Sau khi ti n hành các th nghi m trên chúng tôi ti n hƠnh đ nh danh các ch ng vi sinh v t n i sinh có ho t tính cao theo khóa phân lo i Cowan và Steel (Feltham
và Barrow, 1993), khóa phân lo i Bergey (1974), b ng các th nghi m sinh hóa (MacFaddin, 2000), (Tr n Linh Th c, 2006).
2.5.8.1 Nhu m Ảram
Nguyên t c
S khác nhau gi a vách t bào Gram (+) và Gram (-) làm cho kh n ng b t màu màng t bào v i thu c nhu m khác nhau gi a hai nhóm vi khu n. D a vƠo đ c
đi m nƠy ng i ta phân thành hai nhóm vi khu n. Ti n hƠnh đ c trình bày m c 2.5.5
2.5.8.2 Th nghi m catalase
Nguyên t c
Các vi sinh v t hi u khí và k kh́ t̀y ́ đ có enzym catalase (tr Streptococcus spp.). Catalase th y phân hydrogen peroxidase H2O2 thành H2O và O2. S th y phân hydrogen peroxidase s gi i phóng O2 đ c ghi nh n qua hi n
t ng s i b t khí, d a vƠo đ c t́nh nƠy đ th kh n ng sinh enzyme catalase c a vi khu n.
Ti n hành
Dùng que c y l y m t ít sinh kh i t khu n l c thu n đ t lên m t phi n kính s ch, nh m t gi t H2O2 5% lên sinh kh i vi sinh v t trên phi n kính và quan sát. Vi khu n sinh catalase s s i b t kh́, ng c l i không th y hi n t ng.
2.5.8.3 Th nghi m oxidase
Nguyên t c
Các lo i vi khu n hi u khí tuy t đ i có enzym oxydase (cytochrom oxydase). Có th phát hi n oxydase b ng cách s d ng thu c th là gi y t m N – Dimethel –
paraphenyldiamine. Ti n hành
- Dùng qua c y vòng l y vi khu n trong đ a vi khu n đư nuôi c y, ph t lên gi y t m thu c th . c k t qu trong vòng 30 giây – 1 phút.
- Ph n ng oxydase (+): gi y t m thu c th chuy n sang mƠu t́m đen.
2.5.8.4 Indol Nguyên t c
Tryptophan là m t acid amino có th b chuy n hóa thành d ng ch y u: indol, skatole ( methyl indol), acid indol acetic (IAA) b i enzym tryptophanase t vi sinh v t. C u trúc pyrrole c a indole s k t h p v i para-Dimethylamino-Benzaldehyde (DMABA) trong thu c th Kovacs’ t o thành h p ch t quinone ć mƠu t́m đ . Cách ti n hành
- C y vi khu n vƠo môi tr ng pepton l ng, 37oC/ 24 gi . Nh 5 gi t thu c th Kovacs’ tr c ti p vào canh c y. L c nh vƠ đ yên.
- ng (+): trong vài giây, l p ti p xúc gi a môi tr ng và thu c th chuy n
sang đ .
- ng (-): không đ i màu, ch có màu thu c th .
- ng (+/-): có màu cam trên b m t môi tr ng, đ́ là do skatole, là h p ch t b metyle hóa, có th là ti n ch t c a indol.
- Trong tr ng h p ng (-) c n thêm 24 gi đ ki m tra l i. 2.5.8.5 Amylase
Nguyên t c
M t s vi sinh v t có kh n ng ti t ra enzym amylase có tác d ng phân gi i tinh b t thƠnh ćc đ ng đ n đ vi khu n d s d ng. Ph n ng nƠy đ c nh n bi t khi ta nh dung dch lugol vƠo môi tr ng th ch nuôi c y, n u trong môi tr ng có tinh b t th̀ môi tr ng s chuy n thƠnh mƠu xanh đ m. N u trong môi tr ng không còn tinh b t thì lugol s không làm chuy n mƠu môi tr ng.
Ti n hành
- Môi tr ng th ch dinh d ng b sung 0,4% tinh b t. - Ho t hóa ch ng vi sinh v t th nghi m 37oC/24 gi .
- D̀ng t m bông vô tr̀ng ch m d ch khu n lên đ a môi tr ng. - 37oC/24 gi . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nh lugol và xem k t qu . 2.5.8.6 Nitratase
Nguyên t c
M t s vi khu n có kh n ng s d ng ngu n nitratase làm ngu n hydro c
ch t
trong quá trình hô h p k kh́, đ ng th i s d ng ngu n nitratase nh ngu n
nit duy nh t, do kh n ng t ng h p enzym nitratreductase. Nitrate b kh thành nitrit r i có th b kh ti p thành NH3 ho c N2.
C ch ph n ng:
Acid sulfanilic không màu trong Gress A s k t h p v i nhóm NO2- t o thành mu i diazonium, acid sulfanilic b diazo hóa không màu ti p t c ph n ng v i - naphthylamine không màu t o thành h p ch t p-sulfobenzene-azo- -naphthylamine
ć mƠu đ . Tác nhân b i k m k t h p v i acid acetic trong thu c th s làm gi m
l ng mu i diazonium do p-sulfobenzene-azo- -naphthylamine k t h p v i acid
acetic, d i xúc tác c a b i k m t o ra arylhydrazine có màu. Cách ti n hành
- C y vi khu n vƠo môi tr ng th ch nitrate, 37oC/ 24 gi .
- Nh tr c ti p vƠo môi tr ng nuôi c y 2 gi t Gress A, 2 gi t Gress B. - ng (+): có màu h ng đ
- ng (±): không đ i màu
- M u th không đ i mƠu, ć 2 tr ng h p x y ra: - Tr ng h p 1: NO3- không chuy n thành NO2-.
- Tr ng h p 2: NO3- chuy n thành NO2- r i ti p t c chuy n thành NH3 hay N2.
- Ti p t c cho b t k m vƠo môi tr ng ph n ng: - ng (+): không đ i màu
- ng (-): xu t hi n mƠu đ . 2.5.8.7 Citratase
Nguyên t c
M t s vi sinh v t có enzym citrat permease có kh n ng s d ng citrat trong
lƠm pH môi tr ng gi m. ng th i nh ng vi sinh v t nƠy c ng ć kh n ng s
d ng mu i amonium vô c NH4H2PO4 làm ngu n nit , gi i phóng NH3 ra môi
tr ng làm ki m h́a môi tr ng, s thay đ i pH đ c nh n di n b ng ch th màu bromothymol blue có kho ng đ i pH t 6 – 7,6 t ng ng v i kho ng màu t vàng - xanh l c - xanh d ng.
Ti n hành
- C y vi khu n vƠo môi tr ng th ch nghiêng Simmon’s Citrat 37oC/ 24 gi . - ng (+): mƠu xanh d ng.
- ng (-): màu xanh l c. 2.5.8.8 Urease
Nguyên t c
Vài loài vi khu n có kh n ng t ng h p enzym urease do đ́ ć kh n ng phơn
gi i urê thành NH3, lƠm t ng pH môi tr ng, đ c nh n di n b ng ch th màu phenolred có kho ng đ i pH 6,8 - 8,2 t ng ng v i kho ng đ i màu t vàng - đ . Ti n hành
- C y vi khu n trên môi tr ng Christensen’s Urea 37oC/ 24 gi . - ng (+): môi tr ng t h ng chuy n sang đ cánh sen. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- ng (-): môi tr ng không đ i màu. 2.5.8.9 Voges – Proskauer (VP) Nguyên t c
Th nghi m Voges-Proskauer d a trên s phát hi n acetoin, là s n ph m bi n
d ng cu i cùng t glucose.
Glucose th y phân thành s n ph m trung gian là acid pyruvic. T acid pyruvic, vi khu n s chuy n hóa ti p theo nhi u con đ ng kh́c nhau, trong đ́ m t s vi khu n s chuy n hóa ti p t c con đ ng t o thành acetoin, là ti n s n ph m c a 2,3-butanediol.
C ch ph n ng c a th nghi m VP (+):
- Glucose lên men t o acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC). - AMC + -naphtol , KOH và oxy không khí (l c) Diacetyl.
- Diacetyl + nhơn guanidine trong pepton t o màu h ng đ .
- Màu c a ph n ng xu t hi n sau 2-5 ph́t vƠ đ m nh t sau 30 phút –
1gi , và m t màu n u đ lơu h n n a.
- Th nghi m VP trên môi tr ng canh MR-VP, thu c th s d ng là -naphtol 5%, KOH 40%.
Cách ti n hành
- C y vi khu n vƠo môi tr ng, 37oC/ 24 gi . Nh tr c ti p 0,6 mL - naphtol và 0,2 mL KOH, l c đ u trong 30 giây.
- ng (+): màu h ng đ trên b m t. - ng (-): màu vàng c a thu c th . 2.5.8.10 Các th nghi m lên men đ ng
Nguyên t c
Vi khu n s d ng ngu n đ ng s chuy n hóa thành acid pyruvic làm pH môi
tr ng gi m, quan sát s thay đ i pH c a môi tr ng d a vào ch th màu phenolred v i kho ng đ i màu 6,6 –8 t ng ng t vàng –đ .
Ti n hành
- C y vi khu n vƠo môi tr ng lên men đ ng c n kh o sát, 37oC/24 gi . - ng (+): màu vàng
- ng (-): màu h ng đ n đ
2.5.8.11 Kh n ng phát tri n 10% NaCl
Nguyên t c
Th nghi m ch u đ ng mu i s d ng môi tr ng TSB (Trypticase Soy Broth), b sung NaCl đ t o ra môi tr ng có n ng đ mu i 10%. Môi tr ng nƠy d̀ng đ
th nghi m kh n ng t n t i c a vi sinh v t trong môi tr ng có n ng đ mu i cao. M t s ch ng Bacillus có kh n ng ph́t tri n đi u ki n 10% NaCl, do đ́, th
nghi m này góp ph n đnh danh vi khu n. Ti n hành
C y vi khu n v a đ c ho t hóa kho ng 18 – 24 gi vƠo môi tr ng TSB b sung 10% NaCl, nuôi c y 37oC/24 gi . Kh n ng ph́t tri n th hi n qua kh n ng
m c đ c, lƠm đ c môi tr ng nuôi c y.
2.5.8.12 Kh n ng phát tri n 50oC, 41oC, 4oC
C y vi khu n v a đ c ho t hóa kho ng 18 – 24 gi vƠo môi tr ng TSB, nuôi c y đi u ki n nhi t đ 55oC. Kh n ng ph́t tri n th hi n qua kh n ng m c
đ c, lƠm đ c môi tr ng nuôi c y.
2.5.8.13 Ki m tra kh n ng phát tri n đi u ki n k kh́ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên t c
N u là nhóm vi khu n hi u khí, nó ch có kh n ng t ng tr ng trên b m t
môi tr ng.
N u là nhóm k khí tuy t đ i, ch m c đ c ph n đ́y c a ng th ch sâu. N u m c đ c toàn b ng môi tr ng th ch sâu, là nhóm vi khu n k khí tùy nghi.
D ch khu n th nghi m:
- D ch khu n kh o śt đ t n ng đ 108 CFU/ mL. Pha d ch khu n th nghi m và so sánh v i ng ć đ đ c chu n 0,5 McFarland.
- Cách pha dung d ch chu n đ đ c 0,5 McFarland.
- chu n m c h́a đ đ c c a vi khu n th nghi m ph i đ t n ng đ 108 t bào/mL, nên dùng huy n d ch BaSO4 t ng đ ng đ đ c 0,5 McFarland hay m t huy n d ch t ng đ ng b ng m t th ng (huy n d ch latex).
- Pha đ đ c chu n d a trên nguyên t c ph n ng gi a: H2SO4 + BaCl2 BaSO4 + 2HCl
- Hút 9,9 mL H2SO4 và 0,1 mL BaCl2 t ng ng v i 3 x 108 t bƠo/mL. ng đ c chu n 0,5 McFarland ć đ đ c t ng đ ng v i s l ng vi khu n là 108 t bào/mL ta ti p t c pha loãng. Dùng ng nghi m này l c đ u, hút l y 4 mL pha vào 8
mL n c c t vô khu n, tr n đ u, b 2 mL, đ y kín. L y ng này làm ng đ c chu n 0,5 McFarland.
- Sau khi pha huy n d ch vi khu n, dùng micropipette hút 100 µL d ch khu n vào ng môi tr ng th ch sâu, đem vortex. 37oC/24 gi .
- N u khu n l c vi khu n ch m c b m t ng môi tr ng vi khu n hi u khí.
- N u khu n l c vi khu n m c ph n đ́y ng nghi m vi khu n k khí tuy t đ i.
- N u khu n l c vi khu n v a m c b m t môi tr ng v a m c d c theo ng
môi tr ng th ch sơu k khí tùy nghi.
2.5.8.14 Kh n ng khu ch tán hu nh quan m̀u v̀ng trên môi tr ng
Pseudomonas F Nguyên t c
Các ch ng Pseudomonas có kh n ng ti t sác t pyoverdine phát hu nh quang khu ch tán trong th ch d c theo đ ng c y.
Ti n hành
C y vi khu n vào môi tr ng Pseudomonas F, 25oC trong 3 ngày. Quan sát kh n ng ph́t hu nh quan d i tia UV (260 mm).
2.5.8.15 Không phát hu nh quan và sinh s c t t m̀u xanh lam trên môi tr ng Pseudomonas P.
Nguyên t c
Các ch ng Pseudomonas có kh n ng ti t sác t pyocianine khu ch tán trong th ch d c theo đ ng c y. c bi t ch ng Pseudomonas aeruginosa có kh n ng
khu ch tán s c t xanh lam đ c tr ng. Ti n hành
C y vi khu n vƠo môi tr ng Pseudomonas P, 25oC trong 3 ngày. Quan sát kh n ng ph́t hu nh quan d i tia UV (260 mm).
2.5.8.16 Th nghi m Lecthinase Nguyên t c
Trong môi tr ng có lithium choloride và telluride c ch s phát tri n c a các vi khu n đi kèm. Trong môi tr ng d ch tr ng đ c vi khu n có kh n ng ti t ra enzym lecthinase phân gi i protein trong môi tr ng t o ra vòng sáng.
Ti n hành
C y vi khu n th nghi m vƠo môi tr ng Baird- Parker có b xung d ch tr ng và telluride, 24h vƠ đ c k t qu . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});