dược phẩm giới, với kết ngày lạ, với nhu cầu ngày tăng lượng sản xuất ngày lớn Hiện nay, có thêm nhiều loại kháng sinh chiết xuất từ nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, mà xạ khuẩn chiếm phần lớn có xạ khuẩn biển Nhưng ngày nhiều vi sinh vật gây bệnh kháng với kháng sinh có Do vậy, cần phải tiếp tục nghiên cứu, tìm kiếm, phát loại kháng sinh mới, hoạt chất có tính kháng lao, chống ung thư Vì thực luận án với tên đề tài: ‘‘Nghiên cứu phân lập khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261, G248 thu thập vùng biển miền Trung - Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu Phát hợp chất có hoạt tính kháng sinh gây độc tế bào từ nguồn vi sinh vật đáy biển miền Trung Việt Nam cụ thể: - Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật phân lập từ vùng biển miền Trung – Việt Nam - Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chất phân lập làm sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng hợp chất Các nội dung nghiên cứu luận án - Tổng quan tài liệu nghiên cứu trước hợp chất thứ cấp hoạt tính sinh học từ chủng vi sinh vật biển - Tìm quy trình xử lý dịch ni cấy để tạo dịch chiết Tinh chế cặn dịch chiết sắc ký cột để thu phân đoạn - Tinh chế chất có phân đoạn để thu hợp chất - Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập - Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chất phân lập - Thử hoạt tính chống ung thư in vitro số dòng tế bào ung thư KB, MCF-7, Hep-G2, Lu-1 hợp chất phân lập CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sự phân bố tính đa dạng vi sinh vật biển 1.2 Xạ khuẩn hình thành hợp chất thứ cấp từ xạ khuẩn 1.3 Các họ xạ khuẩn biển thƣờng gặp 1.4 Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.4.1.1 Các hợp chất có hoạt tính kháng sinh 1.4.1.2 Các hợp chất có hoạt tính kháng lao 1.4.1.3 Các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu 2.1.3 Thiết bị 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 2.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn biển 2.2.3 Phương pháp làm chủng que cấy vòng 2.2.4 Phương pháp giữ giống xạ khuẩn sau phân lập 2.2.5 Phương pháp hoạt hố ni cấy 2.2.6 Phương pháp tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy để sàng lọc hoạt tính sinh học 2.2.7 Phương pháp định danh xạ khuẩn 2.2.8 Phương pháp sinh khối lượng lớn 2.2.9 Phương pháp phân lập hợp chất thứ cấp 2.2.10 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất tách chiết 2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 2.2.12 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 2.2.13 Phương pháp thử hoạt tính kháng lao CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Kết thu mẫu Đã thu thập 25 mẫu từ vùng biển miền trung Việt Nam, cụ thể: - Ở vùng biển Thanh Hóa thu mẫu trầm tích - Ở vùng biển Quảng Bình thu mẫu trầm tích, mẫu hải miên, mẫu rong, mẫu san hô Ở vùng biển Quảng Trị thu mẫu trầm tích, mẫu hải miên, mẫu rong - Ở vùng biển bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng thu mẫu trầm tích, mẫu hải miên, mẫu rong, mẫu da gai, mẫu có bao - Ở vùng biển Cù Lao Chàm, Quảng Nam thu mẫu trầm tích, mẫu da gai, mẫu thân mềm, mẫu thỏ biển, mẫu đuôi rắn 4 3.2 Kết phân lập chủng xạ khuẩn - Từ 25 mẫu thu thập vùng biển miền Trung Việt Nam, phân lập 32 chủng xạ khuẩn có hình thái màu sắc khuẩn lạc khác - Từ 12 mẫu thu thập vùng biển Thanh Hóa, Quảng Bình, Quảng Trị phân lập 12 chủng xạ khuẩn - Từ 13 mẫu thu thập vùng biển Đà Nẵng Quảng Nam, phân lập 20 chủng xạ khuẩn 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học chủng thu đƣợc Kết kháng VSVKĐ: 29/32 chủng có hoạt tính (xem chi tiết bảng 3.1) Kết sàng lọc hoạt tính kháng lao thực trường Đại học UIC chủng Mycobacterium tuberculosis H37Rv Kết cho thấy 21/32 chủng thể hoạt tính kháng lao, chủng thể hoạt tính tốt với giá trị % ức chế > 90%, chủng chủng thể hoạt tính tốt với giá trị % ức chế > 50% (xem chi tiết bảng 3.2) Cặn thô dịch chiết nuôi cấy 32 chủng nghiên cứu thử hoạt tính gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư người (KB - ung thư biểu mơ (CCL-17TM) Kết có 19 chủng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB ( xem chi tiết bảng 3.3) 3.4 Kết định danh chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học 3.4.1 Quan sát đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu 3.4.2 Nhân gen 16S ARN riboxom 3.4.3 Giải trình tự gen Trình tự nucleotit đoạn gen 16S ARN riboxom chủng G246, G261, G248 cho thấy chủng nghiên cứu thuộc chi Streptomyces sp (xem PLIII.1.4) 3.5 Kết sinh khối lƣợng lớn chủng có hoạt tính sinh học tốt Các chủng G246, G261, G248 có hoạt tính sinh học tốt tiến hành lên men lượng lớn 50 lít điều kiện phù hợp để tiến hành nghiên cứu 3.6 Tách chiết xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G246 3.6.1 Xử lý mẫu, tạo cặn chiết 3.6.2 Phân lập hợp chất từ cặn chiết Hình Sơ đồ phân lập cặn chiết chủng Streptomyces sp G246 3.6.3 Thơng số vật lí liệu phổ hợp chất phân lập từ chủng Streptomyces sp G246 3.7 Tách chiết xác định cấu trúc hóa học hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G261 3.7.1 Xử lý mẫu, tạo cặn chiết 3.7.2 Phân lập từ chủng Streptomyces sp G261 3.7.3 Thông số vật lý liệu phổ hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G261 3.8 Tách chiết xác định cấu trúc hóa học hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G248 3.8.1 Xử lý mẫu, tạo cặn chiết 3.8.2 Phân lập hợp chất từ cặn chiết Hình Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn chiết chủng Streptomyces sp G261 Hình 3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ chủng Streptomyces sp G248 3.8.3 Thông số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G248 3.9 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn 3.9.1 Kết thử hoạt tính VSVKĐ số hợp chất phân lập Trong số 26 chất phân lập, tiến hành thử hoạt tính kháng VSVKĐ Kết có 13 chất có hoạt tính kháng VSV kiểm định, có nhiều chất có hoạt tính mạnh G246-2, G248-11, G248-12, G248-9 nhiều chất có hoạt tính kháng nấm tốt G246-6, G261-11, G248-11 (xem chi tiết bảng 3.5) 3.9.2 Kết thử hoạt tính kháng lao số hợp chất phân lập Kết thử hoạt tính kháng lao thực trường Đại học UIC Một số chất thử nghiệm hoạt tính kháng lao với Mycobacterium tuberculosis H37Rv, G246-1 thể hoạt tính tốt với giá trị MIC = 6,00 µg/ml, G248-10 thể hoạt tính tốt với giá trị MIC = 11,17 µg/ml, G248-9 thể hoạt tính yếu với giá trị MIC = 48,02 µg/ml Các chất lại khơng thể hoạt tính nồng độ nghiên cứu (50 µg/ml) (xem chi tiết bảng 3.6) 3.9.3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập 14 hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ, kháng lao từ 03 chủng nghiên cứu (G246, G261 G248) thử hoạt tính gây độc tế bào với bốn dòng tế bào ung thư người: KB - ung thư biểu mô (CCL – 17TM); Hep G2 - ung thư gan (HB – 8065TM); MCF-7 - ung thư vú (HTB – 22TM) LU-1 - ung thư phổi (HTB-57TM) Kết trình bày chi tiết bảng 3.5 Kết có hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, có chất có hoạt tính với dòng tế bào KB, hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào ung thư gan HepG2, hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào Lu-1, hợp chất có hoạt tính với dòng tế bào MCF7 (xem chi tiết bảng 3.7) CHƢƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1 Kết thu mẫu Tổng số 25 mẫu bao gồm có: 12 mẫu vùng biển Thanh Hóa, Quảng Bình Quảng Trị; 13 mẫu vùng biển Đà Nẵng Quảng Nam Cụ thể có 10 mẫu trầm tích, mẫu rong, mẫu hải miên, mẫu san hô mềm, mẫu da gai mẫu khác 4.2 Kết phân lập chủng xạ khuẩn Từ 25 mẫu thu phân lập 32 chủng xạ khuẩn có hình thái màu sắc khuẩn lạc khác từ mẫu thu thập (chi tiết mô tả phụ lục PL III.1.2) 8 4.3 Kết thử hoạt tính sinh học chủng thu đƣợc - Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định với cặn thô thu cho thấy 29/32 chủng phân lập có tính kháng chủng VSVKĐ - Kết cho thấy 21/32 chủng thể hoạt tính kháng lao - Kết có 20 chủng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mơ KB (IC50 < 128 µg/ml) Từ kết sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ, hoạt tính kháng lao hoạt tính gây độc tế bào (với dòng KB) luận án tơi lựa chọn chủng phân lập có hoạt tính tốt để thực cho nghiên cứu (gồm chủng xạ khuẩn G246, G261, G248) 4.4 Kết định danh chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học 4.4.1 Quan sát đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu 4.4.2 Nhân gen 16S ARN riboxom 4.4.3 Giải trình tự gen xác định tên chủng xạ khuẩn Đã xác định chủng G246, G261, G248 thuộc chi Streptomyces sp (Xem chi tiết PLIII.1.4) 4.5 Kết sinh khối lƣợng lớn chủng có hoạt tính sinh học tốt Đã lên men thành công lượng lớn 50 lít cho chủng G246, G261, G248 để tiếp tục nghiên cứu 4.6 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G246 Từ dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật Streptomyces sp G246, chúng tơi phân lập xác định cấu trúc hóa học 10 hợp chất, có hợp chất G246-1 G246-2 Cấu trúc hợp chất xác định phương pháp phổ NMR, MS so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất xác định (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′-tetrahydroxylchalcone (G246-1), (G246-2), (2″S)-5′- cyclo-(Pro-Gly) (G246-3), cyclo-(L-Pro-L-Tyr) (G246-4), cyclo-(D-Pro-L-Tyr) (G246-5), cyclo-(ProAla) (G246-6), norharman (G246-7), tryptophan (G246-8), 3-indol carboxylic acid (G246-9), phenyl alanin (G246-10), có chất G246-1 G246-2 Cấu hình tuyệt đối hợp chất G246-1 G246-2 xác định dựa vào phương pháp tính tốn lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa phần mềm Gaussian 09 9 Hình 4.28 Cấu trúc hóa học hợp chất G246-1 đến G246-10 Dưới trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 4.6.1 Hợp chất G246-1: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′- trihydroxylflavanone (hợp chất mới) Hình 4.1 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) hợp chất G246-1 cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo Hợp chất G246-1 phân lập dạng chất rắn vô định hình màu trắng, độ quay cực [α]25D = - 28 (c 0,8, MeOH) Phổ khối phân giải cao hợp chất cho pic phân tử proton hóa m/z 439,2115 [M+H]+ tính tốn lý thuyết cho cơng thức phân tử C26H31O6 (m/z 439,2121), kết hợp với phổ 13 C-NMR xác định cơng thức phân tử G246-1 C26H30O6 Phổ IR G246-1 có đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxyl (νmax 3299 cm-1) carbonyl (νmax 1670 cm-1) Trên phổ 1H-NMR, vùng aromatic có xuất tín hiệu hệ ABX δH 6,35 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-3′), 6,37 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-5′), 7,31 (1H, d, J = 8,5 Hz, H6′) proton singlet δH 6,13 (1H, H-8) Ngoài ra, phổ 1H-NMR có tín hiệu proton dạng đỉnh double doublet H 2,71 (1H, dd, J = 2,5; 16,5, H-3ax), 2,89 (1H, dd, J = 13,0; 16,5, H-3eq), 5,56 (1H, dd, J = 2,5; 12,5, H-2) tín hiệu đặc trưng cho vị trí 10 nhóm methylene CH2-3 proton H-2 flavanone Thêm vào tín hiệu cộng hưởng nhóm methoxy H 3,83, ba nhóm methyl singlet H 1,97, 1,98 1,65, proton olefinic H 4,98, 4,54 4,59 proton thuộc vùng aliphatic Phân tích phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT, HSQC cho biết phân tử G246-1 có 26 nguyên tử cacbon bao gồm nhóm ketone C 193,9, năm nhóm methine sp2 C 93,4; 103,4; 103,7; 128,5; 132,0, nhóm methylene sp2 C 111,2, hai nhóm methine sp3 C 48,2; 75,5, ba nhóm methylene sp3 C 28,2; 32,4; 48,2, ba nhóm methyl C 17,8; 19,2; 25,9, nhóm methoxy C 55,9 10 cacbon sp2 không liên kết trực tiếp với hydro Bên cạnh hệ aromatic ABX, hai hệ tương tác spin-spin ghi nhận phổ COSY: H-2/CH2-3 (I) CH2-1″/H-2″/CH2-3″/H-4″ (II) Độ chuyển dịch hóa học nguyên tử cacbon C 75,5 (C-2), 156,6 (C-2′), 159,5 (C-4′), 164,9 (C-5), 161,9 (C-7) 164,9 (C-9) gợi ý đến chúng liên kết với nguyên tử oxy Trên phổ HMBC cho thấy tương tác proton nhóm CH3-10″ CH2-9″ với C-2″ tương tác proton nhóm CH2-1″ với C-8″ chứng tỏ kết nối C-2″ hệ spin II với nhóm isopropenyl Tiếp theo, tương tác HMBC H-4″ với C-6″ C7″, tương tác CH2-3″ với C-5″ có mặt nhóm lavandulyl cấu trúc G246-1 Sự có mặt vòng B khẳng định tương tác H-3′ với C-1′, C-2′, C4′ C-5′ Tương tự, vòng A thiết lập dựa tương tác HMBC H-8 với C-6, C7, C-9 C-10 Các đặc trưng phổ hệ spin I tương tác proton hệ spin với nhóm carbonyl (C 193,9) phổ HMBC chứng tỏ G246-1 flavanone Sự kết nối nhóm lavandulyl với vòng A C-6 chứng minh dựa tương tác HMBC proton CH2-1″ với C-5, C-6 C-7 Cuối cùng, tương tác phổ HMBC proton thuộc nhóm methoxy H 3,85 với C-7(C 161,9) tương tác NOESY nhóm 7-OCH3 với H-8 cho phép xác định vị trí nhóm methoxy C-7 Như từ liệu phổ 1D 2D-NMR hợp chất G246-1 chất tham khảo sophorflavanone G [89] xác định G246-1 6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′trihydroxylflavanone Phổ CD G246-1 cho hiệu ứng Cotton dương 336 nm (Δ +2,98 mdeg) hiệu ứng Cotton âm 292 nm (Δ - 9,08 mdeg), cho phép xác định cấu hình tuyệt đối C-2 2S [89] Cấu hình tuyệt đối vị trí C-2″ G246-1 xác định dựa vào phương pháp tính tốn lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa phần mềm Gaussian 09 Tính tốn lý thuyết cho đồng phân 2S,2″S- 11 2S,2″R- cho phép xác định cấu hình 2S,2″S hợp chất G246-1 phù hợp với mơ hình tính tốn (xem hình 4.10) Từ phân tích phổ khối, phổ IR, 1D 2D NMR, phổ CD kết hợp với phương pháp tính tốn lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECDElectronic Circular Dichroism) thiết lập nên cấu trúc G246-1, hợp chất xác định (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất G246-1 hợp chất tham khảo Vị trí 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 7′′ 8′′ 9′′ 10′′ OMe C#,b Ca 75,3 42,8 75,5 48,2 198,2 163,0 96,2 165,3 107,8 162,1 103,2 117,9 156,1 103,4 159,4 107,8 128,6 27,7 47,8 31,9 124,5 131,6 17,9 25,8 149,1 111,2 193,9 164,9 109,6 161,9 93,4 164,9 105,7 118,5 156,6 103,4 159,5 107,6 128,5 28,2 48,2 32,4 124,8 132,0 17,8 25,9 149,8 111,2 19,1 19,2 55,9 H (độ bội, J, Hz) 5,56 (dd, 2,5; 13,0) 2,89 (dd, 13,0; 16,5) 2,71 (dd, 2,5; 16,5) 6,13 (s) 6,35 (d, 2,0) 6,37 (dd, 2,0; 8,5) 7,31 (d, 8,5) 2,64 (m) 2,52 (m) 2,02 (m) 4,98 (t, 6,5) 1,97 (s) 1,98 (s) 4,54 (s) 4,59 (s) 1,65 (s) 3,84 (s) a) đo CD3OD; b) đo CD3COCD3; δC# số liệu hợp chất sophoraflavanone G [89] 12 4.6.2 Hợp chất G246-2: tetrahydroxylchalcone (hợp chất mới) (2″S)-5′-lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′- Hình Cấu trúc hóa học tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) hợp chất G246-2 cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo G246-1 Hợp chất G246-2 thu dạng chất rắn vơ định hình màu trắng, độ quay cực [α]25D = -8,6 (c 0,25, CH2Cl2) Phổ khối phân giải cao pic ion giả phân tử m/z 439,2115 [M+H]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức phân tử C26H31O6 với m/z 439,2121), kết hợp với liệu phổ 13 C-NMR gợi ý đến công thức phân tử C26H30O6 cho hợp chất G246-2 So sánh liệu phổ 1D-NMR hợp chất với liệu phổ NMR G246-1 cho thấy hợp chất G246-2 có nhóm lavandulyl hệ vòng A, B hợp chất G246-1 Sự khác hai hợp chất hệ CH=CH thay tín hiệu hệ spin thứ (CH-2/CH2-3) G246-1 Các phân tích gợi ý đến khung chalcone G246-2, điều khẳng định dựa tương tác H- với C-2, C-6 C-γ phổ HMBC G246-2 Nhóm lavandulyl gắn vào khung chalcone vị trí C-5′ dựa tương tác HMBC H1″ với C-5′ (δC 107,4), C-6′ (δC 165,8), C4′(δC 161,1) tương tác HMBC H-2″ với C-5′ (δC 107,4), C-8″(δC 150,5), C-9″(δC 110,5) Tương tự, tương tác HMBC proton thuộc nhóm methoxy H 3,85 với C-4′ (δC 161,0) xác định vị trí nhóm methoxy C-4′ khung chalcone Cấu hình tuyệt đối vị trí C-2″ hợp chất G246-2 xác định dựa vào phương pháp tính tốn lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa phần mềm Gaussian 09 tương tự hợp chất G246-1 Tính tốn lý thuyết cho đồng phân 2″S- 2″R- cho phép xác định cấu hình 2″S hợp chất G246-2 phù hợp với mơ hình tính tốn Kết hợp phân tích phổ so sánh với hợp chất G246-1 xác định G246-2 (2″S)-5′-lavandulyl4′-methoxy-2,4,2′,6′-tetrahydroxylchalcone, hợp chất 13 Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất G246-2 chất so sánh G246-1 C# C#,b C Ca H (độ bội, J, Hz) 1′ 118,5 116,5 2′ 156,6 156,9 3′ 103,4 106,2 4′ 159.5 159,1 5′ 107,6 109,1 6,43 (br d, 8,0) 6′ 128,5 131,0 7,39 (d, 8,0) 10 105,7 1′ 106,2 164,9 2′ 161,0 93,4 3′ 90,9 161,9 4′ 161,0 109,6 5′ 107,4 164,9 6′ 165,8 1′′ 28,2 1′′ 29,7 6,37 (br,s) 5,92 (s) 2,70 (dd, 6,0; 14,0) 2,71 (dd, 8,0; 14,0) 2′′ 48,2 2′′ 46,5 2,39 (m) 3′′ 32,4 3′′ 31,9 2,14 (m) 4′′ 124,8 4′′ 122,8 5′′ 132,0 5′′ 132,9 6′′ 17,8 6′′ 18,0 1,60 (s) 7′′ 25,9 7′′ 25,8 1,69 (s) 8′′ 149,8 8′′ 150,5 9′′ 111,2 9′′ 110,7 10′′ 19,2 10′′ 20,7 OH-6′ 5,11 (t, 6,5) 4,76 (s)/ 4,79 (s) 1,72 (s) 14,46 (s) OMe 55,9 OMe 55,7 3,85 (s) 48,2 α 126,0 7,82 (d, 16,0) 75,5 β 137,5 7,96 (d, 16,0) 193,9 γ 193,2 a) đo CDCl3; b) đo CD3OD; δC# số liệu hợp chất G246-1 14 4.7 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G261 Hình Cấu trúc hóa học hợp chất G261-1 đến G261-13 Từ dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật Streptomyces sp G261 phân lập xác định cấu trúc hóa học 13 hợp chất: norharman (G261-1), 2,3-butanediol (G2612), 1H-pyrrole-2-carboxylic acid (G261-3), 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4carboxylic acid (G261-4), 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid (G261-5), 2- acetamidobenzamide (G261-6), phenyl alanin (G261-7), cyclo-(Pro-Gly) (G261-8), cyclo-(Pro-Ala) (G261-9), cylo-(Pro- Leu) (G261-10), cyclo-(Pro-Tyr) (G261-11), cyclo-trans-4-OH-(Pro-Phe) (G261-12), cyclo-(Leu-Tyr) (G261-13), có chất lần đầu phân lập từ tự nhiên 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid (G261-4) Dưới trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất G261-4 hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên 4.7.1 Hợp chất G261-4: 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid Hình 4.32 Cấu trúc hóa học tương tác phổ HMBC G261-4 15 Phổ khối ESI-HRMS G261-4 cho pic ion giả phân tử m/z 178,0152 [M-H](tính tốn lý thuyết cho cơng thức phân tử C8H4NO4 m/z 178,0140) Phổ 1H-NMR thấy xuất tín hiệu proton vòng thơm δH 7,24 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-7); 7,23 (1H, dd, J = 8,0; 8,0 Hz, H-6); 7,49 (1H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz, H-5) Phổ 13C-NMR kết hợp với HSQC cho thấy nhóm methine vòng thơm δC 118,1 (C-5); 123,6 (C-7); 126,4 (C-6); cacbon bậc bốn sp2 δC 116,7 (C-4); 144,2 (C-3); 146,5 (C-7a); Ngồi thấy xuất nhóm cabonyl vùng trường thấp gắn với dị tố nitơ δC 149,2 nhóm cacbonyl δC 163,4 Trên phổ HMBC thấy có tương tác xa proton H-5 (δH 7,49) với C-4 (δC 116,7); C-3a (δC 144,2) C=O (δC 163,4) tương tác proton H-7 (δH 7,24) với C-7a (δC 146,5), C-6 (δC 123,6) Kết hợp liệu phổ so sánh với tài liệu tham khảo [102] cho phép xác đinh G261-4 2-oxo-2,3dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid Đây hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên [103] 4.8 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G248 Hình 4.81 Cấu trúc hóa học hợp chất G248-1 đến G248-13 Từ dịch chiết nuôi cấy chủng xạ khuẩn biển Streptomyces sp G248, phương pháp sắc ký phương pháp phổ MS, 1D-NMR, 2D-NMR phân lập xác định cấu trúc hóa học 13 hợp chất ký hiệu từ G248-1 đến G248-13 gồm cyclo 16 (Pro – Leu) (G248-1), cyclo-(Pro-Phe) (G248-2), norharman (G248-3), cyclo-(Pro-Tyr) (G248-4), cyclo-(Pro-Gly) (G248-5), cyclo-(Pro-Trp) (G248-6), Adenine (G248-7), 2(4-hydroxyphenyl)acetic acid (G248-8), (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′dihydroxylflavanone (G248-9), (2S)-6-prenyl-4′-methoxy-5,7-dihydroxylflavanone G248-10, (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′-tetrahydroxylflavanone (G248-11), (2″S)-5′lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′-tetrahydroxylchalcone (G248-12), (2S,2″S)-6- lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone (G248-13) Trong có hợp chất G248-9, G248-11, G248-12 thuộc loại hợp chất flavonoids Dưới trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 4.8.1 Hợp chất G248-9: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′- dihydroxylflavanone Hình Cấu trúc hóa học tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) hợp chất G248-9 cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo Hợp chất G248-9 phân lập dạng chất rắn vơ định hình, màu vàng, độ quay cực [α]25D –5 (c 0,8, MeOH) Phổ khối HR-ESI-MS hợp chất cho pic phân tử proton hóa m/z 453,2270 [M+H]+ (số khối tính tốn cho cơng thức phân tử C27H33O6 453,2277), kết hợp với phổ 13C-NMR xác định công thức phân tử G248-9 C27H32O6 Phổ IR G248-9 có đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxyl (νmax 3433 cm-1) carbonyl (νmax 1648 cm-1) Dữ liệu phổ NMR hợp chất G248-9 giống với hợp chất G246-1, khác thấy xuất thêm nhóm methoxy Giống hợp chất G246-1, phổ 1H-NMR hợp chất G248-9 có tín hiệu proton aromatic δH 6,47 (1H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H5′), 6,49 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-3′), 7,38 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6′), 6,12 (1H, s, H-8) tín hiệu proton đặc trưng cho vị trí nhóm methylene CH2-3 proton H-2 flavanone H 2,67 (1H, dd, J = 2,5; 17,0 Hz, H-3ax), 2,89 (1H, dd, J = 13,5; 17,0 Hz, H3eq), 5,55 (1H, dd, J = 2,5; 13,0 Hz, H-2) Ngồi ra, tín hiệu nhóm lavandulyl nhóm methoxy quan sát thấy phổ 1H-NMR (xem bảng 4.18) Phân tích phổ 17 13 C-NMR kết hợp với HSQC cho biết phân tử G248-9 có 27 cacbon bao gồm nhóm ketone (C 193,6), 10 cacbon bậc sp2 C 164,7; 109,6; 161,9; 165,4; 105,6; 119,7; 160,1; 132,0; 149,8; 159,0, năm nhóm methine sp2 C 93,6; 99,8; 108,1; 128,5; 124,8, nhóm methylene sp2 C 111,2; hai nhóm methine sp3 C 48,2; 75,0, ba nhóm methylene sp3 C 28,2; 32,3; 45,4, ba nhóm methyl C 17,8; 25,8; 19,1 hai nhóm methoxy C 55,9 Bên cạnh hệ aromatic ABX, hai hệ tương tác spin-spin ghi nhận phổ COSY: H-2/CH2-3 (I) CH2-1″/H-2″/CH2-3″/H-4″ (II) Độ chuyển dịch hóa học nguyên tử cacbon C 75,0 (C-2), 160,1 (C-2′), 159,0 (C-4′), 164,7 (C-5), 161,9 (C-7) 165,4 (C-9) gợi ý đến chúng liên kết với nguyên tử oxy Trên phổ HMBC, nhìn thấy tín hiệu tương tác proton thuộc nhóm CH3-10″ CH2-9″ với C-2″, tương tác HMBC proton nhóm CH2-1″ với C-8″ chứng tỏ kết nối C-2″ hệ spin II với nhóm isopropenyl Tiếp theo, tương tác H-4″ với C-6″ C-7″, tương tác CH2-3″ với C-5″ có mặt nhóm lavandulyl cấu trúc G248-9 Sự có mặt vòng B khẳng định tương tác H3′ với C-1′, C-2′, C-4′ C-5′ Tương tự, vòng A thiết lập dựa tương tác HMBC H-8 với C-6, C-7, C-9 C-10 Các đặc trưng phổ hệ spin I tương tác proton hệ spin với nhóm carbonyl (C 198,5) phổ HMBC chứng tỏ G248-9 flavanone Sự kết nối nhóm lavandulyl với vòng A C-6 qua C-6/C1″ chứng minh dựa tương tác HMBC proton CH2-1″ với C-5, C-6 C7 Cuối cùng, nhóm methoxy H 3,83 tương tác HMBC với C-7(C 161,9), C-8 (C 93,6) tương tác ROESY proton nhóm methoxy với H-8, điều xác định vị trí nhóm C-7 nhóm methoxy H 3,82 tương tác HMBC với C-4′(C 159,0) tương tác ROESY proton nhóm methoxy với H-3′, H-5′ giúp ta xác định vị trí nhóm C-4′ Từ liệu phổ MS, 1D, 2D –NMR G248-9 so sánh với chất tham khảo G246-1 khẳng định cấu trúc G248-9 6-lavandulyl-7,4′dimethoxy-5,2′-dihydroxylflavanone Phổ CD G248-9 cho hiệu ứng Cotton dương 336 nm (Δ +2,7) hiệu ứng Cotton âm 292 nm (Δ - 8,5), cho phép xác định cấu hình tuyệt đối C-2 2S [90] Cấu hình tuyệt đối vị trí C-2″ G248-9 xác định dựa vào phương pháp tính tốn lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa phần mềm Gaussian 09 Tính tốn lý thuyết cho đồng phân 2S,2″S- 2S,2″R- cho phép xác định cấu hình 2S,2″S hợp chất G248-9 phù hợp với mơ hình tính tốn (Hình 66) Từ phân tích HR-ESI-MS, phổ IR, 1D 2D 18 NMR, phổ CD ECD thiết lập nên cấu trúc G248-9 (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′dimethoxy-5,2′-dihydroxylflavanone Tra cứu sở liệu Scifinder cho phép kết luận hợp chất Bảng Dữ liệu phổ NMR hợp chất G248-9 hợp chất tham khảo G246-1 Vị trí C#,a Ca H (độ bội, J, Hz) 75,5 75,0 5,55 (dd, 2,5; 13) 48,2 45,4 2,67 (dd, 2,5; 17,0) 2,89 (dd, 13,5; 17,0) 193,9 193,6 164,9 164,7 109,6 109,6 161,9 161,9 93,4 93,6 164,9 165,4 10 105,7 105,6 1′ 118,5 119,7 2′ 156,6 160,1 3′ 103,4 99,8 4′ 159,5 159,0 5′ 107,6 108,1 6,47 (dd, 2,0; 8,5) 6′ 128,5 128,5 7,38 (d, 8,5) 1′′ 28,2 28,2 2,63 (m) 2′′ 48,2 48,2 2,50 (m) 3′′ 32,4 32,3 2,02 m 4′′ 124,8 124,8 5′′ 132,0 132,0 6′′ 17,8 17,8 1,48 (s) 7′′ 25,9 25,8 1,57 (s) 8′′ 149,8 149,8 9′′ 111,2 111,2 10′′ 19,2 19,1 1,64 (s) OMe 55,9 55,9 3,83 (s) 55,9 3,82 (s) OMe a) đo CD3OD; δC# 6,12 (s) 6,49 (d, 2,0) 4,96 (t, 5,5) 4,52 (s)/ 4,59 (s) số liệu hợp chất tham khảo G246-1 19 4.8.2 Hợp chất G248-12: (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′- tetrahydroxylchalcone Hình Cấu trúc hóa học, tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) hợp chất G248-12 cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo Hợp chất G248-12 thu dạng chất rắn vơ định hình màu vàng, độ quay cực [α]25D -1,8 (c 0,54, CH2Cl2) Phổ khối phân giải cao pic ion giả phân tử m/z 439,2115 [M+H]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức phân tử C26H31O6 439,2121), kết hợp với liệu phổ 13C-NMR gợi ý đến công thức phân tử C26H30O6 cho hợp chất G248-12 So sánh liệu phổ 1D-NMR hợp chất G248-12 với liệu phổ NMR Kuraridin phân lập từ loài Sophora flavescen [115] cho thấy hợp chất giống (xem bảng 4.23) Từ liệu phổ 1D- NMR 2D-NMR hợp chất G248-12 so sánh với chất tham khảo Kuraridin [115] G246-2 giúp ta xác định cấu trúc phẳng G248-12 5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′tetrahydroxylchalcone Tuy nhiên hai hợp chất có độ quay cực khác nên mặt cấu trúc lập thể hợp chất G248-12 khác với kuraridin (có độ quay cực [α]25D −25.5 (c 0,1, MeOH) Cấu hình tuyệt đối vị trí C-2″ G248-12 xác định dựa vào phương pháp tính tốn lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD Electronic Circular Dichroism) dựa phần mềm Gaussian 09 Tính tốn lý thuyết cho đồng phân 2″S- 2″R- cho phép xác định cấu hình 2″S hợp chất G248-12 phù hợp với mơ hình tính tốn (Hình 76) Kết hợp phân tích phổ 1D, 2D-NMR phổ CD ECD xác định G248-12 (2″S)-5′-lavandulyl-2′methoxy-2,4,4′,6′-tetrahydroxylchalcone Tra cứu sở liệu Scifinder cho phép kết luận hợp chất 20 Bảng 4 Dữ liệu phổ NMR hợp chất G248-12 hợp chất tham khảo Vị trí 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 7′′ 8′′ 9′′ 10′′ OMe α β γ Ca (G246-2) 116,5 156,9 106,2 159,1 109,1 131,0 106,2 161,0 90,9 161,0 107,4 165,8 29,7 46,5 31,9 122,8 132,9 18,0 25,8 150,5 110,7 *Ca (Kuraridin) 125,0 160,3 103,7 162,4 108,9 131,6 108,9 164,0 91,6 162,4 116,3 166,6 28,2 48,0 32,4 125,0 131,8 17,9 25,9 149,9 111,1 124,4 160,3 103,7 162,4 109,0 131,6 108,8 164,0 91,6 162,3 116,2 166,6 28,2 48,0 32,4 125,0 131,8 17,9 25,9 149,9 111,1 20,7 55,7 126,0 137,5 193,2 19,0 56,1 125,5 139,8 194,8 19,0 56,0 125,4 139,8 194,7 # Ca H (độ bội, J, Hz) 6,37 (d, 2) 6,36 (m) 7,42 (d, 8,0) 6,02 (s) 2,64 (m) 2,57 (m) 2,10 (m) 5,06 (m) 1,58 (s) 1,65 (s) 4,55 (d, 2,5) 4,61 (dd, 2,5; 1) 1,72 (s) 3,91 (s) 7,96 (d, 16,0) 8,02 (d, 16,0) # a) đo CD3OD; δC, *δC số liệu hợp chất tham khảo G246-2 kuraridin [115] Nhận xét chung hợp chất thứ cấp tách chiết từ chủng xạ khuẩn biển nghiên cứu: Từ chủng xạ khuẩn thể hoạt tính kháng VSVKĐ hoạt tính gây độc tế bào bao gồm G246, G261, G248 phân lập xác định cấu trúc hóa học 36 hợp chất Tuy nhiên có nhiều hợp chất giống nên thực tế thu 26 hợp chất khác Trong có hợp chất thuộc lớp chất flavonoids, hợp chất thuộc lớp chất dicyclopeptid hợp chất indol hợp chất khác Các hợp chất G246-1, G246-2, G248-9, G248-11, G248-12 thuộc lớp chất flavonoids 21 4.9 Biện luận kết thử hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn 4.9.1 Kết thử hoạt tính VSV kiểm định số hợp chất Có 26 hợp chất phân lập được thử hoạt tính chủng VSVKĐ bao gồm chủng vi khuẩn Gram âm: E coli ATCC25922, P aeruginosa ATCC27853, S enterica ATCC13076; chủng vi khuẩn Gram dương: E faecalis ATCC29212, S aureus ATCC25923, B cereus ATCC 13245 chủng nấm C albicans ATCC10231 Kết cho thấy 13 hợp chất kháng vi sinh vật kiểm định, có hợp chất có hoạt tính mạnh hợp chất G246-2, G246-6, G248-12, G248-9 phân lập từ chủng Streptomyces sp (G246, G248) có vùng biển Đà Nẵng, Quảng Nam Đặc biệt hợp chất G246-2, G248-9, G248-11, G248-12 thể hoạt tính mạnh chủng VSVKĐ thử nghiệm, hợp chất G246-1, G246-2, G248-11, G248-12, G248-9 thể hoạt tính kháng VSVKĐ mạnh, hợp chất G248-11 có hoạt tính kháng VSVKĐ đáng quan tâm với giá trị MIC (µg/ml) với chủng VSVKĐ Riêng hợp chất G248-12 thể hoạt tính mạnh chủng VSVKĐ Có chất có khả ức chế chủng vi khuẩn Gram (-) E coli, số hợp chất G248-12 ức chế chủng vi khuẩn Gram (-) E coli mạnh với giá trị MIC = (µg/ml) Ngoài ra, hợp chất G246-2, G246-6, G248-11, G248-12, G248-9 thể hoạt tính ức chế nấm tốt với giá trị MIC 8, 2, 1, 16, 16 µg/ml (Xem bảng 3.5) 4.9.2 Kết thử hoạt tính kháng lao số hợp chất Một số hợp chất phân lập được khảo sát hoạt tính kháng lao với vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Rv Tuy nhiên, hầu hết hợp chất hoạt tính, ngoại trừ hợp chất G246-1 thể hoạt tính mạnh với giá trị MIC = 6,00 µg/ml, hợp chất G248-9 có hoạt tính yếu với giá trị MIC = 48,02 µg/ml điều cấu trúc hai hợp chất G246-1 G248-9 khác vị trí 4' vòng B khung flavanone, hợp chất G248-10 thể hoạt tính tốt với giá trị MIC = 11,17 µg/ml Các hợp chất phân lập từ chủng G246, G248 có vùng biển Đà Nẵng Việt Nam (xem bảng 3.7) 4.9.3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập 14 hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ, kháng lao phân lập từ chủng G246, G261, G248 thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư 22 KB, Lu, Hep-G2 MCF7 Kết có 12 hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, có chất có hoạt tính với dòng tế bào KB, 10 hợp chất có hoạt tính với 10 dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, chất với dòng tế bào Lu, chất với dòng tế bào MCF7 Hợp chất G246-1, G248-10 có hoạt tính mạnh dòng tế bào ung thư biểu mô KB với giá trị IC50 11,05, 5,65 µM Hợp chất G246-1, G246-2, G246-10 có hoạt tính mạnh dùng tế bào ung thư gan Hep-G2 với giá trị IC50 5,18; 6,51; 5,65 µM Các hợp chất G246-1, G248-10 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư KB, Hep-G2, Lu-1 với giá trị IC50 nằm khoảng 5,18 đến 11,05 µM (xem chi tiết bảng 3.6) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * KẾT LUẬN Các kết luận án đạt là: Đã phân lập 32 chủng xạ khuẩn từ 25 mẫu thu thập vùng biển (Thanh Hóa, Quảng Bình, Quảng Trị, Đà Nẵng, Quảng Nam) sàng lọc hoạt tính sinh học 32 chủng xạ khuẩn phân lập Đã lựa chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính tốt để thực nghiên cứu tiếp theo, gồm chủng G246, G248 thu thập bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng, chủng G261 thu thập Cù Lao Chàm, Quảng Nam Đã định danh chủng (G246, G261, G248) giải trình tự gen 16S rARN chúng thuộc chi Streptomyces Đã tiến hành nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hóa học 36 hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261 G248 thu 10, 13 13 hợp chất Trong có hợp chất khung flavonoid (2S,2″S)-6-lavandulyl7-methoxy-5,2′,4′-trihydroxylflavanone (G246-1), 2,4,2′,6′-tetrahydroxylchalcone (G246-2), (2″S)-5′-lavandulyl-4′-methoxy- (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′- dihydroxylflavanone (G248-9), (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′-tetrahydroxylflavanone (G248-11), (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′-tetrahydroxylchalcone (G248-12) hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4carboxylic acid (G261-4) Các hợp chất phân lập được khảo sát hoạt tính sinh học Trong đó, hợp chất (G246-1, G246-2, G246-4, G246-6) phân lập từ chủng Streptomyces sp G246, hợp chất (G261-1, G261-4, G261-10, G261-13) phân lập từ chủng Streptomyces sp 23 G261, hợp chất (G248-2, G248-7, G248-9, G248-11, G248-12) phân lập từ chủng Streptomyces sp G248 thể hoạt tính kháng VSVKĐ Đặc biệt hợp chất G246-2, G248-11 có hoạt tính kháng VSVKĐ mạnh Đối với hoạt tính kháng lao, có hợp chất G246-1 thể hoạt tính tốt Mycobacterium tuberculosis H37Rv với giá trị MIC 6,00 μg/ml Ngoài ra, 14 hợp chất đánh giá hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư (KB, Lu-1, Hep-G2 MCF7) Hợp chất G246-2, G248-10 thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư biểu mơ KB với giá trị IC50 11,05, 5,65 µM, hợp chất G246-1, G248-10 thể hoạt tính gây độc tế bào tốt dòng tế bào ung thư KB, Hep-G2, Lu-1 với giá trị IC50 nằm khoảng 5,65 đến 11,05 µM * KIẾN NGHỊ - Cần mở rộng nghiên cứu khu vực biển khác nước ta nhằm phát chủng vi sinh vật biển có khả sản sinh hợp chất có hoạt tính sinh học cao, nhằm nghiên cứu ứng dụng Đồng thời cần tiếp tục nghiên cứu chủng xạ khuẩn phân lập được, điều kiện lên men nhằm tìm kiếm chất có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, kháng lao gây độc tế bào mà khuôn khổ luận án chưa có điều kiện nghiên cứu - Cần có nghiên cứu hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ, kháng lao hoạt tính gây độc tế bào mạnh hợp chất G246-1, G246-2, G248-11 tiếp tục thử hoạt tính in vitro sâu hơn, nghiên cứu chế tác dụng NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Từ 25 mẫu vật thu thập số vùng biển miền Trung, Việt Nam, nghiên cứu có hệ thống phân lập, nuôi cấy sàng lọc chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học, kết quả: 29/32 chủng kháng vi sinh vật kiểm định, 21/32 chủng kháng lao, 20/32 chủng có hoạt tính gây độc tế bào KB - Đã lựa chọn chủng xạ khuẩn (G246, G261, G248) có hoạt tính sinh học tốt, xác định tên khoa học lên men lượng lớn (50 lít) để thực nghiên cứu - Đã phân lập hợp chất (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′trihydroxylflavanone (G246-1), (2″S)-5′-lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′- 24 tetrahydroxylchalcone (G246-2), (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′- dihydroxylflavanone (G248-9), (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′-tetrahydroxylflavanone (G248-11), (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′-tetrahydroxylchalcone (G248-12) có chất lần đầu phân lập từ tự nhiên 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4carboxylic acid (G261-4) - Các hợp chất phân lập có hoạt tính sinh học tốt Đặc biệt hợp chất G246-2, G248-11 có hoạt tính kháng VSVKĐ mạnh Hợp chất G246-1 thể hoạt tính tốt Mycobacterium tuberculosis H37Rv với giá trị MIC 6,00 μg/ml Hợp chất G246-1 thể hoạt tính gây độc tế bào tốt dòng tế bào ung thư KB, Hep-G2, Lu-1 với giá trị IC50 nằm khoảng 5,18 đến 11,05 µM DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Duc Danh Cao, Thi Quynh Do, Huong Doan Thi Mai, Quyen Vu Thi, Hong Minh Le Thi, Dang Thach Tran, Van Minh Chau, Cong Thung Do and Van Cuong Pham, Antimicrobial Lavandulated Flavonoids from a Sponge-Derived Actinomycete, Natural Product Research, 2018, doi: 10.1080/14786419.2018.1538219 (Online) Duc Danh Cao, Thi Thanh Van Trinh, Huong Doan Thi Mai, Van Nam Vu, Hong Minh Le, Quyen Vu Thi, Mai Anh Nguyen, Thu Trang Duong, Dang Thach Tran, Van Minh Chau, Rui Ma, Gauri Shetye, Sanghyun Cho, Brian T Murphy and Van Cuong Pham, Antimicrobial Lavandulylated Flavonoids from a Sponge-Derived Streptomyces sp G248 in East Vietnam Sea, Marine Drugs, 2019, 17(9), 529-542 doi:10.3390/md17090529 Cao Duc Danh, Cao Duc Tuan, Vu Thi Quyen, Nguyen Mai Anh, Doan Thi Mai Huong, Pham Van Cuong, Chau Van Minh, Le Thi Hong Minh, Identification and antimicrobial activity of actinomycetes strain isolated from marine samples in the coastal area of Thanh Hoa – Quang Binh – Quang Tri, Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 56 (4), 424-433 Cao Duc Danh, Phi Thi Dao, Doan Thi Mai Huong, Tran Dang Thach, Nguyen Mai Anh, Le Thi Hong Minh, Tran Tuan Anh, Pham Van Cuong, Cyclopeptides from marine actinomycete Streptomyces sp G261, Vietnam Journal of Chemistry, 2018, 56(5), 570-573 ... miền Trung Việt Nam cụ thể: - Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật phân lập từ vùng biển miền Trung – Việt Nam - Khảo sát hoạt tính gây độc tế. .. Kết thử hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập 14 hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ, kháng lao từ 03 chủng nghiên cứu (G246, G261 G248) thử hoạt tính gây độc tế bào với bốn dòng tế bào ung... tính mạnh hợp chất G24 6-2 , G24 6-6 , G24 8- 12, G24 8- 9 phân lập từ chủng Streptomyces sp (G246, G248) có vùng biển Đà Nẵng, Quảng Nam Đặc biệt hợp chất G24 6-2 , G24 8- 9, G24 8- 11, G24 8- 12 thể hoạt tính