2.5.6.1 Ph ng pháp đ i kháng gi a vi khu n n i sinh v̀ vi khu n gây b nh
Chúng tôi ti n hành th kh n ng kh́ng khu n b nh c a các ch ng vi khu n n i sinh th nghi m b ng ph ng ph́p khu ch tán gi ng th ch (Roy, 2011; Pati và cs., 2009).
Môi tr ng chu n b
- Môi tr ng NB và môi tr ng NA th nghi m đ c h p vô trùng 121oC trong 20 phút.
- Môi tr ng NA đ c đ vƠo đ a petri (đ ng kính 90 mm) v i th tích 20 mL.
Chu n b d ch vi khu n n i sinh th nghi m:
- Ch n 1 khu n l c đ n, c y t ng sinh vi sinh v t n i sinh vào 30 mL môi
tr ng NB, 32oC trong 5 ngày. Ti n hƠnh ly tơm môi tr ng nuôi c y 8000 vòng/ phút trong 8 phút, thu d ch khu n 4oC.
Chu n b d ch treo vi khu n gây b nh:
- Vi khu n th nghi m ho t tính: Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli.
- L y kho ng 5 khóm vi khu n ć đ ng ḱnh ≥ 1 mm trên đ a th ch đư đ c c y ho t hóa 18 – 24 gi đ pha thành d ch treo trong n c mu i sinh lý 0,85 %.
- Vortex d ch khu n trong 20 giơy. đ c c a huy n d ch vi khu n s đ c so sánh v i đ đ c chu n 0,5 McFarland d i n n gi y tr ng có k v ch
đen. đ c c a 0,5 McFarland t ng đ ng v i n ng đ vi khu n 1 - 2 x 108 t bào/ mL.
- Pha loãng 100 l n huy n dch ć đ đ c t ng đ ng đ đ c Mc Farland
n c mu i sinh ĺ đ đ c huy n d ch vi khu n có n ng đ 106 vi khu n/ mL.
Ti n hành th nghi m:
- Trong vòng 15 phút sau khi pha huy n d ch vi khu n gây b nh, d̀ng t m
bông vô trùng nhúng vào huy n d ch r i l y lên ́p vƠ xoay t m bông trên thành ng nghi m cho ŕo n c.
- Sau đ́ tr i đ u vi khu n, t que gòn lên m t th ch đư hong khô tr c đ́,
xoay m t th ch 60o r i tr i t ng t , ti p t c nh v y đ đ m b o tr i đ y
đ c vi khu n lên m t th ch.
- Khi m t th ch khô, ti n hƠnh đ c l th ch đ ng kính 6 mm b ng d ng c vô trùng.
- D ch vi khu n n i sinh đ c thêm vào trong m i gi ng th ch kho ng 100 µL. - yên kho ng 15 phút cho d ch vi khu n khu ch tán vào l p th ch.
- 37oC trong 18 đ n 24 gi r i đ c k t qu vòng kháng khu n. Thí nghi m
đ c b trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên v i 3 l n l p l i.
K t qu :
- Vi khu n th nghi m có kh n ng kh́ng vi khu n gây b nh khi xung quanh l có vòng kháng khu n.
Hình 2.2: K t qu vòng kháng khu n gây b nh
2.5.6.2 Ph ng pháp đ i kháng gi a vi khu n n i sinh v̀ vi n m gây b nh
Chúng tôi ti n hành th kh n ng kh́ng vi n m b nh c a các ch ng vi khu n n i sinh th nghi m b ng ph ng ph́p khu ch tán gi ng th ch. (Roy, 2011; Pati và cs., 2009).
Môi tr ng chu n b :
- Môi tr ng NB và PDA th nghi m đ c h p vô trùng 121oC trong 20 phút.
- PDA đ c đ vào đ a petri (đ ng kính 90 mm) v i th tích 20 mL.
Chu n b d ch vi khu n n i sinh th nghi m.
- Chu n b vi khu n đ c c y ria vào th ch NA, 24 gi 37oC.
- Ch n 1 khu n l c đ n, c y t ng sinh vi sinh v t n i sinh vào 30 mL môi
tr ng NB, 32oC trong 5 ngày. Ti n hƠnh ly tơm môi tr ng nuôi c y 8000 vòng/ phút trong 8 phút, thu d ch khu n 4oC.
Vòng kháng
Chu n b d ch treo vi n m: - N m men Candida albicans:
C y ria n m trên môi tr ng th ch sabouraud, 37oC trong 48 gi .
L y khu n l c riêng l c y vƠo môi tr ng Sabourard l ng, 24 gi 37oC.
o OD 600 nm đi u ch nh m t đ sao cho đ t trong kho ng t 0,08 – 0,1
t ng ng v i McFarland 0,5, m t đ t bƠo đ t 108 CFU/mL. N m đư chu n b c n đ c s d ng trong vòng 15 phút.
- Vi n m Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophyte
C y n m trên môi tr ng th ch Sabourard có b sung kháng sinh cloramphenicol 0,05% 30oC trong 7 ngày.
Cho vào ng n m 1 ́t n c mu i sinh lý 0,85% có ch a 0,05% Tween 80, dùng que c y c o nh trên m t khóm n m đ l y bào t .
o OD 530 nm đi u chnh sao cho đ t trong kho ng t 0,08 – 0,12 t ng đ ng v i m t đ t bào là 1 x 106 CFU/mL.
N m đư chu n b c n đ c s d ng trong vòng 15 phút.
Ti n hành th nghi m:
- Dùng que bông vô trùng nhúng vào d ch n m đư chu n b , ép que vào thành
ng cho ŕo n c, sau đ́ tr i đ u lên m t th ch. L p l i 3 l n, m i l n xoay h p 60o.
- c l đ ng kính 6 mm trong b n th ch b ng d ng c ti t trùng.
- D ch vi khu n n i sinh đ c thêm vào trong m i gi ng th ch kho ng 100 µL. - yên kho ng 15 phút cho d ch vi khu n khu ch tán vào l p th ch.
- 4 – 5 ngày 28oC r i xem k t qu vòng kháng n m.
- Thí nghi m đ c b trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên v i 3 l n l p l i.
K t qu :
Hình 2.3: K t qu vòng kháng 2.5.7 Ph ng ph́p th đ i kh́ng gi a vi n m n i sinh vƠ vi khu n, vi n m gơy b nh 2.5.7.1 Ph ng pháp th nghi m đ i kháng gi a vi n m n i sinh v̀ vi n m gây b nh x́c đ nh kh n ng kh́ng l i n m b nh c a các ch ng vi n m n i sinh phân l p đ c, chúng tôi ti n hành th nghi m b ng ph ng ph́p th nghi m kép. N m b nh và vi n m n i sinh đ c nuôi cách nhau 5 cm trên đ a môi tr ng PDA (đ ng
ḱnh 90 mm), ćch ḿp đ a Petri t 1 – 1,5 cm 27oC trong 6 ngày. (Chang, 2006) Vi n m n i sinh đ c ho t hóa và vi n m gây b nh đ c ho t hóa trên môi
tr ng PDA 37oC/3 ngày
Chu n b d ch n m b nh và n m n i sinh: ng n m gi ng đ c pha v i n c mu i sinh lý 0,85%, x́c đnh m t đ b ng bu ng đ m h ng c u và ti n hành pha loãng sau cho có d ch n m có m t đ là 2 x 106 CFU/ mL.
Hình 2.4: Cách b trí m u đ i kháng
Dùng pipetment hút 10 L d ch n m n i sinh và d ch n m b nh c y vào 2 v
tŕ ćch ḿp đ a petri ch a môi tr ng PDA 20 mm ( đ a peptri ć đ ng kính 90 mm) nh h̀nh 2.4.
Gi nhi t đ phòng trong th i gian 5 ngày. N u n m th nghi m có kh
n ng c ch s phát tri n c a n m gây b nh thì s th y vùng n m này không sinh
tr ng ho c vi n m th nghi m m c ch ng lên, c ch không cho vi n m gơy b nh ph́t tri n. N u vi n m th nghi m không có kh n ng c ch s phát tri n c a n m gây b nh thì s th y n m phát tri n b̀nh th ng.
Thí nghi m đ c th c hi n v i 3 l n l p l i, k t qu đ c x ĺ th ng kê ANOVA m t y u t b ng ph n m m Excel vƠ đ c tr̀nh bƠy d i d ng: trung b̀nh (%) ± sai s chu n SE (Standard Error).
Tính kháng n m gây h i m nh hay y u th hi n qua ph n tr m c ch .
Quan sát s phát tri n c a n m sau 5 ngƠy đo b́n ḱnh (mm) và tính ph n tr m
c ch theo công th c: I (%) = 琢怠貸琢態 琢怠 茅 などど% Trong đ́: I là ph n tr m c ch R1: bán kính n m gây b nh (đ i ch ng) R2: bán kính n m gây b nh (th nghi m kép) 5 cm
Vi khu n đ c xem nh ć kh n ng c ch n m khi I > 20 %. N u I < 20 %, vi khu n không có giá tr trong kh n ng kh́ng n m m c. (Orole và cs, 2009)
2.5.7.2 Ph ng pháp th nghi m đ i kháng gi a vi n m n i sinh v̀ vi khu n gây b nh
C y ch ng vi sinh v t n i sinh phân l p đ c trên môi tr ng PDA. 7-12 ngày nhi t đ ph̀ng. Sau đ́ đ c l trên khóm n m b ng d ng c đ c l đ ng kính 8mm.
Vi khu n gây b nh d̀ng đ th ho t t́nh đ c c y phân l p ra khu n l c thu n nh t (c y ria, 37oC /24 gi ). L y t 3 – 5 khóm khu n l c thu n nh t c a vi khu n cho vào môi tr ng TSB, 37oC/4 gi đ t ng sinh. Sau đ́, h́t d ch t ng sinh
c a vi khu n cho vƠo n c mu i sinh ĺ đ t vào máy quang ph k v i b c sóng 625 nm cho vi khu n và 530 nm cho vi n m. i u ch nh n ng đ vi khu n và n m vào kho ng OD = 0,08 – 0,12 (t ng đ ng 1-2.106 CFU/ml).
Tr i khu n và n m gây b nh lên m t th ch:
Trong vòng 15 phút sau khi pha huy n d ch (các l n c mu i sinh lý ch a vi khu n và vi n m gây b nh đư đo OD), l y 1 que gòn vô trùng nhúng vào huy n d ch, nh nhàng ép que gòn vào thành ng nghi m.
Tr i đ u vi khu n và vi n m gây b nh lên đ a th ch TSA đư đ c chu n b
tr c nh sau: d̀ng que g̀n đư th m vi khu n v ch trên đ a th ch theo 1 ph ng
nh t đ nh, sau đ́ quay đ a th ch 90o ti p t c v ch theo ph ng nh t đ nh, làm cho
đ n khi khu n đ c tr i đ u trên m t th ch. khô m t th ch.
t các khoanh n m đư c t 8mm lên đ a th ch đư tr i s n khu n. 37o C trong 24 gi .
c k t qu : n u vi n m cho ch t bi n d ng kháng khu n kháng n m thì ho t ch t này s khu ch t́n ra môi tr ng c ch vi khu n, vi n m gây b nh phát tri n t o thành vòng kháng xung quanh khoanh th ch n m. Kh n ng kh́ng c a ch t bi n d ng đ c đ́nh gí qua đ ng kính vòng kháng.
S đ 2.2: Quy trình th kháng khu n Gi ng vi khu n gây b nh
C y chuy n lên TSA
C y t ng sinh trên môi tr ng TSB
o OD = 0,08 – 0,12
(b c sóng 625nm)
Tr i khu n trên m t th ch
môi tr ng TSA
amôi tr ng TSA đư ć
d ch khu n
Quan śt, đo v̀ng kh́ng
khu n
Vi sinh v t n i sinh phân l p
C y chuy n trên môi
tr ng PDA, nuôi nhi t
đ phòng trong 7 – 12 ngày c l th ch n i ć n m m c. 370C/24 gi 37oC/4gi 37oC/ 24 gi
2.5.7.3 Ph ng pháp th nghi m đ i kháng gi a vi n m n i sinh v̀ n m men
Cadinda
C y ch ng vi n m n i sinh phân l p đ c trên môi tr ng PDA. 7 ngày nhi t đ ph̀ng. Sau đ́ đ c l trên khóm n m b ng d ng c đ c l đ ng kính 8 mm.
C y n m mend̀ng đ th ho t t́nh đ c c y phân l p ra khu n l c thu n nh t (c y ria, 37oC /24 gi ). L y t 3 – 5 khóm khu n l c thu n nh t c a vi khu n cho
vƠo môi tr ng PDB, 37oC/4 gi đ t ng sinh. Sau đ́, h́t d ch t ng sinh c a n m mencho vƠo n c mu i sinh ĺ đ t vào máy quang ph k v i b c sóng 625 nm cho vi khu n và 530 nm cho vi n m. i u ch nh n ng đ vi khu n và n m vào kho ng OD = 0,08 –0,12 (t ng đ ng 1-2,108 CFU/ mL).
Tr i d ch n m gây b nh lên m t th ch:
Trong vòng 15 phút sau khi pha huy n d ch (các l n c mu i sinh lý ch a vi khu n và vi n m gây b nh đư đo OD), l y 1 que gòn vô trùng nhúng vào huy n d ch, nh nhàng ép que gòn vào thành ng nghi m.
Tr i đ u d ch n m gây b nh lên đ a th ch PDA đư đ c chu n b tr c nh sau: d̀ng que g̀n đư th m vi khu n v ch trên đ a th ch theo 1 ph ng nh t đ nh,
sau đ́ quay đ a th ch 90o ti p t c v ch theo ph ng nh t đ nh, lƠm cho đ n khi khu n đ c tr i đ u trên m t th ch.
khô m t th ch.
t các khoanh n m đư c t 8 mm lên đ a th ch đư tr i s n khu n. 37o C trong 24 gi .
c k t qu : n u vi n m cho ch t bi n d ng kháng khu n kháng n m thì ho t ch t này s khu ch t́n ra môi tr ng c ch vi khu n, vi n m gây b nh phát tri n t o thành vòng kháng xung quanh khoanh th ch n m. Kh n ng kh́ng c a ch t bi n d ng đ c đ́nh gí qua đ ng kính vòng kháng.
2.5.8 nh danh vi khu n n i sinh ć ho t t́nh cao
Sau khi ti n hành các th nghi m trên chúng tôi ti n hƠnh đ nh danh các ch ng vi sinh v t n i sinh có ho t tính cao theo khóa phân lo i Cowan và Steel (Feltham
và Barrow, 1993), khóa phân lo i Bergey (1974), b ng các th nghi m sinh hóa (MacFaddin, 2000), (Tr n Linh Th c, 2006).
2.5.8.1 Nhu m Ảram
Nguyên t c
S khác nhau gi a vách t bào Gram (+) và Gram (-) làm cho kh n ng b t màu màng t bào v i thu c nhu m khác nhau gi a hai nhóm vi khu n. D a vƠo đ c
đi m nƠy ng i ta phân thành hai nhóm vi khu n. Ti n hƠnh đ c trình bày m c 2.5.5
2.5.8.2 Th nghi m catalase
Nguyên t c
Các vi sinh v t hi u khí và k kh́ t̀y ́ đ có enzym catalase (tr Streptococcus spp.). Catalase th y phân hydrogen peroxidase H2O2 thành H2O và O2. S th y phân hydrogen peroxidase s gi i phóng O2 đ c ghi nh n qua hi n
t ng s i b t khí, d a vƠo đ c t́nh nƠy đ th kh n ng sinh enzyme catalase c a vi khu n.
Ti n hành
Dùng que c y l y m t ít sinh kh i t khu n l c thu n đ t lên m t phi n kính s ch, nh m t gi t H2O2 5% lên sinh kh i vi sinh v t trên phi n kính và quan sát. Vi khu n sinh catalase s s i b t kh́, ng c l i không th y hi n t ng.
2.5.8.3 Th nghi m oxidase
Nguyên t c
Các lo i vi khu n hi u khí tuy t đ i có enzym oxydase (cytochrom oxydase). Có th phát hi n oxydase b ng cách s d ng thu c th là gi y t m N – Dimethel –
paraphenyldiamine. Ti n hành
- Dùng qua c y vòng l y vi khu n trong đ a vi khu n đư nuôi c y, ph t lên gi y t m thu c th . c k t qu trong vòng 30 giây – 1 phút.
- Ph n ng oxydase (+): gi y t m thu c th chuy n sang mƠu t́m đen.
2.5.8.4 Indol Nguyên t c
Tryptophan là m t acid amino có th b chuy n hóa thành d ng ch y u: indol, skatole ( methyl indol), acid indol acetic (IAA) b i enzym tryptophanase t vi sinh v t. C u trúc pyrrole c a indole s k t h p v i para-Dimethylamino-Benzaldehyde (DMABA) trong thu c th Kovacs’ t o thành h p ch t quinone ć mƠu t́m đ . Cách ti n hành
- C y vi khu n vƠo môi tr ng pepton l ng, 37oC/ 24 gi . Nh 5 gi t thu c th Kovacs’ tr c ti p vào canh c y. L c nh vƠ đ yên.
- ng (+): trong vài giây, l p ti p xúc gi a môi tr ng và thu c th chuy n
sang đ .
- ng (-): không đ i màu, ch có màu thu c th .
- ng (+/-): có màu cam trên b m t môi tr ng, đ́ là do skatole, là h p ch t